Name: Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez la décellularisation homogène de foies de rats par perfusion artérielle sous pression oscillante. Cette méthode optimise la préparation de matrices hépatiques pour la médecine régénérative et l'ingénierie tissulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier chaleureusement Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens et Katharina Struecker pour leur aide au cours de ce projet.

Les animaux ont été maintenus à la Facilité pour la médecine expérimentale (FEM, Charité, Berlin, Allemagne), et tous les protocoles expérimentaux ont été examinées et approuvées par l&#39;Office d&#39;Etat de la Santé et des Affaires locales (LAGeSo, Berlin, Allemagne;. Reg n ° O 0365 / 11). 1. Foie récolte <ol><li> Préparation pré-opératoire <ol><li> Utilisez une plaque de liège pour la fixation. Mettez un drap médicale sur la plaque. En utilisant quatre aiguilles, fixer un masque d&#39;inhalation sur la plaque de liège pour peropératoire inhalation narcose. </li></ol></li><li> Prédisposition du Portail veineuse canule <ol><li> Connecter un cathéter veineux périphérique (G 20) pour un robinet d&#39;arrêt à trois voies. Cathéter veineux doit être coupé obliquement, avec une longueur d&#39;env. 1,5 cm. </li><li> De l&#39;air le système en utilisant une seringue de 10 ml remplie de solution de Ringer. Il est très important de bien désaérer parce embolie gazeuse peut affecter négativement la décellularisation de perfusion. </li></ol></li><li> Prédispositionde la canule artérielle <ol><li> Utilisez une canule papillon et couper l&#39;aiguille à une longueur de 5 mm. Monter un tube de 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0,96 mm) à l&#39;aiguille de 5 mm et la fixer avec de la colle. Insérez un tube de 2 cm de long (ID 0,28 mm; OD 0,61 mm) dans le plus grand tube et le fixer avec de la colle. </li><li> Glissez un autre tube sur cette construction comme une butée et le fixer avec de la colle. De l&#39;air de la canule artérielle avec une seringue de 5 ml rempli d&#39;une solution de Ringer. </li></ol></li><li> Anesthésie et l&#39;analgésie <ol><li> Induire une narcose du rat dans la chambre d&#39;induction de l&#39;anesthésie par 3,5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène à un débit de 1,5 L / min. </li><li> Pour assurer une analgésie sécuritaire pendant l&#39;opération, injecter metamizol (100 mg / kg de masse corporelle) et la kétamine à faible dose / médétomidine (10 mg / 0,1 mg par kg de masse corporelle) par voie intrapéritonéale. </li><li> Fournir 1,5% d&#39;isoflurane dans 1 L / min d&#39;oxygène via le masque d&#39;inhalation pour l&#39;entretien ultérieur de l&#39;anesthésie chirurgicale. </li></ol></li><li> Arrangements préopératoires &lt;ol&gt; <li> Raser l&#39;abdomen généreusement avec une cisaille électrique. Humidifier le site de l&#39;incision de l&#39;abdomen rasé de l&#39;éthanol à 70% pour la désinfection. </li><li> Placez l&#39;animal dans la position couchée sur la plaque préparée, insérer la tête dans le masque d&#39;inhalation et de fixer les branches avec du ruban adhésif médical et broches. Enlever l&#39;excès de l&#39;éthanol et de la fourrure avec une compresse de gaze. </li></ol></li><li> Évaluation de l&#39;anesthésie <ol><li> Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie en observant la fréquence respiratoire. Lorsque l&#39;anesthésie semble assez profond (40-60 respirations / min), vérifier si l&#39;analgésie est suffisante en essayant de déclencher le réflexe orteil pincée aide de pinces chirurgicales de pincer la peau entre les orteils des deux membres postérieurs. </li></ol></li><li> Approche abdominale <ol><li> Faire une incision médiane dans la paroi abdominale caudale dessus de la vessie. Couper de ce point à deux arches latérales côtières dans une forme de V. Prenez soin de ne pas couper dans le diaphragme. Tirez sur la paroi abdominale couper sur la poitrine. </li&gt; <li> Fixer la pointe du sternum avec une pince de Overholt, tirez-crânienne et le fixer avec une bande de caoutchouc. Utilisez des cotons-tiges humides d&#39;évacuer l&#39;intestin. Enveloppez l&#39;intestin dans un bandage de gaze humide. En outre, couvrir toutes les marges abdominaux avec une compresse humide. </li></ol></li><li> Préparation du foie <ol><li> Disséquer le ligament falciforme. Utilisez un pansement de gaze humide pour maintenir les lobes du foie médiales et gauche crânialement sous le dôme du diaphragme. Exposer le pédicule hépatique et l&#39;omental lobe du foie supérieure. </li><li> Utilisez deux microforceps et ciseaux à ressort à disséquer soigneusement le ligament attaché au lobe omental supérieure jusqu&#39;à ce que le lobe est mobile. Déplacez le lobe utilisant des cotons-tiges humides sous la compresse de gaze, tenant les lobes médian et gauche en place. </li><li> Après la mobilisation de l&#39;omental lobe hépatique supérieure, déplacer l&#39;estomac vers la gauche. Fixer l&#39;estomac avec une pince et de disséquer l&#39;épiploon mineur avec microforceps et les ciseaux à ressort. </li><li> Mobiliser l&#39;omenta inférieurel de lobe de foie jusqu&#39;à ce qu&#39;il est mobile et se déplacer ensuite le lobe de retour dans sa cavité. Utilisez une pince Backhaus de conserver le duodénum. Déplacez le duodénum vers la gauche pour étirer et exposer le pédicule hépatique. Circonscrire le canal cholédoque dans le ligament hépato étiré. </li><li> On dissèque la voie biliaire principale du tissu adipeux et du pancréas. Couper le canal biliaire 1,5 cm de la bifurcation de la voie biliaire. Disséquer la veine porte du tissu adipeux environnant. Exposer la veine gastro-duodénale. </li><li> Ligaturer la veine gastro deux fois avec de la soie 6-0 et diviser la veine entre les deux ligatures. Disséquer le tronc coeliaque et l&#39;artère hépatique commune du tissu environnant jusqu&#39;à ce que tous rami artérielle sont révélés. </li><li> Libérer l&#39;artère gastro-duodénale du tissu environnant. Attachez l&#39;artère gastro-duodénale deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignés les uns des autres. Disséquer l&#39;artère gastro-duodénale entre les deux ligatures. </li><li> Libérer l&#39;artère spléniquedu tissu environnant. Attachez l&#39;artère splénique deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignées l&#39;une de l&#39;autre. Disséquer l&#39;artère splénique entre les deux ligatures. </li><li> Libérer l&#39;artère gastrique gauche du tissu environnant. Attachez l&#39;artère gastrique gauche deux fois avec de la soie 6-0, avec les liens éloignés les uns des autres. Disséquer l&#39;artère entre les deux ligatures. </li><li> Circonscrire la veine cave inférieure entre le rein droit et le lobe droit du foie latérale. Disséquer la veine de l&#39;espace rétro-péritonéal. Exposer l&#39;aorte en suivant le tronc cœliaque. </li><li> Disséquer le tissu adipeux rétropéritonéale. Injecter 1,000 IE héparine dans 1 ml de sérum physiologique dans la veine cave inférieure. Rétracter la canule et fermer l&#39;incision avec un tampon de coton. Attendez 1-2 min de l&#39;effet systémique de l&#39;héparine. </li><li> Circonscrire l&#39;aorte avec une pince. Disséquer l&#39;aorte et être exsangue le rat. En outre, disséquer la veine cave inférieure de manière distale depuis le rein. </li></ol></li><li> Portail veineuse Canulation (utilisation de la canule préparé dans la section 1.2) <ol><li> Faire une incision poissons-bouche dans la veine distale. Ouvrez l&#39;incision avec une pince et cathétériser la veine porte. Rincez le foie avec 20 ml de solution de Ringer jusqu&#39;à ce que les décolore hépatiques et fixer la canule avec ligatures (soie 6-0). </li></ol></li><li> Arterial Canulation (utilisation de la canule préparé dans la section 1.3) <ol><li> Disséquer l&#39;aorte au-dessus du tronc cœliaque. Libérer le segment de l&#39;aorte de l&#39;espace rétro-péritonéal. Couper le segment de l&#39;aorte longitudinalement pour générer un correctif aortique. Insérez la canule construit soi-même dans un support statique. </li><li> Utilisez 2 pinces à glisser le patch aortique au cours de la canule. Ligaturer l&#39;artère hépatique avec de la soie 6-0 sur la canule et fixer le patch à la butée. </li></ol></li><li> Foie explantation <ol><li> Ouvrez le diaphragme, faire une incision circulaire et de disséquer le foie contre les structures environnantes. </li></ol></li><li> Stockage <ol><li> Store le foie dans un réservoir de 500 ml stérile rempli de 350 ml de solution de Ringer jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 2. détergents Solutions <ol><li> Solution à 10% de Triton X-100 actions <ol><li> Remplissez une bouteille de 1000 ml avec 900 ml d&#39;eau distillée. et ajouter 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Utilisation d&#39;un agitateur pour dissoudre le Triton X-100. Remplir la bouteille avec de l&#39;eau distillée. jusqu&#39;à un volume total de 1000 ml soit atteinte. </li></ol></li><li> 1% de Triton X-100 <ol><li> Ajouter 100 ml de la solution mère (10%) pour une bouteille de 1000 ml. Ajouter 900 ml d&#39;eau distillée. et secouer deux fois la bouteille. Filtrer la solution à 1% de Triton X-100 à travers un filtre stérile. </li></ol></li><li> 10% de SDS Stock Solution <ol><li> Remplissez une bouteille de 1000 ml avec 900 ml d&#39;eau distillée. et d&#39;ajouter 66,99 g SDS (99,9%, la densité de 0,67). Utiliser un agitateur pour dissoudre le SDS. Remplir la bouteille avec de l&#39;eau distillée. jusqu&#39;à un volume total de 1000 ml soit atteinte. </li></ol></li><li> 1% de SDS <ol><li> Ajouter 100 ml de la solution mère (10%) à un 1000 ml botTLE. Ajouter 900 ml d&#39;eau distillée. et secouer deux fois la bouteille. Filtrer la solution à 1% de SDS à travers un filtre stérile. </li></ol></li></ol> 3. Décellularisation <ol><li> Set-up de perfusion périphérique <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figure 1:. Schéma de l&#39;appareil de perfusion pour l&#39;artériopathie sélective et Portal veineuse perfusion des Quatre Rat Livers sous oscillants Conditions de pression (. Modifié depuis Struecker et al 14) <ol><li> Relier le drain à un robinet à trois voies et une extension Heidelberger pour réguler le niveau de remplissage et remplir le réacteur avec 500 ml de NaCl 0,9%. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figure 2:. Schéma de la perfusion set-up Lier la chambre de perfusion (1400 cm 3) (1) à l&#39;extrémité distale (4) du piège à bulles (5) via l&#39;accès veineux portal (2) ou via l&#39;ac artérielleprocessus (3). Le piège à bulles (5) doit être équipé d&#39;une obturation (4) à l&#39;extrémité distale et un évent (6). Branchez le piège à bulles (5) à une extension Heidelberger (7). Liez l&#39;extension Heidelberger au segment de pompe (8). En outre, connecter le segment de pompe (8) à un autre poste Heidelberger (9). Insérez la dernière prorogation Heidelberger (9) dans le flacon de solution de détergent (10). Connecter le respirateur (11) à la chambre de perfusion (ou de la distribution de pression dans le cas des perfusions multiples). Pour drainer les fluides de réacteurs, connectez la sortie à la bouteille de déchets (12). <ol><li> Insérez le segment de pompe dans la pompe. Démarrer la pompe pour combler le cycle avec du PBS, fermer l&#39;extrémité distale de la piège à bulles et d&#39;ouvrir l&#39;évent. Lorsque le fond de la bulle est bien couvert avec du PBS (2-3 cm), fermez l&#39;évent et ouvrir l&#39;extrémité distale de la piège à bulles. </li><li> Foie Installation <ol><li> Liez le robinet à trois voies de la canule de la veine à l&#39;accès du réacteur connexe. Connect la canule artérielle à l&#39;accès artériel. Veillez à ce que l&#39;air ne pénètre dans les systèmes. </li></ol></li><li> Application de oscillantes Conditions de pression <ol><li> Utiliser un respirateur avec une fréquence de 15 battements par minute et une amplitude de 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Connectez le respirateur à la chambre de répartition de la pression et de relier la chambre du réacteur. Lancement de l&#39;application de la pression. </li></ol></li><li> Protocole de Décellularisation <ol><li> Effectuer les étapes de perfusion avec un débit de 5 ml / min de débit. Lancer la décellularisation de la perfusion du foie avec 1% de Triton X-100 pendant 90 min. Autoriser déchets effluents via la sortie du dispositif de perfusion pour maintenir le niveau du liquide à l&#39;intérieur de la constante de la chambre de perfusion et du foie perfusé. Après 90 min, changer le détergent à 1% de SDS. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figure 3: Protocole de perfusion pour tous les groupes expérimentaux.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que la technique présentée pour la récolte de foie de rat et décellularisation est facilement reproductible, il ya certaines étapes critiques à prendre en considération: Lors de la préparation pour la récolte du foie, il est important d&#39;éviter une hémorragie sévère, car il va activer la coagulation du sang et peut conduire à la formation d&#39;un caillot sanguin dans le foie. À notre avis, il est avantageux d&#39;inciser l&#39;aorte abdominale directement devant une canule dans la v...

Décellularisation et recellularization peuvent permettre la génération d&#39;organes transplantables, fonctionnels in vitro 1. En éliminant les cellules et du matériel antigénique (par ex., ADN, des epitopes a-Gal) à partir d&#39;un organe, la matrice extracellulaire non immunogène ou moins (ECM) peut être obtenu. Cette matrice conserve la microanatomie trois dimensions d&#39;un organe et peut servir de biomatrice idéal pour le repeuplement de cellules d&#39;une autre, l&#39;origine xénogénique peut-être deux. Ainsi, une matrice de foie de rat décellularisé peut être repeuplée avec des cellules de foie humain. Ce micro-foie humanisé pourrait servir de modèle ex vivo pour la recherche sur les maladies (par exemple, des maladies métaboliques. Innées, les maladies virales ou malignes) ou pour les tests pharmaceutique préclinique 3. Plusieurs protocoles différents pour le foie de rat perfusion décellularisation ont déjà été publiés 4-13. Dans tous les protocoles, decellularsation a été réalisée par perfusion de détergents ioniques ou non ioniques alcalins via la veine canulée. Pour le meilleur de nos connaissances, nous étions le premier groupe à signaler rat décellularisation du foie par perfusion sélective via la veine porte et / ou le rat de l&#39;artère hépatique 14. Activation de la perfusion sélective des différents systèmes vasculaires dans le foie peut permettre de meilleurs résultats de décellularisation et, en outre, peut jouer un rôle important dans repeuplement cellulaire. Dans l&#39;étude détaillée ici, foies ont été perfusés dans un dispositif de perfusion exclusive sur mesure, permettant perfusion dans des conditions de pression oscillants. Ces conditions de pression imitent la perfusion respiratoire dépendant physiologique du foie: in situ, le foie se suspend sous la copule de la membrane, dont le mouvement lors de la respiration a un impact direct sur ​​la perfusion du foie. Inspiration conduit spécifiquement à l&#39;abaissement du diaphragme et pressant du foie, en optimisanthépato-veineuse sortie, tandis expiration conduit à l&#39;élévation du foie et de l&#39;abaissement de la pression intra-abdominale d&#39;optimiser afflux portail 15-veineuse. Notre objectif était d&#39;évaluer si oscillant conditions de pression ont un impact sur ​​l&#39;homogénéité de foie de rat perfusion décellularisation en imitant les conditions intra-abdominales ex vivo. L&#39;homogénéité du processus de décellularisation peut être un facteur sous-estimé dans la perfusion décellularisation. Tous les agents connus utilisés pour décellularisation de provoquer des altérations du foie à l&#39;ECM. Les cellules dans les zones mal perfusés restent dans l&#39;ECM, alors que d&#39;autres zones sont déjà complètement décellularisée. Pour dissoudre les cellules restantes, la durée de perfusion ou de pression doivent être élevés, causant plus de modifications dans les zones bien irrigués. Ainsi, les détergents pour décellularisation devraient être distribués de manière homogène au sein de l&#39;organe.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Canule artérielle auto-construite</td></tr><tr><td>&nbsp ; Portex Tube en polyéthylène non stérile</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0,28 mm ID 0,61 mm OD</td></tr><tr><td>&nbsp ; Portex Tube en polyéthylène non stérile</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0,58 mm ID 0,96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe Cathéter papillon</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4"> canule veineuse porte</td></tr><tr><td>Cathéter veineux</td><td>périphérique BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à trois voies</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">chirurgie</td></tr><tr><td>Bâtonnets de coton</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotons&nbsp ;</td><td>Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Bandage de gaze</td><td>Hubei Haige&nbsp ; Instruments Médicaux</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Seringue</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Seringue</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>champ médical</td><td>Shaoxing Zhengde Pansement chirurgical</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">chirurgical porte-aiguilles pour instruments</td></tr><tr><td></td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-pince</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-ciseaux</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-pince</td><td>S& T&nbsp ;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>Pince</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux</td><td>F S T&nbsp ;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>pince chirurgicale</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>Respirateur</td> de décellularisation <td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Dispositif de perfusion</td><td>Charite, laboratoire de génie médical</td><td>dispositif sur mesure</td> dispositif de <td>décellularisation</td></tr><tr><td>pompe péristaltique ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp ;</td><td>4 canaux</td></tr><tr><td>Hélidelberger rallonge 75 cm&nbsp ;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA segment</td><td>de pompe IDEX</td><td>IS 3510&nbsp ;</td><td>MS/CA/click’n’go/POM-C</td></tr><tr><td>CA Tube à 2 bouchons</td><td>Piège</td> à bulles Pharmed <td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td></td><td>article</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Raccord de tuyau Luer Lock</td><td>Neolab</td><td>n° 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Détergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>CN30.4&nbsp ;</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>3051.1&nbsp ;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">coloration</td></tr><tr><td>Eosin 1 %</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hématoxyline</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>coloration gomori</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>coloration AlcainBlue-PAS</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procédure pour décellularisation du rat livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

La décellularisation et la recellularisation des organes parenchymateux peuvent permettre la génération d’organes fonctionnels in vitro, et plusieurs protocoles de décellularisation du foie de rongeurs ont déjà été publiés. Nous avons cherché à améliorer le processus de décellularisation en construisant un dispositif de perfusion exclusif permettant une perfusion sélective via la veine porte et/ou l’artère hépatique. De plus, nous avons cherché à effectuer une perfusion dans des conditions de pression environnante oscillante pour améliorer l’homogénéité de la décellularisation. L’homogénéité de la décellularisation par perfusion a été un facteur sous-estimé jusqu’à présent. Pendant la décellularisation, les zones de l’organe qui sont mal perfusées peuvent encore contenir des cellules, tandis que la matrice extracellulaire (MEC) dans les zones bien irfusées peut déjà être affectée par les détergents alcalins. Les changements de pression oscillatoires peuvent imiter les changements de pression intra-abdominale qui se produisent pendant la respiration pour optimiser la microperfusion à l’intérieur du foie. Dans l’étude présentée ici, des matrices hépatiques de rat décellularisées ont été analysées par coloration histologique, analyse du contenu en ADN et moulage par corrosion. La perfusion via l’artère hépatique a montré des résultats plus homogènes que la perfusion veineuse porte. L’application de conditions de pression oscillante a amélioré l’efficacité de la décellularisation par perfusion. Les foies perfusés par l’artère hépatique et dans des conditions de pression oscillante ont montré les meilleurs résultats. Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.

L&#39;homogénéité et donc l&#39;efficacité des différents protocoles de décellularisation ont été évalués par observation macroscopique, l&#39;analyse histologique et l&#39;analyse de la teneur en ADN restant à l&#39;intérieur des matrices de foie décellularisés. En outre, la corrosion coulée a été effectuée pour visualiser le microanatomie intacte du foie après décellularisation. Macroscopie Pendant décellularisation, foies deviennent lucent, indiquant le retrai...

Les techniques présentées pour le prélèvement du foie, la canulation et la perfusion à l’aide de notre dispositif exclusif permettent des configurations de perfusion sophistiquées pour améliorer les expériences de décellularisation et de recellularisation dans les foies de rats.

Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer le rôle de la racine de perfusion dans l'optimisation de l'homogénéité de la décellularisation par perfusion du foie de rat. Cela est réalisé en cannulant d'abord les veines porte et les artères hépatiques de foies de rat fraîchement isolés. Dans un deuxième temps, les foies sont connectés à un dispositif de perfusion permettant la perfusion sélective des veines porte ou des artères hépatiques.Ensuite, des variations de pression oscillantes sont appliquées à la chambre de perfusion afin de simuler les variations de pression intra-abdominale qui surviennent pendant la respiration. En optimisant la microperfusion hépatique, les foies perfusés par l'artère hépatique dans des conditions de pression oscillante présentent une décellularisation plus homogène et plus rapide, comme évalué par l'observation macroscopique ainsi que par des analyses histologiques et biochimiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la décellularisation par perfusion veineuse portale, est que la perfusion artérielle réalisée dans des conditions de pression oscillante conduit à un résultat de décellularisation plus homogène.En un temps plus court, cette méthode peut toutefois fournir des informations sur les techniques de décélération. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les expériences de ressolarisation, les dispositifs de perfusion extrabuccale et les modèles d'organes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la récolte et la canulation artérielle des foies rouges peuvent être complexes.Avant de prélever le foie, effectuez une incision oblique à l'extrémité d'un morceau de 1,5 centimètre d'un cathéter veineux périphérique G 20. Connectez le cathéter à un robinet en té et utilisez une seringue de 10 millilitres remplie de solution de Ringer pour débarrasser le système de l'air. Ensuite, coupez l'aiguille d'une canule en aile à une longueur de cinq millimètres et utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer un tube de cinq centimètres à l'aiguille.Insérez un tube de deux centimètres de long dans le tube plus grand, et fixez ce tube également avec de la colle super glue. Glissez un autre tube par-dessus cette construction et collez-le en place afin de créer un butoir. Ensuite, utilisez une seringue de cinq millilitres remplie de solution de Ringer pour décanuler la canule artérielle nouvellement construite afin de préparer le foie au prélèvement.Commencez par utiliser un pansement humide pour maintenir les lobes médial et gauche du foie d'un rat adulte anesthésié sous la voûte du diaphragme. Exposez à ce moment le ligament hépatoduodénal et le lobe hépatique supérieur. Ensuite, utilisez deux micro-forceps et des ciseaux à ressort pour disséquer soigneusement le ligament attaché au lobe omental supérieur jusqu'à ce que le lobe soit mobile.Ensuite, maintenir les lobes médial et gauche en place. Utiliser des cotons-tiges humides pour déplacer le lobe sous la compression du GRE et l'estomac vers la gauche de l'animal. Fixer l'estomac à l'aide d'une pince et disséquer le petit omentum.Ensuite, disséquer le lobe hépatique inférieur ou médian jusqu'à ce qu'il soit mobile, puis replacer le lobe dans sa cavité à l'aide d'une pince de Backhouse afin de maintenir le duodénum ; déplacer le duodénum vers la gauche pour exposer le ligament hépato-duodénal, entourant le canal cholédoque. Puis disséquer le canal biliaire des tissus adipeux et pancréatiques, en sectionnant le canal à 1,5 centimètre de la bifurcation du canal biliaire.Disséquer la veine splénique du tissu adipeux environnant afin d'exposer la veine gastro-duodénale. Ensuite, ligaturer la veine gastro-duodénale deux fois avec des fils 6-0 et sectionner la veine entre les deux nœuds. Disséquer le tronc cœliaque et l'artère hépatique commune du tissu environnant jusqu'à ce que tous les rameaux artériels soient mis à nu.Une fois toutes les artères disséquées, délimiter la veine cave inférieure entre le rein droit et le lobe hépatique latéral droit, puis disséquer la veine de l'espace rétropéritonéal. Suivre le tronc cœliaque afin d'exposer l'aorte. Ensuite, disséquer le tissu adipeux rétropéritonéal et délimiter l'aorte au-dessus du tronc cœliaque.Injectez maintenant 1000 unités d'héparine dans un millilitre de solution saline dans la veine cave inférieure. Recouvrez l'incision avec un tampon de coton et attendez une à deux minutes pour que l'héparine fasse effet. Ensuite, entourez l'aorte avec une pince et disséquez l'aorte et la veine cave inférieure en direction distale par rapport au rein.Pour placer la canule veineuse porte, réalisez une incision en forme de bouche de poisson dans la veine porte distale et écartez l'incision à l’aide d’une pince. Ensuite, canulez la veine porte et rincez le foie avec 20 millilitres de solution de Ringer jusqu’à ce que le foie se décolore. Utilisez des ligatures en soie 6-0 pour fixer la canule en place. Pour placer la canule artérielle, disséquez l’aorte au-dessus du tronc cœliaque jusqu’à ce que le segment d’aorte puisse être libéré de l’espace rétropéritonéal.Couper le segment d'aorte longitudinalement pour obtenir un patch aortique et insérer la canule autoconstruite dans un support statique. Ensuite, utiliser deux pinces pour faire glisser le patch aortique sur la canule et ligaturer l'artère hépatique avec un fil de soie 6/0 par-dessus la canule. Fixer le patch au niveau de l'aboutement afin d'effectuer la décellularisation. Relier le robinet en té sur la canule de la veine porte à l'orifice correspondant du réacteur et connecter la canule artérielle à l'orifice artériel en veillant à ce qu'aucun air n'entre dans le système.Ensuite, connectez le respirateur à la chambre de répartition de la pression et reliez la chambre au réacteur. Démarrez l'application de la pression. Puis commencez la décellularisation.Fusionnez le foie avec 1 % de Triton X-100 à un débit de cinq millilitres par minute. Permettez à l'effluent de s'écouler par la sortie du dispositif de perfusion afin de maintenir le niveau de fluide à l'intérieur de la chambre de perfusion constant et au-dessus du foie perfusé. Après 90 minutes, changez le détergent pour du SDS à 1 %. Les foies perfusés par la veine porte présentent une élimination hétérogène des cellules, indiquant une décellularisation avec des cellules résiduelles visibles à l'échelle macroscopique pendant et après le processus, tandis que les foies perfusés par l'artère hépatique démontrent un processus de décellularisation plus homogène, avec moins de cellules résiduelles visibles.Si les foies ont été perfusés avec application de conditions de pression oscillante, aucune cellule résiduelle n'était visible. Indépendamment de la perfusion. L'évaluation histologique en racine des matrices hépatiques décellularisées confirme effectivement les observations macroscopiques dans les foies perfusés via l'artère hépatique.Aucune cellule résiduelle, qu'elles aient été perfusées sous des conditions de pression oscillante ou non, n'est observée dans les foies perfusés par la veine porte. Toutefois, ces foies présentent des zones de cellules résiduelles, même lorsqu'ils sont perfusés sous pression oscillante, bien que ces conditions réduisent la masse cellulaire résiduelle. Notez la préservation des matrices extracellulaires des foies, indépendamment des conditions de décellularisation. La teneur en ADN par poids sec de la matrice hépatique a également diminué dans tous les groupes expérimentaux par rapport aux foies natifs. Bien que ces différences n'aient été statistiquement significatives que dans les groupes perfusés sous pression oscillante.En outre, la technique de moulage par corrosion des matrices hépatiques décellularisées a confirmé la préservation de l'architecture microanatomique du foie au cours du processus de perfusion. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de récolter, canuler et perfuser des foies rouges afin d'obtenir une décellularisation homogène et reproductible. N'oubliez pas que le travail avec le Triton X-100 et le SDS peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants doivent également être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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