Procédure pour Décellularisation du Rat Livers dans une perfusion périphérique oscillant de pression

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer le rôle de la racine de perfusion dans l’optimisation de l’homogénéité de la décellularisation de la perfusion hépatique du rat. Ceci est réalisé par la canulation d’abord, les veines portes et les artères hépatiques des foies de rats fraîchement isolés. Dans un deuxième temps, les foies sont connectés à un dispositif de perfusion pour la perfusion sélective des veines portes ou des artères hépatiques.

Ensuite, des changements de pression oscillatoires sont appliqués à la chambre de perfusion pour imiter les changements de pression intra-abdominale qui se produisent pendant la respiration. En optimisant la microperfusion hépatique, les foies perfusés via l’artère hépatique dans des conditions de pression oscillante présentent une décellularisation plus homogène et plus rapide telle qu’évaluée par l’observation macroscopique et l’analyse histologique et biochimique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la décellularisation par perfusion veineuse portale est que la perfusion artérielle utilisant des conditions de pression oscillante conduit à un résultat de décellularisation plus homogène.

Dans un laps de temps plus court, cependant, cette méthode peut donner un aperçu des techniques de décélération. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les expériences de solarisation, les configurations de perfusion extra-orale et les modèles d’organes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car la récolte et la canulation artérielle des foies rouges peuvent être compliquées.

Avant de prélever le foie, faites une incision oblique à l’extrémité d’un morceau de 1,5 centimètre d’un cathéter veineux périphérique G 20. Connectez le cathéter à un robinet d’arrêt à trois voies et utilisez une seringue de 10 millilitres remplie de solution de sonnerie pour désamorcer le système. Ensuite, coupez l’aiguille d’une canule papillon à une longueur de cinq millimètres et utilisez de la super colle pour fixer un tube de cinq centimètres à l’aiguille.

Insérez un tube de deux centimètres de long dans le plus grand tube et fixez également ce tube avec de la super colle. Glissez un autre tube sur cette construction et collez-le en place pour créer un butée. Ensuite, utilisez une seringue de cinq millilitres remplie de solution de sonnerie pour décharger la canule artérielle nouvellement construite afin de réparer le foie pour la récolte.

Commencez par utiliser un bandage humide pour maintenir les lobes médial et gauche du foie d’un rat adulte anesthésié sous le dôme du diaphragme. Exposez également le ligament hépato-duodénal et le lobe supérieur du foie à ce moment-là. Ensuite, utilisez deux micro-pinces et des ciseaux à ressort pour disséquer soigneusement le ligament attaché au lobe omental supérieur jusqu’à ce que le lobe soit mobile.

Ensuite, maintenez les lobes médial et gauche en place. À l’aide de cotons-tiges humides, déplacez le lobe sous la compresse du GRE et l’estomac vers la gauche de l’animal. Fixez l’estomac avec une pince et disséquez l’élan mineur.

Ensuite, disséquez le lobe hépatique inférieur ou mental jusqu’à ce qu’il soit mobile, et ramenez le lobe dans sa cavité à l’aide d’une pince arrière pour retenir le duodénum, déplacez le duodénum vers la gauche pour exposer le ligament duodénal herpa. Circonscrire le canal cholédoque. Ensuite, disséquez le canal biliaire du tissu adipeux et pancréatique, en coupant le canal à 1,5 centimètre de la bifurcation des canaux biliaires.

Disséquez la veine sale du tissu adipeux environnant, exposant la veine gastroduodénale. Ensuite, ligaturez la veine gastroduodénale deux fois avec six sutures zéro et divisez la veine entre les deux nœuds. Disséquez le tronc cœliaque et l’artère hépatique commune des tissus environnants jusqu’à ce que toute la ramie artérielle soit révélée.

Une fois que toutes les artères ont été disséquées, circonscrire la veine cave inférieure entre le rein droit et le lobe latéral droit du foie et disséquer la veine de l’espace rétropéritonéal. Suivez le tronc cœliaque pour exposer l’aorte. Ensuite, disséquez le tissu adipeux rétropéritonéal et circonscrivez l’aorte au-dessus du tronc cœliaque.

Injectez maintenant 1000 unités d’héparine dans un millilitre de solution saline dans la veine cavereuse inférieure. Couvrez l’incision avec un coton et attendez une à deux minutes pour que l’héparine fasse effet. Ensuite, circonscrire l’aorte à l’aide d’une pince et disséquer l’aorte et la veine cave inférieure distalement du rein.

Pour placer la canule veineuse porte, faites une incision dans la bouche de poisson dans la veine porte distale et ouvrez l’incision avec une pince. Ensuite, canulez la veine porte et rincez le foie avec 20 millilitres de solution de sonnerie jusqu’à ce que le foie se déshumanise en utilisant six ligatures zéro pour fixer la canule en place. Pour placer la canule artérielle, disséquez l’aorte au-dessus du tronc cœliaque jusqu’à ce que le segment de l’aorte puisse être libéré de l’espace rétropéritonéal.

Coupez le segment de l’aorte longitudinalement pour générer un patch aortique et insérez la canule auto-construite dans un support statique. Ensuite, à l’aide de deux pinces, glissez le patch aortique sur la canule et ligaturez l’artère hépatique avec une suture en soie six zéro sur la canule. Fixation du patch au niveau du pilier pour effectuer la décellularisation : Reliez le robinet d’arrêt à trois voies sur la canule de la veine porte à l’accès du réacteur associé et connectez la canule artérielle à l’accès artériel en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans les systèmes.

Ensuite, connectez le respirateur à la chambre de distribution de pression et connectez la chambre au réacteur. Démarrez l’application de pression. Puis pour lancer la décellularisation.

Fusionner le foie avec 1 % tritton X 100 à raison de cinq millilitres par minute. Permettez à l’émission des déchets via l’écoulement du dispositif de perfusion de maintenir le niveau de liquide à l’intérieur de la chambre de perfusion constant et au-dessus du foie perfusé. Après 90 minutes, changer le détergent à 1 % de SDS les foies perfusés via la veine de force présentent une élucidation homogène indiquant une décellularisation avec des cellules restantes macroscopiquement visibles pendant et après le processus, tandis que les foies perfusés via l’artère hépatique démontrent un processus de décellularisation plus homogène avec moins de cellules restantes visibles.

Si les foies étaient perfusés avec l’application de conditions de pression oscillante, aucune cellule restante n’était visible. Quelle que soit la perfusion. L’évaluation histologique radiculaire des matrices hépatiques décellularisées confirme les résultats macroscopiques en effet dans les foies perfusés via l’artère hépatique.

Aucune cellule restante, qu’elles aient été perfusées dans des conditions de pression oscillante ou non, n’est observée les foies perfusés via la veine porte, cependant, présentent des zones de cellules restantes, même si elles sont perfusées dans des conditions de pression oscillante, bien que ces conditions réduisent la masse cellulaire restante dans ces foies, notez, la préservation des matrices extracellulaires des foies quelles que soient les conditions de décellularisation. La teneur en ADN par poids sec de la matrice hépatique a également diminué dans tous les groupes expérimentaux par rapport aux foies natifs. Bien que les différences n’aient été statistiquement significatives que dans les conditions de perfusion du groupe dans des conditions de pression oscillante.

De plus, le moulage par corrosion des matrices hépatiques décellularisées a confirmé la préservation de la microanatomie du foie pendant le processus de perfusion. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récolter des canules et de perfuser des foies rouges pour une décélération homogène reproductible. N’oubliez pas que travailler avec Triton X 100 et SDS peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de gants doivent également être prises lors de cette procédure.