Name: Photopatterning protéines et des cellules dans une solution aqueuse Environnement Utilisation de TiO 2 Photocatalyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez la photopatterning de protéines et de cellules par photocatalyse TiO₂ pour modifier l'affinité cellulaire des surfaces de scaffold. Cette méthode crée des microdomaines protéiques sélectifs en milieu aqueux.

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Les auteurs remercient M. Kotaro Okubo pour son aimable aide avec l’imagerie MEB. Ce travail a été soutenu par la Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), la Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), et par des subventions de recherche de la Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation et de la Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

1. Préparation de TiO 2 revêtues de verre Coverslip <ol><li> Nombre les lamelles à l&#39;aide d&#39;une pointe à tracer de diamant. Cela permet non seulement de garder une trace de chaque lamelles, mais aussi pour veiller à ce que le bon côté de l&#39;échantillon est orientée vers le haut. Nettoyer les lamelles couvre-objet, d&#39;abord sous exécutant ddH 2 O, puis en les immergeant dans une solution de piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Après 10 minutes, rincez soigneusement les lamelles, 8 fois en ddH 2 O. Sécher les lamelles sous N2 flux. </li><li> Ensemble de TiO 2 dans la cible de radiofréquence (RF) de système de pulvérisation. Fixez les lamelles sur un support de l&#39;équipement de pulvérisation à l&#39;aide d&#39;un ruban de polyimide de l&#39;échantillon. Placez le porte-échantillon dans la chambre de pulvérisation. Évacuer la chambre jusqu&#39;à ce que la pression atteint 2,0 × 10 -4 Pa. </li><li> Introduire du gaz Ar dans la chambre et régler la pression de dépôt à 4,0 mTorr. Tout en gardant l&#39;obturateur fermé, augmenter progressivementla puissance RF à 70 W. </li><li> Ouvrir le volet et par pulvérisation cathodique pendant 15 min pour obtenir un film d&#39;une épaisseur de 120 à 150 nm (Figure 1: Etape A). Taux de croissance du film doit être dérivé pour chaque machine. </li></ol> 2. Revêtement de surface avec Cell-répulsif Film <ol><li> Rendre hydrophile la surface de TiO 2 par traitement de l&#39;échantillon avec du plasma O 2, en suivant les instructions fournies par le fabricant du réacteur à plasma. Nous traitons l&#39;échantillon pendant 5 min à 200 W avec O 2 débit de 100 sccm. Immerger l&#39;échantillon dans le trou DDH 2 O et de confirmer que la surface est superhydrophile. Séchez soigneusement la surface sous le N 2 flux. </li><li> Préparez 1 mM octadécyltrichlorosilane (OTS) solution par addition de 39,6 OTS pi à 100 ml de toluène. Immerger l&#39;échantillon dans la solution pendant 1 heure à température ambiante. Effectuer cette étape l&#39;intérieur d&#39;un sac à gants 2 -filled N (Figure 1: Étape B). </li><li> Pour éliminer les molécules physisorbées, sonicate l&#39;échantillon dans le toluène, l&#39;acétone, l&#39;éthanol, et ddH 2 O pendant 5 minutes chacune, dans cet ordre. Rincer l&#39;échantillon quatre fois en frais ddH 2 O et sécher la surface sous le N 2 flux. La surface doit être hydrophobe avec un angle de 100-110 ° de contact. </li></ol> 3. Ex-Situ structuration de surface <ol><li> Travailler dans une hotte à flux laminaire, tirer plusieurs traces de rayures avec un abonné de diamant sur la surface. Les marques aident à garder la trace des régions traitées et également mettre au point des microscopes. Stériliser le TiO 2 revêtu OTS en plongeant l&#39;échantillon dans de l&#39;éthanol 70% pendant 5 min. Puis rincer l&#39;échantillon deux fois dans stérilisée ddH 2 O. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans un plat de 35 mm, et ajouter 2 ml de milieu de croissance de PC12 (voir l&#39;étape 4.2). Incuber pendant plus de 3 heures dans un incubateur à CO 2 (37 ° C). Cette procédure est destinée à laisser sérumalbumines absorbent sur la surface. Albumines adsorbées inhibent l&#39;adsorption ultérieure d&#39;autres proteins et des cellules (Figure 1: l&#39;étape c). </li><li> En attendant, mettre en place le microscope inversé à fluorescence. <ol><li> Allumez la lampe à arc, insérez le cube de filtre UV, et définir l&#39;objectif de 20X. </li><li> Mesurer l&#39;intensité lumineuse I (W cm -2) au moyen d&#39;un compteur d&#39;intensité UV, et de calculer la durée d&#39;irradiation t (en secondes) pour une dose de d (en cm -2 J) en tant que: t = d / I. Par exemple, pour irradier à une dose de 200 J cm -2 utilisant une source lumineuse de 600 mW cm -2, 333 secondes d&#39;irradiation est nécessaire. </li><li> Utilisez un micromètre et fermer le diaphragme de champ pour définir la taille de la région à irradier, par exemple, 200 um. </li></ol></li><li> Après l&#39;incubation de trois heures, de compléter le milieu avec 200 ul de 3,0 mg ml-1 de type IV collagène (Col-IV; concentration finale de 300 ug ml-1). </li><li> Transférer le plat de 35 mm de la platine du microscope. Trouver le scratch marche, focaliser le microscope sur la surface de l&#39;échantillon, et irradier la lumière UV à une dose de 200 J cm -2 (Figure 1: Etape D). La zone d&#39;irradiation UV peut être modifiée, soit en ajustant l&#39;ouverture du diaphragme de champ ou par le remplacement du diaphragme de champ avec un masque métallique de géométrie d&#39;arbitrage. </li><li> Remplacez le milieu avec un milieu de croissance frais (sans Col-IV), et placer l&#39;échantillon dans l&#39;incubateur. </li></ol> 4. Culture Cellulaire <ol><li> Culture de routine de cellules PC12 est effectuée sur une boîte en matière plastique revêtue de collagène. <ol><li> Pour revêtir un plat de culture de tissu de 60 mm avec Col-IV, mouiller d&#39;abord la surface avec le trou DDH 2 O et aspirer tous ddH 2 O. </li><li> Préparer 300 ng ml -1 Col-IV en diluant la solution initiale (3 mg ml -1) 10x avec ddH 2 O. </li><li> Ajouter 200 pi de 300 pg ml -1 Col-IV par 60 mm plat. Laissez la solution se propager à travers la surface. </li><li> À sec til plat dans une hotte à flux laminaire pendant environ 1 heure. </li><li> Rincer la surface deux fois avec 4 ml de tampon phosphate salin de Dulbecco la (D-PBS). Lorsqu&#39;ils ne sont pas immédiatement d&#39;utiliser le plat enduit, rincez le plat une fois avec 4 ml de ddH 2 O. Après aspiration ddH 2 O, stocker le plat dans l&#39;incubateur. Essayez de ne pas le garder stocké pendant plus de deux semaines. </li></ol></li><li> Les cellules PC12 sont cultivées dans un milieu de croissance qui se compose de: moyen (faible taux de glucose) de Eagle modifié par Dulbecco + sérum solution à 1% de pénicilline-streptomycine + 10% de sérum de veau foetal 5% + cheval. Incuber les cellules dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2), et remplacer la moitié du milieu tous les deux jours. Passage cellules avant qu&#39;elles atteignent la confluence. <ol><li> Aspirer le milieu de croissance, et ajouter 2 ml de PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) + 10 mM d&#39;EDTA) préchauffé à 37 ° C. Incuber pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le plat de détacher tous les CELLS. </li><li> Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. Rincer le plat avec 3 ml de frais D-PBS, préchauffée à 37 ° C. </li><li> Centrifuger le tube à 150 g pendant 4 min. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de croissance. </li><li> Pour la culture de routine, diviser les cellules 1: 3 à 1: 5. </li></ol></li><li> Pour étaler les cellules sur l&#39;échantillon modifié-UV OTS / TiO 2, comptez densité cellulaire et ajouter 3,0 × 10 5 cellules dans une boîte de 35 mm (Figure 1: Étape E). Incuber le plat au incubateur humidifié (37 ° C, 5% CO 2) pendant 1-2 jours. Les deux facteurs de croissance et naïf nerf (NGF) cellules PC12 -differentiated peuvent être utilisées pour les expériences de mise en forme. Pour la différenciation NGF, 100 ng ml -1 de 7S-NGF est ajouté à la croissance moyenne plusieurs jours avant l&#39;étalement des cellules sur l&#39;échantillon. NGF-différenciation semble augmenter le adhesibility des cellules PC12 et facilite la manipulation, en particulier dans le modelage in situ eXperiments. </li></ol> 5. In-Situ structuration de surface <ol><li> Après 1-2 jours de culture sur la surface modifiée ex-situ, confirment que les cellules attachent croissant et seulement sur ​​la région irradiée aux UV. Mettre en place le microscope, comme décrit dans l&#39;étape 3.4. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 35 mm contenant du milieu de croissance, 100 ng ml-1 NGF (dans le cas de l&#39;utilisation de cellules différenciées NGF), et 100 ug ml-1 Col-IV. </li><li> Placez le plat sur la platine du microscope. Trouver la position appropriée, et irradier la lumière UV à une dose de 200 J cm -2 (Figure 1: Etape F, G). La région permissive nouvellement créé est indiqué par un astérisque dans la figure 1: Etape G. </li><li> Essayer de terminer le traitement d&#39;un seul échantillon dans les 30 min. Après irradiation, transférer l&#39;échantillon de nouveau dans le milieu sans Col-IV. </li><li> Soyez extrêmement prudent lors de la réalisation du plat avec cultured cellules et le transfert de l&#39;échantillon de plat à plat pour éviter le détachement des cellules motifs. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1. Représentation schématique de l&#39;ensemble du processus. Voir le texte pour plus de détails. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans notre protocole actuel, TiO 2 film a été formé par RF-pulvérisation magnétron. Nous privilégions cette méthode de dépôt, car il nous permet de préparer de façon reproductible un film photocatalytique de TiO 2 avec une rugosité sous-nm. Bien que les processus de dépôt par pulvérisation sont familiers aux spécialistes des matériaux et des ingénieurs en électronique, il peut ne pas être tout à fait accessible aux biologistes. Dans ce cas, TiO 2 film spin-enduit serait un choix alternat...

Semiconductor processus de lithographie et de ses dérivés tels que la photolithographie - 1,2, la lithographie par faisceau d&#39;électrons 3-6 et microcontact impression 7-10 - sont devenus un outil créé en biologie cellulaire pour cultiver des cellules vivantes dans une position définie et la géométrie. Procédé de formation de motifs repose sur l&#39;utilisation de substrats micro-usinés, comprenant des micro-île de revêtement permissive de cellules dans un arrière-plan non permissive. Un tel substrat sert de matrice à motif cellules. Ces technologies nous ont fourni les nouvelles méthodes pour modifier des cellules et leur fonction à un niveau mono et multi-cellulaire, pour extraire les propriétés intrinsèques des cellules, et d&#39;augmenter le débit de base de cellules criblage de médicaments 11. Le degré de liberté dans un patron de cellules augmenterait considérablement si la géométrie du motif de modèle pourrait être modifié in situ, à savoir, tandis que les cellules sont cultivées sur des sta tête. Les procédés classiques de formation de motif ne peut pas être directement appliquées ici, étant donné qu&#39;ils traitent les échantillons dans une atmosphère ou sous vide. Par conséquent diverses nouvelles techniques de modification de surface ont été proposées, qui sont basées, par exemple, sur des composés photo-réactifs 12,13 ou ablation laser 5,14, juste pour en nommer quelques-uns. Les méthodes proposées ont été bien examiné par Robertus et al. 15, et plus récemment par Choi et al. 16 et 17 par Nakanishi. Ici, dans cet article, nous décrivons un nouveau protocole de modification in situ surface, qui tire parti de la dégradation photocatalytique de molécules organiques sur un dioxyde de titane (TiO 2) de surface 18,19. Dans ce procédé, un film de TiO 2 est insérée entre le substrat de verre et le film organique qui assure l&#39;interface des cellules, et le film organique est décomposé in situ en irradiant localement ultraviolet (UV)la lumière pour une région d&#39;intérêt (λ &lt;388 nm). Nous montrons que le nouveau protocole peut être utilisé pour créer micropatterns de protéines de la matrice extracellulaire et des cellules vivantes ex situ et in situ. TiO 2 est biocompatible, chimiquement stable, et optiquement transparents, caractéristiques de ce qui le rend sympathique à introduire dans des expériences de culture cellulaire. Ce protocole fournit une alternative de matériaux à base scientifique pour modifier les échafaudages de culture cellulaire en milieu de culture cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Lamelle en verre</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-15R15</td><td>15 mm de diamètre, épaisseur #1.5</td></tr><tr><td>Diamant traceur</td><td>Ogura Jewel Industry</td><td>D-Point Pen</td><td></td></tr><tr><td>Système de pulvérisation RF</td><td>ANELVA</td><td>SPC350</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 cible de pulvérisation</td><td>Kojundo Chemical Lab</td><td>Oxyde de titane (IV), pureté de la cible</td><td>, 99,9</td></tr><tr><td> % réacteur à plasma</td><td>Yamato</td><td>PR301</td><td></td></tr><tr><td>n-octadécyltrichlorosilane (OTS)</td><td>Aldrich</td><td>104817</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Wako</td><td>204-01866</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire (35&#160 ; mm)</td><td>Greiner</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire (60&#160 ; mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type IV</td><td>Nitta Gelatin</td><td>Cellmatrix Type IV</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td>Inactivation thermique et passage à travers un 0,22&#160 ; &#956 ; m filtrer avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td>Passer à travers un 0.22&#160 ; &#956 ; m filtre avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine (100x)</td><td>Nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse 7S (NGF)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-130</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>N001</td><td>Solution mère dans 0,5 M</td></tr><tr><td>TiO2 nanoparticule</td><td>Tayca</td><td>TKD-701</td><td></td></tr></tbody></table>

photopatterning protéines et des cellules dans une solution aqueuse environnement utilisation de tio<sub&gt; 2</sub&gt; photocatalyse

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Les contaminants organiques adsorbés à la surface du dioxyde de titane (TiO 2) peuvent être décomposés par photocatalyse sous rayonnement ultraviolet (UV). Nous décrivons ici un nouveau protocole employant la photocatalyse du TiO 2 à modifier localement affinité des cellules de la surface du substrat. Pour cette expérience, un film mince de TiO 2 est revêtu par pulvérisation sur une lamelle de verre, et la surface de TiO 2 a ensuite été modifié par une monocouche organosilane dérivé de l&#39;octadécyltrichlorosilane (OTS), qui inhibe l&#39;adhérence cellulaire. L&#39;échantillon a été immergé dans un milieu de culture cellulaire, et concentre la lumière UV a été irradié à une région de forme octogonale. Quand un neuronales cellules PC12 lignée de cellules ont été étalées sur l&#39;échantillon, les cellules adhèrent seulement sur la zone irradiée aux UV. On montre en outre que cette modification de surface peut également être réalisée in situ, autrement dit, même lorsque les cellules sont en croissance sur le substrat. Modification appropriée de la surface nécessaire une matrice extracellulaire protein collagène d&#39;être présent dans le milieu au moment de l&#39;irradiation UV. La technique présentée ici peut éventuellement être utilisé dans plusieurs types de cellules pour la construction de structuration des systèmes de co-culture ou de manipuler arbitrairement cellules dans la culture.

La figure 2A montre une image au microscope électronique à balayage en coupe transversale (SEM) de la pellicule de TiO 2 déposée par pulvérisation cathodique. De l&#39;observation, l&#39;épaisseur du film a été estimée à environ 150 nm. Notable ici est la planéité de la couche de TiO 2 déposée. Une analyse plus poussée par microscopie à force atomique (AFM) a révélé que la rugosité racine carrée moyenne (RMS) de la surface était de 0,2 nm (figure 2B). <p class=...

Nous décrivons un protocole pour modifier l’affinité cellulaire d’une surface d’échafaudage en milieu aqueux. La méthode tire parti de la photocatalyse au dioxyde de titane pour décomposer le film organique dans la région photo-irradiée. Nous montrons qu’il peut être utilisé pour créer des microdomaines de protéines d’échafaudage, à la fois ex situ et in situ.

Photopatterning protéines et des cellules dans une solution aqueuse Environnement Utilisation de TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalyse

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser une modification de surface d'un échafaudage de culture cellulaire en utilisant l'activité photocatalytique du dioxyde de titane. Cela est accompli en déposant une fine couche de dioxyde de titane sur un lamelle de verre, puis en la recouvrant d'un octa dessaline afin de rendre toute la surface hydrophobe. Dans un deuxième temps, le substrat est bloqué en l'immergeant dans un milieu de culture cellulaire contenant de l'albumine sérique.L'albumine s'adsorbe à la surface et la rend non perméable à l'adhésion cellulaire. Ensuite, l'échantillon est transféré dans une solution aqueuse contenant du collagène, puis une lumière UV focalisée est utilisée pour irradier la surface. Cela permet aux molécules de collagène de s'adsorber sélectivement sur la région exposée à la photo-irradiation et rend cette région perméable à l'adhésion cellulaire.Ce processus peut être répété afin de dessiner plusieurs protéines ou types cellulaires. Nous montrons dans cette vidéo comment la région adhésive des cellules PC 12 peut être modifiée sélectivement par irradiation UV. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que la photocatalyse par le dioxyde de titane est utilisée commercialement dans les vitres autonettoyantes, qui éliminent les contaminants organiques présents à la surface sous l'effet du rayonnement lumineux, démontrant ainsi que la procédure suscitera l'intérêt d'un étudiant diplômé de mon laboratoire.Commencez par numéroter les lamelles à l’aide d’un crayon diamanté de manière à garantir que le bon côté de l’échantillon soit orienté vers le haut. Ensuite, nettoyez les lamelles d’abord sous un filet d’eau doublement distillée, puis en les immergeant dans une solution piranha pendant 10 minutes. Après 10 minutes, rincez les lamelles huit fois à l’eau doublement distillée et séchez-les sous un flux d’azote.Ensuite, placez une cible d'oxyde de titane dans un système de pulvérisation par cathode froide à haute fréquence, puis fixez les lamelles propres sur le porte-échantillon à l'aide d'un ruban en polyamide. Insérez le porte-échantillon dans la chambre de pulvérisation et faites le vide jusqu'à ce que la pression atteigne 2,0 × 10⁻⁴ pascals. Ensuite, introduisez du gaz argon dans la chambre et réglez la pression de dépôt à 4,0 mTorr tout en maintenant l'obturateur fermé. Augmentez progressivement la puissance RF jusqu'à 70 watts.Ensuite, ouvrez l'obturateur et pulvérisez pendant 15 minutes afin d'obtenir un film d'une épaisseur comprise entre 120 et 150 nanomètres. Commencez par sécher un bécher en verre et une pince dans une étuve à 120 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez les lamelles dans un réacteur à plasma et traitez la surface de dioxyde de titane avec un plasma d'oxygène pendant cinq minutes à 200 watts, avec un débit d'oxygène de 100 centimètres cubes par minute en conditions normales, afin de créer une surface plus hydrophile.Ensuite, retirez les échantillons et immergez-les dans de l'eau doublement distillée afin de confirmer que la surface est superhydrophile, puis séchez soigneusement la surface sous un flux d'azote. Puis, transférez les échantillons, le bécher sec et la pince dans une boîte à gants remplie d'azote et préparez une solution monomolaire d'octodécyltrichlorosilane dissoute dans le toluène. Immergez l'échantillon dans la solution pendant une heure à température ambiante afin de former une monocouche auto-assemblée sur l'oxyde de titane.Ensuite, éliminer toutes les molécules de phaseur en rinçant l'échantillon dans du toluène, de l'acétone, de l'éthanol, puis finalement de l'eau doublement distillée, cinq minutes chacun. Rincer ensuite l'échantillon quatre fois dans de l'eau doublement distillée fraîche et sécher la surface sous un flux d'azote.Stérilisez les lamelles recouvertes en immergeant les échantillons dans de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes. Rincez ensuite les échantillons deux fois dans de l'eau distillée stérile. Ensuite, placez l'échantillon dans une boîte de 35 millimètres et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance PC12.Incuber les échantillons pendant au moins trois heures dans une étuve tamponnée au CO2 à 37 degrés Celsius, en attendant que l'albumine sérique présente dans le milieu s'adsorbe à la surface des lamelles. Préparer le microscope à fluorescence inversé en allumant d'abord la lampe à arc, puis en insérant le cube de filtres UV et en tournant l'objectif vers un objectif de magnification 20 x.Mesurez l'intensité lumineuse à l'aide d'un mètre d'intensité UV et calculez le temps d'irradiation pour une dose de 200 joules par centimètre carré. Ensuite, utilisez un micromètre de plateau et réglez le diamètre de la zone à irradier à 200 microns en ajustant le diaphragme de champ. Après l'incubation de trois heures, complétez le milieu recouvrant les lamelles avec 200 microlitres de collagène de type quatre à 3,0 milligrammes par millilitre.Ensuite, transférez la boîte de 35 millimètres sur la platine du microscope et focalisez le microscope sur la surface de l'échantillon en utilisant les marques de rayures. Irradiez une zone du couvre-objet avec de la lumière UV à une dose de 200 joules par centimètre carré. Puis remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de croissance frais, contenant du NGF et sans collagène de type quatre, et replacez l'échantillon dans l'incubateur.Récupérez les cellules PC 12 différenciées par le NGF en culture dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez le tube à 150 ×g pendant quatre minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et ajoutez un millilitre de milieu de croissance. Resuspendez les cellules en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’un hémocytomètre.Compter la densité cellulaire et ajouter 3,0 × 10⁵ cellules dans une boîte de 35 mm contenant les lamelles modifiées. Incuber la boîte pendant un à deux jours dans un incubateur à 5 % CO₂ à 37 °C, après un à deux jours de culture sur la surface modifiée XC deux. Utiliser un microscope pour confirmer que les cellules s’attachent et se développent uniquement sur la région des lamelles irradiée par UV.Ensuite, ajoutez 67 microlitres de collagène de type IV dans la boîte contenant les cellules cultivées afin d'obtenir une concentration finale de collagène de 100 microgrammes par millilitre, avec le microscope configuré pour le dessin de surface. Placez la boîte sur la platine du microscope et positionnez la zone d'irradiation à côté de l'emplacement actuel des cellules. Irradiez le lamelle avec de la lumière UV à une dose de 200 joules par centimètre carré.Après l'irradiation, remplacez le milieu par un milieu dépourvu de collagène et replacez l'échantillon dans l'incubateur, en essayant de terminer le traitement d'un échantillon unique dans les 30 minutes. Il s'agit d'une image de microscopie électronique à balayage en coupe transversale du film de dioxyde de titane déposé par pulvérisation cathodique. D'après l'observation, l'épaisseur du film a été estimée à environ 150 nanomètres.On remarque également ici l'uniformité du film de dioxyde de titane déposé. Une analyse complémentaire par microscopie à force atomique a révélé que la rugosité quadratique moyenne de la surface n'était que de 0,2 nanomètre. Le collagène de type IV et la solution s'adsorbent préférentiellement sur la région irradiée par UV, où l'albumine est déplacée par le laser.Pour démontrer la polyvalence de cette approche, d'autres protéines telles que le fibrine ont également été structurées à l'aide de la même technique. Ici, les cellules poussent sur la région de la lame recouverte de deux motifs XC et juste à côté d'elles, dans la zone définie par la ligne pointillée. La lame a récemment été irradiée aux UV in situ deux fois et recouverte de collagène de type quatre.Au cours des cinq prochains jours, les cellules prolifèrent et migrent pour recouvrir la région nouvellement codée. La procédure présentée ici peut être utilisée pour manipuler arbitrairement des cellules en culture et potentiellement pour agencer plusieurs types de cellules afin de construire des systèmes complexes de co-culture.

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