Photopatterning protéines et des cellules dans une solution aqueuse Environnement Utilisation de TiO

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser une modification de surface d'un échafaudage de culture cellulaire en utilisant l'activité photocatalytique du dioxyde de titane. Cela est accompli en déposant une fine couche de dioxyde de titane sur un lamelle de verre, puis en la recouvrant d'un octa dessaline afin de rendre toute la surface hydrophobe. Dans un deuxième temps, le substrat est bloqué en l'immergeant dans un milieu de culture cellulaire contenant de l'albumine sérique.

L'albumine s'adsorbe à la surface et la rend non perméable à l'adhésion cellulaire. Ensuite, l'échantillon est transféré dans une solution aqueuse contenant du collagène, puis une lumière UV focalisée est utilisée pour irradier la surface. Cela permet aux molécules de collagène de s'adsorber sélectivement sur la région exposée à la photo-irradiation et rend cette région perméable à l'adhésion cellulaire.

Ce processus peut être répété afin de dessiner plusieurs protéines ou types cellulaires. Nous montrons dans cette vidéo comment la région adhésive des cellules PC 12 peut être modifiée sélectivement par irradiation UV. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que la photocatalyse par le dioxyde de titane est utilisée commercialement dans les vitres autonettoyantes, qui éliminent les contaminants organiques présents à la surface sous l'effet du rayonnement lumineux, démontrant ainsi que la procédure suscitera l'intérêt d'un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Commencez par numéroter les lamelles à l’aide d’un crayon diamanté de manière à garantir que le bon côté de l’échantillon soit orienté vers le haut. Ensuite, nettoyez les lamelles d’abord sous un filet d’eau doublement distillée, puis en les immergeant dans une solution piranha pendant 10 minutes. Après 10 minutes, rincez les lamelles huit fois à l’eau doublement distillée et séchez-les sous un flux d’azote.

Ensuite, placez une cible d'oxyde de titane dans un système de pulvérisation par cathode froide à haute fréquence, puis fixez les lamelles propres sur le porte-échantillon à l'aide d'un ruban en polyamide. Insérez le porte-échantillon dans la chambre de pulvérisation et faites le vide jusqu'à ce que la pression atteigne 2,0 × 10⁻⁴ pascals. Ensuite, introduisez du gaz argon dans la chambre et réglez la pression de dépôt à 4,0 mTorr tout en maintenant l'obturateur fermé. Augmentez progressivement la puissance RF jusqu'à 70 watts.

Ensuite, ouvrez l'obturateur et pulvérisez pendant 15 minutes afin d'obtenir un film d'une épaisseur comprise entre 120 et 150 nanomètres. Commencez par sécher un bécher en verre et une pince dans une étuve à 120 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez les lamelles dans un réacteur à plasma et traitez la surface de dioxyde de titane avec un plasma d'oxygène pendant cinq minutes à 200 watts, avec un débit d'oxygène de 100 centimètres cubes par minute en conditions normales, afin de créer une surface plus hydrophile.

Ensuite, retirez les échantillons et immergez-les dans de l'eau doublement distillée afin de confirmer que la surface est superhydrophile, puis séchez soigneusement la surface sous un flux d'azote. Puis, transférez les échantillons, le bécher sec et la pince dans une boîte à gants remplie d'azote et préparez une solution monomolaire d'octodécyltrichlorosilane dissoute dans le toluène. Immergez l'échantillon dans la solution pendant une heure à température ambiante afin de former une monocouche auto-assemblée sur l'oxyde de titane.

Ensuite, éliminer toutes les molécules de phaseur en rinçant l'échantillon dans du toluène, de l'acétone, de l'éthanol, puis finalement de l'eau doublement distillée, cinq minutes chacun. Rincer ensuite l'échantillon quatre fois dans de l'eau doublement distillée fraîche et sécher la surface sous un flux d'azote.

Stérilisez les lamelles recouvertes en immergeant les échantillons dans de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes. Rincez ensuite les échantillons deux fois dans de l'eau distillée stérile. Ensuite, placez l'échantillon dans une boîte de 35 millimètres et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance PC12.

Incuber les échantillons pendant au moins trois heures dans une étuve tamponnée au CO2 à 37 degrés Celsius, en attendant que l'albumine sérique présente dans le milieu s'adsorbe à la surface des lamelles. Préparer le microscope à fluorescence inversé en allumant d'abord la lampe à arc, puis en insérant le cube de filtres UV et en tournant l'objectif vers un objectif de magnification 20 x.

Mesurez l'intensité lumineuse à l'aide d'un mètre d'intensité UV et calculez le temps d'irradiation pour une dose de 200 joules par centimètre carré. Ensuite, utilisez un micromètre de plateau et réglez le diamètre de la zone à irradier à 200 microns en ajustant le diaphragme de champ. Après l'incubation de trois heures, complétez le milieu recouvrant les lamelles avec 200 microlitres de collagène de type quatre à 3,0 milligrammes par millilitre.

Ensuite, transférez la boîte de 35 millimètres sur la platine du microscope et focalisez le microscope sur la surface de l'échantillon en utilisant les marques de rayures. Irradiez une zone du couvre-objet avec de la lumière UV à une dose de 200 joules par centimètre carré. Puis remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de croissance frais, contenant du NGF et sans collagène de type quatre, et replacez l'échantillon dans l'incubateur.

Récupérez les cellules PC 12 différenciées par le NGF en culture dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez le tube à 150 ×g pendant quatre minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et ajoutez un millilitre de milieu de croissance. Resuspendez les cellules en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’un hémocytomètre.

Compter la densité cellulaire et ajouter 3,0 × 10⁵ cellules dans une boîte de 35 mm contenant les lamelles modifiées. Incuber la boîte pendant un à deux jours dans un incubateur à 5 % CO₂ à 37 °C, après un à deux jours de culture sur la surface modifiée XC deux. Utiliser un microscope pour confirmer que les cellules s’attachent et se développent uniquement sur la région des lamelles irradiée par UV.

Ensuite, ajoutez 67 microlitres de collagène de type IV dans la boîte contenant les cellules cultivées afin d'obtenir une concentration finale de collagène de 100 microgrammes par millilitre, avec le microscope configuré pour le dessin de surface. Placez la boîte sur la platine du microscope et positionnez la zone d'irradiation à côté de l'emplacement actuel des cellules. Irradiez le lamelle avec de la lumière UV à une dose de 200 joules par centimètre carré.

Après l'irradiation, remplacez le milieu par un milieu dépourvu de collagène et replacez l'échantillon dans l'incubateur, en essayant de terminer le traitement d'un échantillon unique dans les 30 minutes. Il s'agit d'une image de microscopie électronique à balayage en coupe transversale du film de dioxyde de titane déposé par pulvérisation cathodique. D'après l'observation, l'épaisseur du film a été estimée à environ 150 nanomètres.

On remarque également ici l'uniformité du film de dioxyde de titane déposé. Une analyse complémentaire par microscopie à force atomique a révélé que la rugosité quadratique moyenne de la surface n'était que de 0,2 nanomètre. Le collagène de type IV et la solution s'adsorbent préférentiellement sur la région irradiée par UV, où l'albumine est déplacée par le laser.

Pour démontrer la polyvalence de cette approche, d'autres protéines telles que le fibrine ont également été structurées à l'aide de la même technique. Ici, les cellules poussent sur la région de la lame recouverte de deux motifs XC et juste à côté d'elles, dans la zone définie par la ligne pointillée. La lame a récemment été irradiée aux UV in situ deux fois et recouverte de collagène de type quatre.

Au cours des cinq prochains jours, les cellules prolifèrent et migrent pour recouvrir la région nouvellement codée. La procédure présentée ici peut être utilisée pour manipuler arbitrairement des cellules en culture et potentiellement pour agencer plusieurs types de cellules afin de construire des systèmes complexes de co-culture.