Name: Préparation et caractérisation de la personne et de multi-drogue Loaded Physiquement piégé micelles polymériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez la préparation de micelles polymères chargées en médicaments par la méthode de moulage par évaporation de solvant. Cette technique permet d'obtenir des systèmes stables et reproductibles pour le ciblage thérapeutique.

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Cette étude a été financée par la subvention du programme de bourses de recherche de l’AACP New Pharmacy Faculty Award, de la subvention de nouveau chercheur de la Fondation de recherche médicale de l’Oregon, du fonds de démarrage de l’Université d’État de l’Oregon et du fonds de démarrage de l’école de pharmacie de l’Université du Pacifique.

1. Préparation de l&#39;individu et multi-drogue micelles chargées par la méthode de coulée de solvant <ol><li> Peser DTX 1 mg ou 1 mg EVR ou les deux médicaments à 1 mg chacune pour les micelles double de drogue (DDM). </li><li> Peser 15 mg de PEG 2000 - b -PLA 1800 ou PEG 4000 - b -PLA 2200 soit individuelle ou DDM. </li><li> Dissoudre les drogues / médicaments et le polymère dans 0,5 ml d&#39;acétonitrile et placer dans un 5 ml flacon à fond rond. </li><li> Former un film de polymère mince de médicament distribué en évaporant le (s) solution d&#39;acétonitrile -polymère de médicament sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. Réglez l&#39;évaporateur rotatif à 100 tours par minute, la température du bain d&#39;eau de 40 ° C et une pression de vide de 260 mbars pendant 5 min, suivie par une réduction de 100 mbar pendant 3 min plus. </li><li> Réhydrater le film médicament-polymère avec 0,5 ml d&#39;eau déminéralisée à 50 ° C et agiter doucement le flacon pour former les micelles. </li><li> Filtrer le résultating solution micellaire à travers un filtre en nylon de 0,2 um pour éliminer les contaminants ou tout médicament non dissous dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml. </li></ol> 2. Évaluation des médicaments en cours de chargement et de la stabilité dans les micelles Utilisation phase inverse Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP-PI) <ol><li> Effectuer l&#39;analyse RP-HPLC avec une colonne C8 equilibriated à 40 ° C dans un mode isocratique avec une phase mobile d&#39;acétonitrile / eau (62/38) contenant 0,1% d&#39;acide phosphorique et 1% de methanol à un débit de 1 ml / min et un volume d&#39;injection de 10 ul. </li><li> Diluer micelles fraîchement préparés (section 1) 1: 100 dans la phase mobile avant d&#39;analyser par RP-HPLC pour déterminer le chargement initial de la drogue. Magasin non dilués micelles individuelles et DDM à la température ambiante (25 ° C) pendant 48 heures et préparent fraîches 1: 100 échantillons dilués dans la phase mobile de réévaluer par RP-HPLC et de déterminer la drogue (s) de la stabilité dans les micelles plus de 24 h. </li><li> Surveiller DTX et EVR pics à 227 et 279 nm, respectivementavec des temps de rétention de 1,7 min et 5,7 respectivement. Effectuer toutes les mesures en triple exemplaire. Les données actuelles en moyenne ± SD charge médicamenteuse. </li></ol> 3. Évaluation des micelles la taille des particules par diffusion dynamique de lumière (DLS) <ol><li> Diluer micelles fraîchement préparés (comme décrit dans la section 1) dans de l&#39;eau déminéralisée à un ratio de 1:20 pour donner une concentration de polymère finale de 1,5 mg / ml. </li><li> Mesurer l&#39;intensité du laser He-Ne (633 nm) à 173 ° pour déterminer la dispersion. Effectuer toutes les mesures à 25 ° C après pré-équilibrage pendant 2 min. </li><li> Effectuer toutes les mesures en triple exemplaire. Les données actuelles que la taille moyenne du Z-moyenne ± écart avec l&#39;indice de polydispersité (PDI) de la distribution. </li></ol> 4. L&#39;évaluation de médicament in vitro de presse de micelles individuelles et DDM <ol><li> Préparer micelles individuelles et DDM comme décrit dans la section 1. Chargez 2,5 ml de micelles dans une cassette 3 ml de dialyseun poids moléculaire de coupure (MWCO) de 7000 g / mol. NOTE: Ce MWCO a été choisie pour permettre le médicament libre (s) en même temps que les molécules de polymère non associés à diffuser librement hors de la cassette et donc assurer des conditions de puits. </li><li> Placez les cassettes dans 2,5 L de 10 mM pH 7,4 tampon phosphate (préparé en diluant la solution mère de 200 mM) et de changer le tampon toutes les 3 heures pour assurer des conditions de puits. Maintenir la température du tampon à 37 ° C pendant toute la durée de l&#39;expérience. </li><li> A 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 et 48 h, retirer de 150 ul de la solution dans les cassettes et le remplacer avec 150 pi de tampon frais. </li><li> Analyser les échantillons en utilisant RP-HPLC comme établie à l&#39;article 2 pour déterminer la concentration du médicament. Ajustement de courbe les drogue (s) de données de rejets fondées sur un modèle simple de diffusion avec une association exponentielle à une phase en utilisant un logiciel stastitical. </li><li> Calculer le temps nécessaire pour atteindre 50% de la libération du médicament (t 1/2) ehaque drogue dans les micelles individuelles ou DDM basé sur l&#39;ajustement de la courbe. Effectuer toutes les mesures en quadruplet. </li></ol>

<ol><li>Yokoyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+as+a+new+drug+carrier+system+and+their+required+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-drug+loaded+polymeric+micelles+for+simultaneous+delivery+of+poorly+soluble+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs.</a> J Control Release. 140, 294-300 (2009).</li>
<li>Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+block+copolymers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic block copolymers for drug delivery.</a> J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).</li>
<li>Oerlemans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+in+anticancer+therapy%3A+targeting%2C+imaging+and+triggered+release%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release.</a> Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).</li>
<li>Shin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-in-1+polymeric+micelle+nanocontainer+for+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs.</a> Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).</li>
<li>Hasenstein, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+Triolimus%3A+a+novel+multidrug-loaded+micelle+containing+Paclitaxel+Rapamycin%2C+and+17-AAG%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG.</a> Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).</li>
<li>Mazzaferro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bivalent+sequential+binding+of+docetaxel+to+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin.</a> Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).</li>
<li>Iwase, Y., Maitani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+in+vivo+evaluation+of+liposomal+everolimus+for+lung+carcinoma+and+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma.</a> Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).</li>
<li>Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+effect+of+docetaxel+and+everolimus+as+individual+and+dual-drug-loaded+micellar+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers.</a> Pharm Res. 31, 660-669 (2014).</li>
<li>Xu, W., Ling, P., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles%2C+a+promising+drug+delivery+system+to+enhance+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs.</a> J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).</li>
<li>Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29-block-poly%28L-amino+acid%29+micelles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’utilisation de micelles polymères pour l’administration de médicaments continue de se développer en raison de leur polyvalence et de leur capacité à administrer des médicaments hydrophobes pour divers états pathologiques. Par conséquent, les techniques nécessaires pour préparer et caractériser ces formulations avant de les utiliser en culture cellulaire ou chez l’animal constituent une première étape essentielle pour déterminer le meilleur appariement entre le médicament et le polymère. Les PEG-b-PLA sont d’...

Copolymères séquencés amphiphiles avec structure en répétant composées de domaines hydrophiles et hydrophobes peuvent spontanément auto-assembler pour former trois ensembles macromoléculaires dimensions connues comme les micelles polymériques. Ces structures ont un noyau hydrophobe interne entouré par une enveloppe hydrophile. Le noyau hydrophobe a la capacité d&#39;incorporer des médicaments hydrophobes soit par piégeage physique ou par des interactions hydrophobes par conjugaison chimique à l&#39;ossature du polymère. 1 De nombreux avantages exister à l&#39;utilisation de ces copolymères à blocs pour former des micelles pour l&#39;administration de médicaments. Ceux-ci comprennent l&#39;incorporation de médicaments peu solubles, ce qui améliore la pharmacocinétique des médicaments incorporés, et la biocompatibilité et / ou de la biodégradabilité des polymères en fait une solution de rechange sans danger à des solubilisants classiques. 2 Un autre avantage de l&#39;utilisation des micelles polymères est leur taille de particule colloïdale, entre 15- 3 150 nm, ce qui les rend attrayants pour parenteral livraison. Par conséquent, au cours des 20 dernières années micelles polymères ont émergé comme les systèmes de délivrance de médicaments viables pour les médicaments solubles dans l&#39;eau en particulier pour le traitement du cancer 3,4. Actuellement, il existe cinq formulations micellaires polymères pour la thérapie du cancer subissant des essais cliniques. 4 Quatre des micelles dans les essais cliniques sont copolymères diblocs à base de PEG tandis que le dernier est un copolymère triséquencé d&#39;oxyde de polyéthylène contenant. La taille de ces micelles varie de 20 nm à 85 nm. L&#39;avantage d&#39;utiliser des polymères à base de PEG est leur biocompatibilité et en fonction de la deuxième séquence peut aussi être biodégradable. Récemment de nouveaux systèmes de délivrance de médicaments basés sur le bloc polyethyleneglycol- acide -polylactic (PEG b -PLA) micelles polymères ont été développés pour la livraison simultanée de plusieurs médicaments anticancéreux. Les micelles PEG-b- PLA sont à la fois biocompatible et biodégradable. Ces multi-drogues micelles chargées ont montré queynergistic inhibition de différents modèles de cancers in vitro et in vivo et 2,5,6 ajustement dans le paradigme actuel de l&#39;utilisation de plusieurs médicaments dans la chimiothérapie pour prévenir la résistance et abaisser la toxicité. Par conséquent, il ya un grand intérêt dans la préparation et la caractérisation de ces systèmes de délivrance de médicaments micellaires pour une utilisation dans le cancer et d&#39;autres états pathologiques. Dans le travail ci-dessous, nous avons défini un processus étape par étape par laquelle ces micelles peuvent être préparés et caractérisés avant de les évaluer dans des états pathologiques d&#39;intérêt. Aux fins de ce travail deux agents anti-cancéreux mal-solubles, le docétaxel (DTX) et l&#39;évérolimus (EVR) ont été choisis. Les deux DTX et EVR sont des composés peu solubles dans l&#39;eau avec solubilité dans l&#39;eau intrinsèques à 1,9 et 9,6 pg / ml respectivement. 7,8 Deux PEG-b -PLA polymères avec des poids moléculaires différents ont été utilisés dans ce protocole que les blocs de construction pour le polymère formulée à des micelles,ces polymères sont PEG 2000 - b -PLA 1800 (3800 Da) et le PEG 4000 - b -PLA 2200 (6200 Da). PEG-b de micelles -PLA peuvent donc fournir une plate-forme unique en tant que nanocarrier pour DTX et EVR individuellement et en combinaison. Les réactifs / Matériels et équipements requis nécessaires pour préparer et caractériser ces micelles sont énumérés dans le tableau 1.

<table><tbody><tr><td>PEG2000-b-PLA1800</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/2000</td><td>PLA MW peut être spécifié à la commande</td></tr><tr><td>PEG4000-b-PLA2200</td><td>Advanced Polymer Materials, Inc</td><td>6-01- PLA/4000</td><td>PLA MW peut être spécifié à la commande</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>D-1000</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Everolimus</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4040</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-AX0145-1</td><td>Grade HPLC ; 4 L</td></tr><tr><td>Flacon à fond rond</td><td>Glassco/VWR</td><td>89426-496</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>RV 10 Control Évaporateurs rotatifs</td><td>IKA Works</td><td>8025001</td><td>Rotoevaporator</td></tr><tr><td>Shimadzhu HPLC avec détecteur DAD</td><td>Shimadzhu</td><td></td><td>RP-HPLC</td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer casette de dialyse MWCO 7000</td><td>Thermo Scientific, Inc</td><td>66370</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>Tampon phosphate pH 7,4, 200 mM</td><td>VWR</td><td>100190-870</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Malvern NanoZS</td><td>Malvern Instruments, Royaume-Uni</td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>Filtre en nylon</td><td>Acrodisc/VWR</td><td>28143-242</td><td>13 mm ; 0,2&micro ; M</td></tr><tr><td>Acide phosphorique, NF</td><td>Spectrum Chemical/VWR</td><td>700000-626</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td><td></td><td>Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 Cartouche Rapid Resolution&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>866953-906</td><td>4.6 & fois ; 75 mm, 3,5 &#956 ; L</td></tr></tbody></table>

préparation et caractérisation de la personne et de multi-drogue loaded physiquement piégé micelles polymériques

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Copolymères séquencés amphiphiles comme bloc polyethyleneglycol- acide -polylactic (PEG b- PLA) peuvent auto-assembler dans des micelles-dessus de leur concentration micellaire critique formant noyaux hydrophobes entourés par des obus hydrophiles dans des environnements aqueux. Le noyau de ces micelles peut être utilisé pour charger, des médicaments peu solubles hydrophobes comme le docétaxel (DTX) et l&#39;évérolimus (EVR). Caractérisation systématique de la capacité de la structure micellaire et la charge de médicament est importante avant in vitro et in vivo peut être réalisée. Le but du protocole décrit ci-après est de fournir les étapes de caractérisation nécessaires à la réalisation des produits micellaires normalisés. DTX EVR et ont des solubilités intrinsèques de 1,9 et 9,6 pg / ml respectivement préparation de ces micelles peut être réalisé par coulée au solvant qui augmente la solubilité aqueuse de DTX et EVR à 1,86 et 1,85 mg / ml, respectivement. La stabilité des médicaments dans les micelles evald&#39;atténuations à la température ambiante pendant 48 heures indique que 97% ou plus des médicaments sont conservées en solution. La taille des micelles a été évaluée en utilisant la diffusion dynamique de la lumière et a indiqué que la taille de ces micelles est inférieure à 50 nm et dépend de la masse moléculaire du polymère. La libération du médicament à partir des micelles a été évaluée en utilisant la dialyse dans des conditions d&#39;évier à pH 7,4 à 37 o C pendant 48 h. Courbe résultats de l&#39;ajustement indiquent que la libération du médicament est entraîné par un premier processus de commande indiquant qu&#39;il est entraînée diffusion.

DTX individu ou micelles EVR et DTX et EVR DDM dans PEG-b -PLA micelles sont formulés avec succès dans les deux PEG 4000 - b -PLA 2 200 ou PEG 2000 - b -PLA 1800 (Figure 1). DTX, EVR, et le DDM ont montré une stabilité similaire dans PEG 4000 - b -PLA 2200 ou PEG 2000 - b -PLA 1 800 plus de 48 heures (Figure 2). Char...

L’objectif de ce protocole est de décrire la préparation et la caractérisation de médicaments physiquement piégés et peu solubles dans l’eau dans des systèmes micellaires d’administration de médicaments composés de copolymères séquencés amphiphiles.

Préparation et caractérisation de la personne et de multi-drogue Loaded Physiquement piégé micelles polymériques

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de décrire un processus étape par étape de préparation et de caractérisation de myocytes chargés en médicament avant leur évaluation dans des états pathologiques d'intérêt. Cette démarche s'effectue en préparant les myocytes selon la méthode de coulage en solvant afin de produire des myocytes reproductibles pour l'étude. Dans un second temps, la stabilité du chargement et la taille des myocytes sont évaluées, ce qui permet de déterminer leur capacité à intégrer et à conserver des concentrations cliniquement pertinentes.Ensuite, la vitesse de libération du médicament à partir des cellules my est déterminée afin de s'assurer que les cellules my possèdent des caractéristiques de libération in vitro appropriées avant d'évaluer leur stabilité in vivo. Les résultats montrent que des cellules my stables générées de façon reproductible peuvent fournir une plateforme permettant d'explorer la délivrance de médicaments dans divers états pathologiques, selon les techniques d'évaluation présentées ici. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que le chargement à l'équilibre ou les méthodes de dialyse, est

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