Etudier la fonction des protéines et le rôle de Altered Expression des protéines par les interférences des anticorps et des reconstructions tridimensionnelles

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier les fonctions des protéines et le rôle de l’expression modifiée des protéines de manière efficace et étroitement contrôlée. Ceci est réalisé en appliquant des anticorps pour réduire la quantité de protéines fonctionnelles disponibles pour la cellule. Pour ce faire, les anticorps sont couplés à un peptide nommé Chariot, qui médie un passage à travers les membranes cellulaires.

Ensuite, les structures cellulaires d’intérêt sont imagées et reconstruites en 3D afin d’évaluer les effets du traitement. Les résultats révèlent que les peptides Chariot sont particulièrement bien adaptés pour cibler les protéines nucléaires par interférence anticorps. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’interférence ARN sont que les anticorps introduits dans la cellule sont efficaces immédiatement et que le chercheur peut contrôler strictement le degré d’interférence en ajustant les doses d’anticorps.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des fonctions des protéines dans de nombreux types de cellules, elle est particulièrement intéressante pour cibler les protéines dans les cultures neuronales primaires, qui sont très sensibles aux traitements mais tolèrent très bien Chariot. En préparation, remettre en suspension la poudre de peptide Chariot lyophilisée dans de l’eau stérile à deux microgrammes par microlitre. Tapotez soigneusement le tube pour mélanger la poudre à la solution.

Préparez ensuite de petites aliquotes de travail, seulement deux microlitres sont nécessaires pour chaque réaction, et stockez les aliquotes à 20 degrés Celsius. Ensuite, préparez les cellules de mammifères pour la transfection en les ensemenceant dans une plaque de 24 puits avec un demi-millilitre de milieu contenant des antibiotiques. Lorsque vous utilisez des neurones, ensemencez les cellules uniquement dans les deux rangées centrales et à faible densité.

Les puits vides sont utiles plus tard. Faire vite. Les neurones en culture ne doivent pas être hors de l’incubateur pendant plus de quelques minutes.

Jusqu’à ce que les neurones soient au stade de développement souhaité, échangez environ un quart à la moitié de leur milieu deux fois par semaine. Des cultures non neuronales doivent être utilisées lorsque les cellules sont à 50 % de confluence. La procédure suivante est illustrée pour six tests et six échantillons de contrôle.

Pour chaque cargaison, préparez une dilution de 0,1 à 2 microgrammes dans 50 microlitres de 1X PBS par échantillon. Des complexes macromoléculaires d’anticorps primaires et secondaires pré-liés peuvent également être utilisés comme cargaison. Mélangez la solution avec un léger vortex, suivi d’une brève centrifugation.

Diluez ensuite deux microlitres de solution mère Chariot dans 50 microlitres de PBS pour chaque réaction. Utilisez des tubes séparés pour chaque échantillon afin d’éviter l’auto-association de Chariot. Maintenant, combinez les protéines préparées dans les dilutions Chariot.

Mélangez et essorez les protéines combinées. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes de cargaison Chariot. La quantité optimale de peptides protéiques dépend de la cargaison et du type de cellule utilisé.

Par conséquent, ce montant doit être déterminé empiriquement. À l’avance, préchauffez un milieu de croissance sans additifs ainsi qu’un PBS 1X contenant 0,5 millimolaire de chlorure de magnésium et de chlorure de calcium à 37 degrés Celsius. Maintenant, pour commencer, diluez les complexes Chariot préparés avec 100 microlitres de milieu.

Retirez le milieu des cellules plaquées et transférez-le dans les puits vides pour le réutiliser. Ensuite, lavez doucement les cellules avec 500 microlitres de solution préchauffée de chlorure de calcium et de magnésium 1X PBS. Appliquez le milieu transportant les complexes Chariot sur les cellules et secouez doucement la plaque pour assurer une distribution uniforme de la solution.

Remettez rapidement les cellules dans l’incubateur et attendez une heure avant de les précéder. Pour les neurones, après une heure d’incubation, transférez les milieux sauvegardés dans les puits. Pour toutes les autres cellules, ajoutez du sérum à une concentration finale de 10 %. Les neurones cultivés sont très sensibles, tels que les changements de température et de pH du milieu.

Par conséquent, ces cellules doivent être lavées et transfectées doucement avec des solutions préchauffées et renvoyées dans l’incubateur dès que possible. Poursuivez l’incubation aussi longtemps que nécessaire, en fonction de la cargaison transfectée et du type de cellule. Après l’incubation, traitez les cellules pour des analyses ultérieures comme d’habitude.

Les protocoles de fixation, ainsi que l’imagerie en direct, sont tous deux compatibles avec cette technique. À l’aide d’un microscope à balayage laser avec un objectif 63X, prenez des images à une distance d’environ 0,25 à 0,5 micron afin d’obtenir des piles Z suffisamment détaillées tout en évitant le blanchiment. La distance précise entre les couches dépend de la taille de la structure à reconstruire et doit être déterminée individuellement.

Pour la reconstruction d’images, ouvrez les fichiers LSM dans Imaris. Avec ce logiciel, le bouton Édr est utilisé pour basculer entre Sélectionner et Naviguer. De plus, plusieurs objets peuvent être sélectionnés en maintenant la touche Ctrl enfoncée.

À l’aide du réglage de l’affichage, accédez à chaque canal et ajustez le contraste jusqu’à ce que les structures les plus lumineuses atteignent la saturation. Ce réglage n’influence pas la construction de la surface, mais il aide à seuiller l’image. Si l’objet à reconstruire est contenu dans différents fichiers, utilisez la fonction Modifier et Ajouter des tranches pour combiner les fichiers correspondants.

Ensuite, cliquez sur l’icône Ajouter de nouvelles surfaces et sélectionnez Segmenter uniquement une région d’intérêt. Maintenant, ajustez les marges de la boîte de sélection pour qu’elles s’adaptent à l’objet qui vous intéresse. Ajustez la forme et l’inclinaison de la forme rectangulaire jusqu’à ce que toutes les structures requises se trouvent à l’intérieur de la boîte.

La sélection doit être ajustée dans chaque image tout au long du plan Z. Les objets indésirables peuvent être supprimés ultérieurement. Ensuite, sélectionnez un canal approprié.

Pour continuer, utilisez l’outil de seuillage pour reconstruire la structure d’intérêt. Le niveau de détail de la surface, ou le diamètre de la sphère, doit être défini pour correspondre aux structures en cours de reconstruction. En fonction des caractéristiques du signal, il est possible d’utiliser soit l’intensité absolue, soit le contraste local.

En général, le contraste local fonctionne mieux pour les signaux diffus. En raison des caractéristiques de ce signal, le contraste local est utilisé pour reconstruire la protéine à l’intérieur du noyau. Dans tous les cas, les paramètres doivent être ajustés séparément pour chaque signal ou structure d’intérêt.

Terminez la reconstitution en cliquant sur la flèche verte en bas de l’écran. Ajustez ensuite l’objet à l’aide de l’outil Crayon. Comparez soigneusement les reconstructions au signal d’origine, et coupez et supprimez des surfaces en inclinant les images selon les besoins afin que l’outil Couper puisse remplir son objectif avec précision.

Maintenant, mesurez le volume, la surface et les intensités de chaque surface en sélectionnant Statistiques, Statistiques détaillées et Valeurs moyennes. Si vous le souhaitez, vous pouvez produire des statistiques codées par couleur en sélectionnant l’onglet Couleur de la surface correspondante et en modifiant l’option sélectionnée de Base à Codé statistique. À l’aide de l’outil Take Snapshot, des photos peuvent être prises pour publication.

Si plusieurs objets d’une même région doivent être reconstruits, la fonction Stocker les paramètres peut être utilisée pour enregistrer les informations. Le simiate exprimé dans les cellules HEK293 a été spécifiquement détecté par les anticorps du simiate introduits dans les cellules par les peptides Chariot. Les assemblages d’anticorps Simiate pénètrent dans le soma ainsi que dans le noyau, après l’application, où ils co-localisent spécifiquement avec FLAG-Simiate, comme indiqué par les flèches jaunes.

De manière dose-dépendante, les anticorps Simiate ont induit une apoptose massive dans les cellules HEK293 tandis que les anticorps témoins n’ont eu aucun effet. Étant donné que les cellules neuronales sont très sensibles aux effets toxiques, la technique a été appliquée à des cultures primaires d’hippocampe où il n’y avait aucun effet sur la viabilité des neurones en comparant les cellules simulées ou non traitées et les cellules traitées par Chariot. Suivant le même schéma d’application, des assemblages d’anticorps anti-cochon d’Inde Alexa568 ont été observés dans environ 83 % des cellules où ils étaient présents dans les somates ainsi que dans les noyaux à des degrés divers.

Ces observations ont été étayées par une analyse 3D, qui était cohérente avec les résultats des cellules HEK293. Par conséquent, la technique du chariot peut être utilisée avec succès pour transfecter les neurones primaires dissociés de l’hippocampe. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à six heures si elle est correctement exécutée.

La formation complexe de Chariot et de la protéine d’intérêt prend environ 40 minutes. Pour transfecter les cellules avec ces complexes, il faudra 70 minutes et une à quatre heures supplémentaires en fonction de la taille et des propriétés de la cargaison. Suite à cette procédure, d’autres méthodes peuvent être mises en œuvre afin d’analyser plus en détail la fonction d’une protéine, telles que l’imagerie en direct et les tests de motilité, l’analyse et les enregistrements électrophysiologiques.