Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l'analyse de spectrométrie de masse
July 23rd, 2015
Ce protocole décrit une procédure d’enrichissement des protéines ECM à partir de tissus ou de tumeurs et de déglycosylation et digestion des préparations enrichies en ECM en peptides afin d’analyser leur composition protéique par spectrométrie de masse.
L’objectif général de cette procédure est de caractériser la composition des matrices extracellulaires des tissus par spectrométrie de masse. Ceci est accompli en perturbant d’abord le tissu sélectionné jusqu’à ce qu’il soit complètement homogénéisé. La deuxième étape consiste à décellulariser le tissu pour enrichir les protéines de la matrice extracellulaire tout en appauvrissant concomitamment tous les composants intracellulaires.
Ensuite, l’échantillon de protéines enrichi en ECM est dénaturé dans la dernière étape, l’échantillon de protéines enrichi en ECM dénaturé est déc-glycosylé et digéré en peptides. L’analyse sanguine Western est utilisée pour surveiller la qualité de la décellularisation et de l’enrichissement en protéines ECM. En fin de compte, l’analyse par spectrométrie de masse des peptides permet de caractériser la composition de l’ECM pour ce tissu particulier.
Cette méthode peut donner un aperçu de la composition de la matrice extracellulaire des tissus normaux, mais peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les tissus pathogènes comme le cancer. Pour commencer, préparez tous les tampons comme indiqué dans le protocole texte. Le premier tableau, y compris l’ajout d’inhibiteurs de la protéase.
Ensuite, perturbez 100 milligrammes de tissu dans 500 microlitres de tampon C avec un homogénéisateur de tissu jusqu’à l’obtention d’une suspension uniforme. Transférez l’homogénat dans un rotateur de tube et incubez pendant 20 minutes À quatre degrés Celsius, le tuyau contenait 10 à 20 microlitres de l’échantillon dans un tube étiqueté comme extrait de tissu total ou flash de matériel de départ. Congelez l’échantillon dans de l’azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.
Ensuite, centrifugez l’homogénat à 16 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Prélevez le surnageant dans un tube propre et étiquetez-le comme la fraction cytosolique ou C. Flash. Congelez la fraction C et conservez-la à moins 80 degrés Celsius.
Pipette là-bas. Suspendez la pastille dans 400 microlitres de tampon double, puis incubez sur un rotateur de tube pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon et jetez le surnageant pour extraire d’abord les protéines nucléaires.
Remettre la pastille en suspension dans 150 microlitres de tampon N et l’incuber sur un rotateur de tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez l’échantillon et collectez le surnageant dans un tube propre. Répéter l’incubation dans le tampon N après la centrifusion.
Combinez les surnageants et étiquetez-les comme la fraction nucléaire ou N. Flash. Congelez la fraction N pour l’entreposer à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 100 microlitres de tampon M et réuser, suspendre le granulé.
Ensuite, incubez l’échantillon sur un rotateur de tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avant de le centrifuger. Recueillir le surnageant dans un tube propre et l’étiqueter comme la membrane ou la fraction M flash. Congelez la fraction M et conservez-la à moins 80 degrés Celsius.
Remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon CS en pipetant vigoureusement, puis incuber l’échantillon sur un rotateur de tube pendant 30 minutes. À température ambiante, centrifugez l’échantillon pendant 30 minutes à température ambiante et recueillez le surnageant dans un tube propre et étiquetez-le comme la fraction cytosquelettique ou CS. La pastille doit maintenant être nettement plus petite.
Mettez à nouveau la pastille en suspension dans 150 microlitres de tampon C.Transférez l’échantillon dans un rotateur de tube et incubez-le pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifugez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et récupérez le surnageant. Ensuite, combinez le surnageant avec celui du tampon CS dans le tube déjà étiqueté comme fraction cytosquelettique ou CS. Flash.
Congelez la fraction CS et conservez-la à moins 80 degrés Celsius. Pour laver le granulé resus. Suspendez-le dans 500 microlitres de PBS puis incubez sur un rotateur de tube pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Centrifugez le tube et jetez le surnageant. Lavez trois fois au total. Pour obtenir la pastille enrichie en ECM, stockez une petite fraction de la fraction ECM pour l’analyse du contrôle qualité du bloc Western de l’expérience.
Congelez rapidement les fractions dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer la digestion. Tout d’abord, mettez en suspension la pastille enrichie en ECM dans de l’urée à huit molaires et ajoutez une solution de Dihi trois etol dans de l’eau pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaires.
Transférez le tube dans un incubateur et secouez-le à 1400 tr/min pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, refroidissez l’échantillon à température ambiante et ajoutez une solution d’acétamide iota reconstitué dans l’eau jusqu’à une concentration finale de 25 millimolaires. Incuber le mélange dans l’obscurité pendant 30 minutes.
À température ambiante, diluez à une concentration d’urée de deux molaires avec 100 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, puis ajoutez du P PGA F. Transférez l’échantillon dans un incubateur et agitez-le à 1400 tr/min pendant deux heures. À 37 degrés Celsius, ajoutez de l’endo-protéase, coupez C au mélange et secouez à 1400 tr/min pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez de la trypsine et secouez à 1400 tr/min pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
La solution trouble doit devenir claire après la digestion de la nuit à une deuxième quantité de trypsine et agiter pendant deux heures supplémentaires pour inactiver la pipette de trypsine à 50 % d’acide trifluoroacétique dans le mélange par incréments d’un microlitre jusqu’à ce que le pH soit inférieur à deux. Surveillez le pH en repérant un microlitre de la solution peptidique sur du papier pH. Centrifugez la solution pendant cinq minutes à température ambiante.
Enfin, recueillir le surnageant dans un tube propre à faible rétention. Conservez la solution peptidique ECM à moins 20 degrés Celsius. Les Western blots de la décellularisation du tissu pulmonaire miroir montrent l’extraction de composants intracellulaires tels que l’ASIN, la bêta, l’une d’actine, la GA, la dh et les histones dans les fractions intermédiaires.
Ces composants sont presque totalement absents de la fraction ECM, bien qu’une contamination mineure des histones subsiste. En revanche, le collagène 1 est fortement enrichi dans la fraction ECM, mais n’est pas détecté dans les autres fractions, ce qui suggère qu’aucun collagène n’est perdu lors des étapes intermédiaires de l’extraction. Des résultats similaires ont été obtenus avec un carcinome à mémoire humaine.
Le collagène de xénogreffe 1 était significativement enrichi dans la fraction ECM avec seulement une petite perte dans la fraction CS. Une certaine contamination résiduelle par l’actine est restée dans la fraction ECM après ses développements. Cette technique a ouvert la voie aux biologistes et aux cliniciens pour explorer la complexité de la matrice extracellulaire des tissus normaux et pathologiques.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour enrichir les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) à partir des tissus et analyser leur composition à l'aide de la spectrométrie de masse. Le processus implique la destruction des tissus, la décellularisation et la digestion ultérieure des peptides pour une analyse détaillée.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biochimie
- Spectrométrie de masse
Contexte
- Comprendre la composition de la MEC est crucial pour obtenir des informations sur la fonction et la pathologie des tissus.
- Cette méthode peut être appliquée aux tissus normaux et malades, y compris le cancer.
- La spectrométrie de masse fournit un outil puissant pour analyser des mélanges protéiques complexes.
- La décellularisation aide à isoler les protéines de la MEC en éliminant les composants cellulaires.
Objectif de l'étude
- Caractériser la composition protéique de la MEC à partir de divers tissus.
- Améliorer la compréhension des rôles de la MEC dans la santé et la maladie.
- Développer un protocole fiable pour l'analyse des protéines de la MEC.
Méthodes utilisées
- Homogénéisation et décellularisation des tissus pour enrichir les protéines de la MEC.
- Centrifugation séquentielle pour séparer les fractions cellulaires.
- Digestion peptidique utilisant des enzymes spécifiques pour l'analyse par spectrométrie de masse.
- Western blotting pour vérifier la qualité de l'enrichissement de la MEC.
Résultats principaux
- Le collagène était significativement enrichi dans la fraction de la MEC, indiquant une isolation efficace.
- Les composants intracellulaires ont été largement éliminés pendant le processus de décellularisation.
- L'analyse par spectrométrie de masse a révélé des profils détaillés des protéines de la MEC.
- Les résultats étaient cohérents entre différents types de tissus, y compris les tissus cancéreux.
Conclusions
- Le protocole isole et caractérise avec succès les protéines de la MEC.
- Cette méthode peut être appliquée à divers tissus à des fins de recherche.
- Les informations obtenues peuvent contribuer à la compréhension du rôle de la MEC dans les mécanismes de la maladie.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular matrix (ECM) composition enables target validation and biomarker discovery in fibrosis, cancer, and cardiovascular diseases. This method supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant ECM proteins for downstream mass spectrometry analysis. It provides predictive confidence in target selection by linking ECM remodeling to pathological mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ECM protein composition to validate therapeutic targets in disease-associated remodeling.
- Operational Value: Depletes intracellular contaminants to improve target specificity and reduce false positives in target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ECM-enriched peptide samples suitable for quantitative mass spectrometry-based screening of ECM modulators.
- Operational Value: Standardizes ECM isolation across tissue types, improving assay reproducibility and cross-platform comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling ECM profiling in normal and tumorigenic tissues.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating ECM changes with disease progression in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing ECM-specific molecular insights that inform early target prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating ECM fractions to clarify disease-associated matrix composition and pathway involvement.
- Screening: Enables assay-ready ECM peptide preparations for screening compounds that modulate ECM deposition or degradation.
- Analytics: Generates quantitative peptide readouts via mass spectrometry to compare ECM composition across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling ECM biomarker profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable ECM isolation platform applicable across multiple disease areas and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ECM-mediated signaling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization and digestion workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of ECM targets before costly preclinical investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on disease-specific ECM remodeling signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, protein biochemistry, and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on access to centrifuges, tube rotators, incubators, and low-retention tubes for peptide recovery.
- Necessitates standardization of buffer conditions and incubation times across laboratories for consistent ECM enrichment.
- Requires adaptation of buffer volumes and enzymatic digestion parameters for varying tissue densities and collagen content.
- Limited by potential co-isolation of highly abundant ECM proteins that may mask lower-abundance regulators in mass spectrometry detection.
