Name: Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Apprenez à fabriquer et calibrer des microélectrodes ioniques sélectives à double canon et concentriques pour mesurer les concentrations de sodium et de potassium extracellulaires dans des tranches de hippocampe de souris.

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Les auteurs tiennent à remercier C. Roderigo pour l&#39;assistance technique d&#39;experts. Nous remercions S. Köhler (Centre d&#39;imagerie avancée, Université Heinrich Heine de Düsseldorf) de l&#39;aide dans la production vidéo. Recherche dans le laboratoire de l&#39;auteur a été financé par l&#39;Association allemande pour la recherche (DFG: Ro 2,327 / 8-1 à CRR), l&#39;Université Heinrich Heine de Düsseldorf (NH) et par les Instituts nationaux de la Santé accorde R01NS032123 (à MC).

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

À base de liquide transporteur, électrodes sélectives d&#39;ions ont été utilisés avec succès depuis des décennies et pour de nombreux ions, des capteurs très spécifiques sont disponibles 22-26. Lorsqu&#39;il est utilisé dans l&#39;espace extracellulaire (ECS) des préparations de cerveau des vertébrés, il faut cependant garder à l&#39;esprit, que ce soit une technique très invasive: tandis que la largeur de l&#39;ECS est seulement autour de 20-50 nm, le diamètre de l&#39;ion-sélective microélectrodes est d&#39;environ 1 pm (électrodes à deux coups) ou plus (électrodes concentriques). Les conseils de microélectrodes sélectives d&#39;ions seront donc non seulement endommager les tissus pendant leur empalement du tissu, mais aussi agrandir l&#39;ECS, favorisant une sous-estimation des transitoires d&#39;ions. Malgré ces écueils, les transitoires d&#39;ions extracellulaires en réponse à l&#39;activité neuronale sont remarquablement cohérents entre les différents laboratoires 7,8, attestant de la fiabilité de cette méthode. La performance et la pertinence des électrodes sélectives d&#39;ionsest fonction de leur sensibilité et de sélectivité, qui est défini par le cocktail de capteur (&#39;ionophore à membrane liquide &quot;) utilisé. Cocktails de capteurs contiennent une molécule porteuse spéciale, par exemple valinomycine K + microélectrodes sélectifs qui présente une haute sélectivité pour le potassium 27. Nonobstant, la réactivité croisée avec d&#39;autres ions peut se produire et doit être testé. Valinomycine présente une réactivité croisée significative pour l&#39;ammonium, qui doit être considéré lors de l&#39;interprétation des résultats (par exemple 11,12). En outre, parce que la tension de réponse des ionophores en résulte un comportement de Nernst (cf. équation 1), le rapport signal sur bruit et seuil de détection dépend de la concentration de l&#39;ion à mesurer. Ainsi, tandis que les petites [K +] o transitoires évoquer de grandes variations de tension contre le faible niveau de référence [K +] o, petite [Na +] o transitoires sont beaucoup plus difficiles à détecter contre le salutgh référence [Na +] o (cf. Figure 5 et 6). La performance des électrodes sélectives d&#39;ions est également déterminée par la résolution temporelle, qui est largement régi par la constante de temps électrique. Celle-ci est principalement déterminée par la résistance axiale du capteur, et par la capacité répartie le long de la longueur de la pipette, entre ses solutions interne et le fluide externe. Dans la configuration à deux coups, la résistance est élevée, en raison de la longue colonne de capteur d&#39;ions remblayée. Pour un diélectrique isolante suivant (dans ce cas verre borosilicate), la capacité est régie par l&#39;épaisseur diélectrique. Dans électrodes à deux coups, la largeur diélectrique revient à la paroi de verre de la pipette. Comme le verre amincit près de la pointe, la largeur diélectrique tombe, et la capacité augmente. Ces facteurs se combinent pour produire des électrodes avec des temps de réponse qui vont de plusieurs centaines de millisecondes à plusieurssecondes, que ces facteurs sont variés. Un avantage majeur de la conception concentrique est que la résistance axiale et à la capacité du bain sont grandement diminuées. Les pipettes shunts concentriques plupart de la résistance de l&#39;échangeur d&#39;ions remblayé, laissant seulement un vestige dans les dernières micromètres avant la pointe. En outre, la solution de remplissage à l&#39;intérieur de la pipette concentrique est physiquement éloignée de la baignoire, séparés par l&#39;épaisseur de deux parois de verre, ce qui réduit considérablement la capacité. 10 Comme indiqué précédemment, l&#39;effet combiné de la résistance et de la capacité réduite est une amélioration de la résolution temporelle de deux ordres de grandeur. Dans le cas de concentriques Ca2 + et de pH microélectrodes, les temps de réponse de 90% étaient aussi bas que 10-20 ms 10. Un avantage connexe de la conception concentrique est le faible niveau de bruit (cf. Figure 8). En raison de la résistance considérablement réduit, les transitoires de tension de toute Ambient bruit sont minimisés. En outre, la récupération de ces transitoires est rapide, en raison de la constante de temps rapide. Ces artefacts sont donc petit et rapide, et ont un effet moins perturbateur sur les enregistrements physiologiques (cf. Figure 8). Il ya aussi des inconvénients de la technique concentrique. Tout d&#39;abord, leur assemblage est plus complexe et prend du temps. Un deuxième inconvénient est la nécessité de placer un micro-électrode de référence séparée avec sa pointe, entraînant l&#39;utilisation soit d&#39;un micromanipulateur séparé ou un double manipulateur spécialisé. Enfin, deux coups microélectrodes peuvent être étendus à une conception triple canon, ce qui permet la détection de deux espèces différentes d&#39;ions en même temps 28, ce qui est impossible pour des électrodes concentriques. Pièges les plus courants Silanisation inefficace. L&#39;étape la plus importante, et principal obstacle dans la fabrication de tout liquide-sensou microélectrode sélective d&#39;ions à base de la procédure de silanisation. Lorsque les électrodes ne parviennent pas à répondre aux changements dans la concentration d&#39;ions spécifiques, ou de répondre avec une réponse sous-nernstienne (bien au moins de 58 mV par différence de concentration dix fois), une mauvaise efficacité de silanisation est généralement la cause. Dans notre expérience, cela peut se produire si l&#39;humidité atmosphérique est trop élevée ou trop faible, typique des conditions à la hauteur de l&#39;été, ou en hiver, respectivement. Si il est possible d&#39;exercer un certain contrôle sur l&#39;humidité ambiante, ces problèmes peuvent être surmontés. Résistance d&#39;électrode est trop élevée. Si nécessaire, la résistance du corps sensible aux ions peut être réduite par chanfreinage. À cette fin, exposer sa pointe à un puissant jet d&#39;un abrasif en suspension dans l&#39;eau pendant quelques secondes. Cela entraînera sa pointe de upmost à casser et à réduire la résistance à la valeur souhaitée. Ponts sel. Seldes ponts entre les barils d&#39;ions et de référence entraînent électrodes mal ou aucun-réponse et peuvent donc aussi confondre grandement leur performance dans l&#39;étalonnage. Comme mentionné ci-dessus (voir point 1.6.), Cela est principalement un problème lorsque deux coups de verre thêta est choisi, mais est un événement rare lorsque vous utilisez le, la technique du canon tordu décalage décrit ici. Avec la facilité de fabrication à l&#39;esprit, la conception à double canon original de Lux 29 peut souvent être utilisé avec profit. Cette méthode utilise pré-remplissage des ions et de référence de barils avec des solutions salines, une exposition rapide à une solution de silane par son aspiration et l&#39;expulsion de la pointe, à la suite par incorporation de l&#39;échangeur d&#39;ions, également par la pointe (voir 30,31) . Ces électrodes peuvent être fabriquées dans environ 10 min, mais leur taille de la pointe est généralement 4 pm ou plus et ils sont plus enclins à l&#39;échec lors d&#39;une expérience. En revanche, les méthodes de silanisation qui impliquent l&#39;exposition aux vapeurs de silane et de la chaleurING peut produire des électrodes avec de petits conseils qui derniers jours et parfois des semaines. Pris dans leur ensemble, il existe plusieurs protocoles et des approches sur la façon de préparer des microélectrodes sélectives d&#39;ions. Ici, nous avons décrit deux procédures principales pour la fabrication de microélectrodes à deux coups ainsi que concentriques torsadés qui fonctionnent bien et de manière fiable dans nos laboratoires, avec un taux de réussite global de près de 100%. Fait important, ces techniques pourront être transférés à la mesure d&#39;autres espèces, y compris les ions calcium ou le pH, et sera également applicable à d&#39;autres préparations que le cerveau, y compris des cavités ou des liquides remplis de liquide en général. Dernier point, mais non le moindre, microélectrodes sélectives d&#39;ions permettent de déterminer les concentrations d&#39;ions à l&#39;intérieur des cellules. En raison de leur taille relativement grande de pointe (~ 1 pm), cette volonté, toutefois, être possible que dans les cellules avec un corps à grandes cellules, par exemple, comme on en trouve dans les préparations invertébrés 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

La signalisation électrique dans le cerveau est basée sur le flux d’ions à travers les membranes plasmiques. Les mouvements ioniques majeurs dans et depuis l’espace extracellulaire ne sont pas seulement médiés par le passage à travers des canaux ioniques voltage-dépendants, mais aussi par des récepteurs ionotropiques postsynaptiques ainsi que par des transporteurs d’ions. L’activité neuronale s’accompagne donc de modifications complexes de la concentration extracellulaire de tous les ions majeurs 1. Par exemple, il a été démontré que l’afflux de sodium dans les neurones pendant l’activité excitatrice entraîne une diminution de la concentration extracellulaire de sodium ([Na+]o) 2. Il en va de même pour la concentration extracellulaire en calcium, car les ions calcium pénètrent rapidement dans les structures pré- et postsynaptiques 3. Dans le même temps, le potassium se déplace dans la direction opposée, ce qui entraîne une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium ([K+]o) dans la plage de faibles mM 4,5. L’activité synaptique provoque également des changements dans le pH extracellulaire qui sont en partie atténués par des flux concomitants de membrane gliale qui modifient le pH intraglial 6,7. Ces changements liés à l’activité des concentrations d’ions extracellulaires ont des conséquences fonctionnelles importantes. Par exemple, même de petites augmentations de [K+]o dépolarisent les neurones ainsi que les cellules gliales, modifiant ainsi l’excitabilité neuronale, et plusieurs mécanismes existent pour éliminer l’excès de potassium 8. L’échec de ceux-ci peut entraîner une activité épileptiforme des neurones ou des phénomènes tels que la propagation de la dépression 1. 
En raison de leur importance critique, la détermination quantitative des concentrations d’ions extracellulaires est souvent nécessaire et requise pour comprendre la fonction et le dysfonctionnement des réseaux neuronaux dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Pendant des décennies, les microélectrodes sélectives d’ions à double canon se sont avérées être d’excellents outils pour de telles mesures dans le tissu cérébral 9. Pour de nombreux ions, des capteurs très spécifiques à faible réactivité croisée pour d’autres ions sont disponibles. En plus des électrodes classiques à double canon, des électrodes concentriques ont récemment été introduites. Ces derniers offrent une résolution temporelle supérieure, mais prennent un peu plus de temps et d’efforts pour en construire 10. 
Dans ce qui suit, nous décrirons la préparation et l’étalonnage de ces deux types de microélectrodes sélectives d’ions. Nous montrons ensuite comment ces électrodes peuvent être utilisées dans des préparations de coupes cérébrales pour mesurer les changements de [K+]o ou [Na+]o induits par l’activité excitatrice suivant différents paradigmes de stimulation, y compris l’application de médicaments par bain et par pression.

<table><tbody><tr><td>Abrasif&nbsp ; &nbsp ;</td><td>MicroPolish&nbsp ;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Dissous dans</td></tr><tr><td>les capillaires en verre borosilicaté</td> A.dest <td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Pipette d’application ; 75 mm x 2 mm, épaisseur de paroi 0,3 mm</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté avec filament</td><td>GC 150 F-15 ;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Pour le capteur de microélectrodes à double baril</td></tr>.<tr><td>Capillaires en verre borosilicaté à filament</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Pour la référence des microélectrodes à double baril</td></tr>.<tr><td>Capillaires en verre borosilicaté avec filament</td><td>GB-200TF-15&nbsp ;</td><td>Science Products</td><td>Concentrique, canal extérieur. D.E. 2,0 mm&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté avec filament</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Concentrique, canal intérieur. D.E. 1,2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur électromètre avec tête</td><td></td><td>Sur mesure</td><td>Rin = 10 T&Omega ; et Ibias=50 fA-1pA (alternatives disponibles dans le commerce : par exemple Dagan IX2-700, avec tête (résistance de rétroaction 10 Gig) ou EPMS-07, NPI, Tamm, Allemagne)</td></tr><tr><td>Chambre</td><td></td> expérimentale <td>Sur mesure</td><td>Disponible dans le commerce chez par exemple &nbsp ; Warner Instruments, États-Unis ; &nbsp ; Scientifica, UK</td></tr><tr><td>Furnace</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Doit rester constant à 200 &deg ; C</td></tr><tr><td>Cire collante dure / cire dentaire&nbsp ;</td><td>Deiberit 502&nbsp ;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td><td></td><td>chauffante Sur mesure</td><td>Doit rester constante à 40 &deg ; C</td></tr><tr><td>Porte-microélectrodes en plexiglas</td><td></td><td>Sur mesure</td><td>Double canon : D.E. &nbsp ; capillaires 1,5 mm, concentriques : D.E. capillaires 2 mm</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>MD4R</td><td>Stéréomicroscope Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>M205C</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Plan 0.8xLWD</td><td>Extracteur</td> de pipettes Leica <td></td></tr><tr><td></td><td>Modèle PP-830</td><td>Narishige</td><td>Microélectrodes concentriques&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur de pipettes</td><td>Modèle P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp ;</td><td>Capteur de microélectrodes concentriques&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système pneumatique d’éjection de médicament</td><td>Picospritzter Type II</td><td>General Valve TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Scène de voyage en queue d’aronde</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Colle à deux composants</td><td>&nbsp ; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>On peut également utiliser une petite bande de papier d’aluminium pour coller les capillaires ensemble.</td></tr><tr><td>Fil d’argent</td><td>99,9 %&nbsp ;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Trancheuse / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp ;</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur vertical&nbsp ;</td><td>Type PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Avec mandrin rotatif pour&nbsp ; microélectrodes à double canon</td></tr><tr><td>platine</td><td></td> de translation x/y <td>Fabrication</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus ;)-Méthiodide biculline</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>Antagoniste compétitif des récepteurs GABAA (sensible à la lumière) ; ATTENTION toxique</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/antagoniste des récepteurs kaïnate ; ATTENTION toxique</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagoniste des récepteurs NMDA ; ATTENTION</td></tr><tr><td>Hexaméthyldisilazane toxique (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>ATTENTION : Inflammable, toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation) et corrosif pour les métaux et la peau</td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Active les NMDA et les non-NMDA et EAAT</td></tr><tr><td>Sel monosodique de l’acide glutamique L-Glutamique hydraté</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Active NMDA-R, AMPA-R, QA-R et KA-R),&nbsp ; mGluRs et EAATs</td></tr><tr><td>Ionophore de potassium I - cocktail B</td><td>Fluka&nbsp ;</td><td>60403</td><td>À base de valinomycine ; ATTENTION toxique</td></tr><tr><td>Sodium ionophore II - cocktail A</td><td>Fluka&nbsp ; &nbsp ;</td><td>71178</td><td>Basé sur ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inhibiteur des canaux Na+ voltage-dépendants ; ATTENTION eau toxique</td></tr><tr><td>, ultra pure</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires ion dans le tissu cérébral

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

L’activité électrique dans le cerveau s’accompagne de flux ioniques importants à travers les membranes, entraînant des changements complexes dans la concentration extracellulaire de tous les ions majeurs. Comme ces décalages d’ions ont des conséquences fonctionnelles importantes, leur détermination quantitative est souvent nécessaire pour comprendre la fonction et le dysfonctionnement des réseaux neuronaux dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Dans la présente étude, nous démontrons la fabrication et l’étalonnage de microélectrodes sélectives d’ions à double canon, qui se sont avérées être d’excellents outils pour de telles mesures dans le tissu cérébral. De plus, des microélectrodes sélectives d’ions dites « concentriques » sont également décrites, qui, sur la base de leur conception différente, offrent une bien meilleure résolution temporelle des changements d’ions rapides. Nous montrons ensuite comment ces électrodes peuvent être utilisées dans les préparations de coupes cérébrales aiguës de l’hippocampe de souris. À l’aide de microélectrodes sélectives du potassium à double canon, des modifications de la concentration extracellulaire de potassium ([K+]o) en réponse à l’application exogène d’agonistes des récepteurs du glutamate ou au cours de l’activité épileptiforme sont mises en évidence. De plus, nous illustrons les caractéristiques de réponse des électrodes sensibles au sodium, à double canon et concentriques et comparons leur détection des changements dans la concentration extracellulaire de sodium ([Na+]o) évoquée par l’application de médicaments en bain ou en pression. Ces mesures montrent que si les amplitudes de réponse sont similaires, les microélectrodes concentriques de sodium présentent un rapport signal/bruit et un temps de réponse supérieurs à ceux de la conception à double barillet. En général, les modes opératoires démontrés seront facilement transposables à la mesure d’autres espèces d’ions, y compris le pH ou le calcium, et seront également applicables à d’autres préparations.

<html> Pour surveiller [K +] o et les changements qui y sont en réponse à l&#39;activité excitatrice, une microélectrode double canon potassium sélective a été inséré dans le stratum radiatum de la zone CA1. Quelques minutes après empalement, le canon à ions sélectif de l&#39;électrode atteint une ligne de base stable (figure 7A), ce qui correspond à un [K +] o d&#39;environ 2,8 mM, une valeur proche de la [K +] de l&#39;ACSF utilisé ( 2,5 mM). L&#39;application du bain de 0,5 mM de glutamate pendant 10 s induit une augmentation réversible de [K +] o d&#39;environ 4 mM, suivi d&#39;un sous-dépassement en dessous de la ligne de base d&#39;un montant de 0,7 mM ~ (figure 7A). L&#39;abaissement de la concentration de glutamate à 0,4, 0,3, et 0,2 mM a provoqué une réduction correspondante de l&#39;amplitude à la fois de l&#39;augmentation transitoire et le sous-dépassement en [K +] o (figure 7A). OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figure 7. transitoires de potassium extracellulaires en réponse à l&#39;activité excitatrice. (A) [K +] o transitoires, constitué par une augmentation suivie d&#39;un sous-dépassement en dessous de la ligne de base, induite par l&#39;application du bain de différentes concentrations de glutamate pendant 10 secondes comme indiqué. (B) Influence d&#39;une perfusion avec des bloqueurs de récepteurs de glutamate (CNQX, 100 uM; APV, 100 pM) et la tétrodotoxine (TTX; 0,5 uM) de [K +] o transitoires induits par l&#39;application du bain de 0,5 mM de glutamate pendant 10 s. (C) spontanée [K +] o transitoires en présence de 0mg 2+ / BIC. Les expériences présentées dans AC ont été effectuées en utilisant des électrodes à double canon. À titre d&#39;illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cla</a>beurk ici pour voir une version plus grande de cette figure. Des expériences antérieures ont montré que ces [K +] o signaux induite par le glutamate sont pas significativement modifiés lors de l&#39;application de TTX, et sont donc largement indépendante sur l&#39;ouverture des canaux sodiques voltage-dépendants et de l&#39;action neuronale potentiel de production de 15,16. Pour étudier les mécanismes sous-jacents les observées [K +] o changements en réponse au glutamate, nous avons appliqué les bloqueurs des récepteurs de glutamate, à savoir CNQX (100 M; bloqueur des récepteurs AMPA) et APV (100 M; bloqueur des récepteurs NMDA), en présence de TTX (0,5 uM). Après perfusion de salle de bain avec ces bloqueurs, induite par le glutamate [K +] o changements étaient pratiquement aboli, confirmant leur dépendance à l&#39;ouverture de canaux de ionotropes récepteurs du glutamate tel que rapporté avant (par exemple 17; figure 7B). Pour démontrer davantage tIl pertinence de glutamatergique excitation pour la génération de extracellulaire [K +] signaux, les tranches ont été perfusés avec nominalement Mg 2+ solution saline exempt contenant 10 uM bicuculline méthiodure (0mg 2+ / BIC). Cela soulage tension dépendant de Mg2 + -bloc des récepteurs de NMDA et atténue l&#39;inhibition par blocage des récepteurs GABA A, ce qui provoque l&#39;activité épileptiforme spontanée récurrent dans le réseau (par exemple 18,19). Comme prévu 20, spontanée, récurrente [K +] o transitoires, un montant d&#39;environ 1,5 mM ont été détectés dans 0mg 2+ / BIC solution saline (figure 7C). Entre ces réponses, plus petite [K +] o transitoires avec une amplitude moyenne d&#39;environ 0,2 mM a eu lieu (Figure 7C). Dans une deuxième série d&#39;expériences, nous avons utilisé [Na +] microélectrodes -sensibles pour déterminer [Na +] o changements évoqués par application deagonistes du glutamate. Ici, nous avons également comparé les caractéristiques des microélectrodes à double canon et concentriques employant deux paradigmes d&#39;application différents réponse. [Na +] des microélectrodes -sensibles été positionné dans le stratum radiatum à une profondeur d&#39;environ 50 uM. Après une ligne de base stable a été atteint, le glutamate agoniste de L-aspartate a été appliqué par perfusion de bain (à 10 mM, 120 secondes, le bain perfusion à raison de 2,5 ml / min). Comme observé précédemment 21, l&#39;application de l&#39;aspartate a provoqué une diminution lente dans [Na +] o d&#39;environ 15 mm, qui a duré environ 5 min, puis a commencé à recouvrer à la ligne de base (figure 8A). Notamment, tandis que les amplitudes des pics et cinétique des [Na +] o signaux déterminés par les deux électrodes étaient pratiquement identiques dans ces conditions, électrodes concentriques présentaient une base plus stable et un niveau de bruit inférieur (figure 8A). Pour tester la r<html> EPONSE caractéristiques des différentes électrodes dans un paradigme d&#39;application plus rapide, nous glutamate pression appliquée à travers une pipette en verre bien positionné dans le stratum radiatum à une distance de 20-40 um de la pointe de la microélectrode sélective d&#39;ions. 21 Comme on s&#39;y attendait, l&#39;application de glutamate (10 mM) pendant 200 ms a provoqué une baisse de la o (figure 8B) [Na +]. Les amplitudes de pointe de la [Na +] o diminution étaient dans la même gamme pour les deux types d&#39;électrodes (deux coups: de 4,5 à 13,5 mM, n = 14; concentriques: de 2,0 à 19,1 mM, n = 15). Cependant, contrairement aux résultats obtenus avec une lente perfusion de bain (voir ci-dessus), non seulement le rapport signal à bruit, mais également au cours du temps de la [Na +] o signaux détectés par les deux types d&#39;électrodes diffère de manière significative. Le délai moyen de pic était de 3,5 sec pour le double-canon et seulement 1,3 s pour les microélectrodes concentriques. homologues ve_content &quot;&gt; Ainsi, ces résultats démontrent et confirment la cinétique de réponse plus rapides de Na + microélectrodes sélectifs deux coups concentriques contre, (cf. Figure 6C et 8B), a également été noté que pour le Ca 2+ et pH-sélectifs 10 . Contrairement à la première étude, dans laquelle la stimulation synaptique à court éclater a été réalisée pour évoquer transitoires d&#39;ions rapides synaptiquement-induites, il y avait seulement une tendance, mais aucune différence significative dans amplitudes maximales moyennes entre électrodes concentriques et deux coups avec notre application paradigme. Cela est probablement dû au fait que la distance de la pipette d&#39;application de la pointe de la microélectrode sélective d&#39;ions varie d&#39;un facteur de deux (20 à 40 um) et, par conséquent, que la concentration de glutamate maximale à la région cible était pas le même dans les différentes expériences, obstruant toute différence existante dans amplitudes de pointe. (A) Haut retrace: Variation de la Voltage des barils de référence (V ref) d&#39;une électrode à double canon (trace noire pointillée) et une électrode concentrique (trace grise) en réponse à des changements dans le bain Na + concentration ([Na +] b) comme indiqué. A noter que les réponses de tension des deux électrodes sont pratiquement identiques. Traces de fond: Les changements dans la tension de (V +) de Na Na + d&#39;une électrode à double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) en réponse à des changements dans [Na +] b. Parcelles demi-logarithmiques de la [Na +] (b) B par rapport à la V Na + des deux électrodes. Terrain linéaire des données révèlent une pente d&#39;environ 48 mV pour les deux électrodes. (C) Réponse du V Na + d&#39;un double canon (trace noire) et une électrode concentrique (trace grise) à un changement rapide dans le [Na +] b à partir de 152 à 70 mm. A noter que le temps de l&#39;électrode concentrique de réponse est considérablement faster. À titre d&#39;illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figure 8: transitoires de sodium extracellulaires telles que détectées par des électrodes à double canon et concentriques. (A) des changements transitoires de V ref et [Na +] o induite par la perfusion de bain avec 10 aspartate mM pendant 120 secondes, comme indiqué par la barre. Les tracés supérieurs montrent un enregistrement effectué avec une électrode à double canon, les traces faibles ont été enregistrés en utilisant une électrode concentrique. (B) Les variations transitoires dans V ref et [Na +] o induite par l&#39;application de la pression locale avec 10 mM de glutamate pour 0.2 sec comme indiqué par la flèche. Les tracés supérieurs montrent un enregistrement effectué avec une électrode à double canon, les traces faibles ont été enregistrés en utilisant une électrode concentrique.Pointillés rouges représentent ajustements linéaires de la période entre le début du signal à son maximum. A noter que le temps de l&#39;électrode concentrique de réponse est nettement plus rapide dans ces conditions. À titre d&#39;illustration, des traces ont été lissées avec un filtre Sawitzky-Golay (largeur 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous démontrons la fabrication, l’étalonnage et les propriétés de deux types de microélectrodes sélectives d’ions (à double canon et concentrique) pour la mesure des concentrations d’ions dans le tissu cérébral. Ceux-ci sont ensuite utilisés dans la préparation de la coupe de l’hippocampe de souris pour montrer que l’activité excitatrice modifie les concentrations extracellulaires de potassium et de sodium.

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter et d'analyser la dynamique ionique dans l'espace extracellulaire du tissu cérébral. La mesure des transitoires ioniques est réalisée à l'aide d'électrodes microscopiques sélectives aux ions, qui peuvent être préparées selon un design à double canal ou concentrique. Dans un premier temps, les microélectrodes sont étalonnées dans la solution expérimentale.Ensuite, les électrodes sont insérées dans des tranches aiguës d'hippocampe de souris pour l'enregistrement, afin d'induire des déplacements ioniques extracellulaires ; le neurotransmetteur glutamate, ou un agoniste du glutamate, est alors administré. Le glutamate se lie et ouvre les récepteurs ionotropes situés au niveau des épines postsynaptiques, ce qui permet l'entrée de sodium et la sortie de potassium hors des cellules. En fin de compte, cela entraîne une diminution du sodium extracellulaire ainsi qu'une augmentation du potassium extracellulaire, qui sont détectées par les microélectrodes sélectives aux ions.Cette méthode est utilisée pour étudier la régulation des ions extracellulaires et les transitoires de fer induits par l'activité dans le cerveau. Nous décrivons ici la préparation et l'étalonnage de deux types d'électrodes microscopiques sélectives aux ions. Nous montrons comment elles peuvent être utilisées sur des tranches aiguës de tissu cérébral pour mesurer les variations du potassium ou du sodium extracellulaires en réponse à l'application de neurotransmetteurs.La procédure sera démontrée par Nicole Hark et Simon pour mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez une micropipette en verre borosilicaté avec filament destinée à la chambre sensible aux ions et une autre pour la chambre de référence ultérieure. Ensuite, utilisez une colle bi-composante ou une petite bande de feuille d'aluminium pour fixer ensemble les extrémités de la micropipette longue et de la micropipette courte.Chauffer la micropipette double dans un four à 60 degrés Celsius pendant une heure afin d'éliminer l'humidité résiduelle. Ensuite, conserver les électrodes dans un dessiccateur jusqu'à leur utilisation. Centrer la micropipette double dans un étireur vertical à l'aide d'une craie de revolver. Utiliser une craie pour éviter l'élongation de la micropipette.Conserver délicatement la bobine jusqu'à ce que le verre soit suffisamment ramolli pour permettre une rotation horizontale du revolver. Serrer à 180 degrés après refroidissement, puis retirer la rupture mécanique. Appliquer un second protocole de chauffage pour étirer le capillaire, obtenant ainsi deux capillaires doubles à extrémités effilées.Le diamètre de la pointe de la capillaire double doit être proche d'un micron. Remplissez maintenant le barillet de référence avec de l'eau distillée jusqu'à sa pointe afin d'éviter toute colonisation. Dans la procédure suivante, placez une capillaire double barillet avec sa pointe vers le haut sur un support sur mesure.Ensuite, placer ce support sur le flacon à large ouverture contenant le HMDS préalablement chauffé et incuber pendant 70 minutes. Après cela, transférer la capillaire sur un support métallique. Puis, la placer dans le four préchauffé pendant deux heures afin de sécher les deux compartiments après la colonisation ; conserver la capillaire sèche dans le dessiccateur jusqu’à utilisation.Le jour de l'expérience, préparez l'électrode ionique sélective en remplissant l'extrémité du barillet siliconé avec deux à trois microlitres du capteur ionique sélectif. Ensuite, remplissez le barillet en arrière avec une solution saline de chlorure de sodium à 100 millimolaire pour une microélectrode sensible au sodium ou avec une solution saline de chlorure de potassium à 100 millimolaire pour une microélectrode sensible au potassium. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air supplémentaires durant cette procédure.Si l’ionisation est réussie et que le capteur est correctement rempli, la surface du capteur doit apparaître comme une surface concave clairement visible par rapport au remplissage arrière. Ensuite, remplissez le canal de référence, puis insérez les fils d’argent chloruré dans les deux compartiments et scellez chaque compartiment avec de la cire dentaire. Dans cette procédure, étirez une capillarité de deux millimètres dans l’étireuse horizontale afin d’obtenir une pente courte et un diamètre de pointe de quatre micromètres.Juste avant utilisation, remplir la capillarité siliconée avec 0,2 microlitre de capteur. Pour préparer la capillarité interne, étirer une capillarité de petit diamètre afin d'obtenir deux capillarités présentant des embouts effilés longs et des pointes fines. Puis les remplir avec une solution saline de chlorure de sodium 100 millimolaire ou de chlorure de potassium 100 millimolaire.Placer la capillarité remplie du capteur et la capillarité remplie de solution saline directement alignées l'une avec l'autre sur un bouchon sur mesure fabriqué à partir de lamelles. Insérer partiellement la capillarité plus petite dans la capillarité plus grande. Ensuite, fixer les capillarités sur une autre lamelle.À l’aide d’argile de modelage, transférez les capillaires sur la platine d’un microscope et observez-les avec un grossissement de 100 x. À l’aide d’une tige en verre fixée sur un micromanipulateur, faites avancer lentement le capillaire externe sur le capillaire interne jusqu’à ce que la distance entre leurs extrémités soit d’environ cinq micromètres. Fixez l’extrémité ouverte du capillaire externe sur le capillaire interne à l’aide de cire dentaire et insérez un fil d’argent.Pour préparer l'électrode de référence, tirez une capillarité avec filament dans un tireur vertical, jetez la pipette supérieure, puis ouvrez le mandrin inférieur et soulevez la pipette inférieure d'environ cinq millimètres. Refermez le mandrin et soulevez-le jusqu'à ce que l'extrémité de l'électrode inférieure soit positionnée à environ cinq millimètres au-dessus de la bobine chauffante. Chauffez ensuite la bobine et utilisez une pince pour courber l'extrémité d'environ 45 degrés sur le côté.Repliez-le à nouveau d'environ moins 45 degrés pour rediriger la pointe parallèlement à l'axe principal. Ensuite, remplissez le barillet de référence avec du sel tamponné en excès. Insérez un fil d'argent chloruré à l'intérieur et scellez le barillet avec de la cire dentaire.À cette étape, fixez à la fois l'électrode sensible aux ions et l'électrode de référence sur des micromanipulateurs et abaissez-les dans une chambre expérimentale perfusée avec un liquide céphalorachidien artificiel (A CSF). Sous le microscope stéréo, reliez les fils d'argent chlorurés aux entrées respectives de la tête d'amplification de l'amplificateur différentiel. Déterminez ensuite les résistances des électrodes.Après cela, ajustez les signaux de tension à zéro et commencez l'enregistrement pour l'étalonnage. Une fois qu'une ligne de base stable est obtenue, passez à la solution saline contenant des concentrations définies de l'ion à mesurer. Placez ensuite une tranche d'hippocampe de 250 microns d'épaisseur dans la chambre expérimentale et fixez-la à l'aide d'une grille.Abaisser la microélectrode sélective aux ions calibrée sur la surface de la tranche. Ensuite, abaisser davantage l'électrode d'environ 50 micromètres dans la strate radiatum de la région CA1. Pour appliquer l'agoniste du neurotransmetteur, remplir la pipette d'application avec 0,5 millimolaire de glutamate.Fixez la pipette à un micromanipulateur et couplez-la à un dispositif d'application de pression. Ensuite, abaissez la pipette d'application dans le tissu et placez-la soigneusement à proximité de l'extrémité de l'électrode microscopique sélective aux ions. Commencez l'application de pression à 40 millibars.On observe ici la variation du voltage des barillets de référence d'une électrode double barillet et d'une électrode concentrique en réponse aux changements de la concentration de sodium dans le bain. Et voici les variations du voltage du potentiel de sodium d'une électrode double barillet et d'une électrode concentrique en réponse aux changements de la concentration de sodium dans le bain. Cette figure présente le tracé semi-logarithmique de la concentration de sodium dans le bain en fonction du voltage du potentiel de sodium des deux électrodes.Les tracés linéaires révèlent une pente d'environ 48 millivolts pour les deux électrodes. Voici la réponse d'une électrode double cannelée et d'une électrode concentrique à un changement rapide dans le bain. Concentration en sodium passant de 152 millimolaire à 70 millimolaire.Remarquez que le temps de réponse de l'électrode concentrique est nettement plus rapide. Cette figure montre le transitoire de sodium extracellulaire tel qu'enregistré par des électrodes doubles canons et concentriques ; les variations transitoires du voltage des canons de référence et de la concentration extracellulaire de sodium ont été induites par une perfusion du bain avec 10 millimolaire d'aspartate pendant 120 secondes, comme indiqué par la barre. Dans cette figure, les variations transitoires du voltage des canons de référence et de la concentration extracellulaire de sodium ont été induites par une application locale sous pression de 10 millimolaire de glutamate pendant 0,2 seconde.Remarquez que le temps de réponse de l'électrode conale est nettement plus rapide dans cette condition. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le silence adéquat constitue l'étape clé pour la fabrication réussie de microélectrodes sensibles au fer. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et utiliser ces électrodes pour la détection du fer extracellulaire transitoire dans le tissu cérébral.

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Construction de microélectrodes de potentiel de champ local pour des enregistrements in vivo à partir de plusieurs structures cérébrales simultanément

Un système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique est proposé pour stimuler la stimulation magnétique transcrânienne du cerveau de la souris in vivo. En utilisant des électrodes à vis conventionnelles avec un substrat multi-électrodes flexible sur mesure, l’enregistrement multisite peut être effectué à partir du cerveau de la souris en réponse à la stimulation magnétique transcrânienne.

Système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique pour stimuler transcrânalement le cerveau de la souris in vivo

Apprenez à fabriquer et calibrer des microélectrodes ioniques sélectives à double canon et concentriques pour mesurer les concentrations de sodium et de potassium extracellulaires dans des tranches de hippocampe de souris.

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

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