Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

L'objectif général de cette procédure est de détecter et d'analyser la dynamique ionique dans l'espace extracellulaire du tissu cérébral. La mesure des transitoires ioniques est réalisée à l'aide d'électrodes microscopiques sélectives aux ions, qui peuvent être préparées selon un design à double canal ou concentrique. Dans un premier temps, les microélectrodes sont étalonnées dans la solution expérimentale.

Ensuite, les électrodes sont insérées dans des tranches aiguës d'hippocampe de souris pour l'enregistrement, afin d'induire des déplacements ioniques extracellulaires ; le neurotransmetteur glutamate, ou un agoniste du glutamate, est alors administré. Le glutamate se lie et ouvre les récepteurs ionotropes situés au niveau des épines postsynaptiques, ce qui permet l'entrée de sodium et la sortie de potassium hors des cellules. En fin de compte, cela entraîne une diminution du sodium extracellulaire ainsi qu'une augmentation du potassium extracellulaire, qui sont détectées par les microélectrodes sélectives aux ions.

Cette méthode est utilisée pour étudier la régulation des ions extracellulaires et les transitoires de fer induits par l'activité dans le cerveau. Nous décrivons ici la préparation et l'étalonnage de deux types d'électrodes microscopiques sélectives aux ions. Nous montrons comment elles peuvent être utilisées sur des tranches aiguës de tissu cérébral pour mesurer les variations du potassium ou du sodium extracellulaires en réponse à l'application de neurotransmetteurs.

La procédure sera démontrée par Nicole Hark et Simon pour mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez une micropipette en verre borosilicaté avec filament destinée à la chambre sensible aux ions et une autre pour la chambre de référence ultérieure. Ensuite, utilisez une colle bi-composante ou une petite bande de feuille d'aluminium pour fixer ensemble les extrémités de la micropipette longue et de la micropipette courte.

Chauffer la micropipette double dans un four à 60 degrés Celsius pendant une heure afin d'éliminer l'humidité résiduelle. Ensuite, conserver les électrodes dans un dessiccateur jusqu'à leur utilisation. Centrer la micropipette double dans un étireur vertical à l'aide d'une craie de revolver. Utiliser une craie pour éviter l'élongation de la micropipette.

Conserver délicatement la bobine jusqu'à ce que le verre soit suffisamment ramolli pour permettre une rotation horizontale du revolver. Serrer à 180 degrés après refroidissement, puis retirer la rupture mécanique. Appliquer un second protocole de chauffage pour étirer le capillaire, obtenant ainsi deux capillaires doubles à extrémités effilées.

Le diamètre de la pointe de la capillaire double doit être proche d'un micron. Remplissez maintenant le barillet de référence avec de l'eau distillée jusqu'à sa pointe afin d'éviter toute colonisation. Dans la procédure suivante, placez une capillaire double barillet avec sa pointe vers le haut sur un support sur mesure.

Ensuite, placer ce support sur le flacon à large ouverture contenant le HMDS préalablement chauffé et incuber pendant 70 minutes. Après cela, transférer la capillaire sur un support métallique. Puis, la placer dans le four préchauffé pendant deux heures afin de sécher les deux compartiments après la colonisation ; conserver la capillaire sèche dans le dessiccateur jusqu’à utilisation.

Le jour de l'expérience, préparez l'électrode ionique sélective en remplissant l'extrémité du barillet siliconé avec deux à trois microlitres du capteur ionique sélectif. Ensuite, remplissez le barillet en arrière avec une solution saline de chlorure de sodium à 100 millimolaire pour une microélectrode sensible au sodium ou avec une solution saline de chlorure de potassium à 100 millimolaire pour une microélectrode sensible au potassium. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air supplémentaires durant cette procédure.

Si l’ionisation est réussie et que le capteur est correctement rempli, la surface du capteur doit apparaître comme une surface concave clairement visible par rapport au remplissage arrière. Ensuite, remplissez le canal de référence, puis insérez les fils d’argent chloruré dans les deux compartiments et scellez chaque compartiment avec de la cire dentaire. Dans cette procédure, étirez une capillarité de deux millimètres dans l’étireuse horizontale afin d’obtenir une pente courte et un diamètre de pointe de quatre micromètres.

Juste avant utilisation, remplir la capillarité siliconée avec 0,2 microlitre de capteur. Pour préparer la capillarité interne, étirer une capillarité de petit diamètre afin d'obtenir deux capillarités présentant des embouts effilés longs et des pointes fines. Puis les remplir avec une solution saline de chlorure de sodium 100 millimolaire ou de chlorure de potassium 100 millimolaire.

Placer la capillarité remplie du capteur et la capillarité remplie de solution saline directement alignées l'une avec l'autre sur un bouchon sur mesure fabriqué à partir de lamelles. Insérer partiellement la capillarité plus petite dans la capillarité plus grande. Ensuite, fixer les capillarités sur une autre lamelle.

À l’aide d’argile de modelage, transférez les capillaires sur la platine d’un microscope et observez-les avec un grossissement de 100 x. À l’aide d’une tige en verre fixée sur un micromanipulateur, faites avancer lentement le capillaire externe sur le capillaire interne jusqu’à ce que la distance entre leurs extrémités soit d’environ cinq micromètres. Fixez l’extrémité ouverte du capillaire externe sur le capillaire interne à l’aide de cire dentaire et insérez un fil d’argent.

Pour préparer l'électrode de référence, tirez une capillarité avec filament dans un tireur vertical, jetez la pipette supérieure, puis ouvrez le mandrin inférieur et soulevez la pipette inférieure d'environ cinq millimètres. Refermez le mandrin et soulevez-le jusqu'à ce que l'extrémité de l'électrode inférieure soit positionnée à environ cinq millimètres au-dessus de la bobine chauffante. Chauffez ensuite la bobine et utilisez une pince pour courber l'extrémité d'environ 45 degrés sur le côté.

Repliez-le à nouveau d'environ moins 45 degrés pour rediriger la pointe parallèlement à l'axe principal. Ensuite, remplissez le barillet de référence avec du sel tamponné en excès. Insérez un fil d'argent chloruré à l'intérieur et scellez le barillet avec de la cire dentaire.

À cette étape, fixez à la fois l'électrode sensible aux ions et l'électrode de référence sur des micromanipulateurs et abaissez-les dans une chambre expérimentale perfusée avec un liquide céphalorachidien artificiel (A CSF). Sous le microscope stéréo, reliez les fils d'argent chlorurés aux entrées respectives de la tête d'amplification de l'amplificateur différentiel. Déterminez ensuite les résistances des électrodes.

Après cela, ajustez les signaux de tension à zéro et commencez l'enregistrement pour l'étalonnage. Une fois qu'une ligne de base stable est obtenue, passez à la solution saline contenant des concentrations définies de l'ion à mesurer. Placez ensuite une tranche d'hippocampe de 250 microns d'épaisseur dans la chambre expérimentale et fixez-la à l'aide d'une grille.

Abaisser la microélectrode sélective aux ions calibrée sur la surface de la tranche. Ensuite, abaisser davantage l'électrode d'environ 50 micromètres dans la strate radiatum de la région CA1. Pour appliquer l'agoniste du neurotransmetteur, remplir la pipette d'application avec 0,5 millimolaire de glutamate.

Fixez la pipette à un micromanipulateur et couplez-la à un dispositif d'application de pression. Ensuite, abaissez la pipette d'application dans le tissu et placez-la soigneusement à proximité de l'extrémité de l'électrode microscopique sélective aux ions. Commencez l'application de pression à 40 millibars.

On observe ici la variation du voltage des barillets de référence d'une électrode double barillet et d'une électrode concentrique en réponse aux changements de la concentration de sodium dans le bain. Et voici les variations du voltage du potentiel de sodium d'une électrode double barillet et d'une électrode concentrique en réponse aux changements de la concentration de sodium dans le bain. Cette figure présente le tracé semi-logarithmique de la concentration de sodium dans le bain en fonction du voltage du potentiel de sodium des deux électrodes.

Les tracés linéaires révèlent une pente d'environ 48 millivolts pour les deux électrodes. Voici la réponse d'une électrode double cannelée et d'une électrode concentrique à un changement rapide dans le bain. Concentration en sodium passant de 152 millimolaire à 70 millimolaire.

Remarquez que le temps de réponse de l'électrode concentrique est nettement plus rapide. Cette figure montre le transitoire de sodium extracellulaire tel qu'enregistré par des électrodes doubles canons et concentriques ; les variations transitoires du voltage des canons de référence et de la concentration extracellulaire de sodium ont été induites par une perfusion du bain avec 10 millimolaire d'aspartate pendant 120 secondes, comme indiqué par la barre. Dans cette figure, les variations transitoires du voltage des canons de référence et de la concentration extracellulaire de sodium ont été induites par une application locale sous pression de 10 millimolaire de glutamate pendant 0,2 seconde.

Remarquez que le temps de réponse de l'électrode conale est nettement plus rapide dans cette condition. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le silence adéquat constitue l'étape clé pour la fabrication réussie de microélectrodes sensibles au fer. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer et utiliser ces électrodes pour la détection du fer extracellulaire transitoire dans le tissu cérébral.