Génération et analyse quantitative des pulsé basse fréquence échographie pour déterminer la sensibilité de Sonic traité et non traité cellules néoplasiques

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer l’efficacité et la reproductibilité des ultrasons pulsés à basse fréquence dans l’endommagement des populations de cellules leucémiques humaines en l’absence ou en présence d’un agent appauvrissant le cholestérol. Ceci est réalisé en nettoyant le système de sonication et en évaluant sa stabilité. Les cellules leucémiques humaines sont alors soniquées en l’absence et en présence de méthylbêta-cyclodextrine.

Ensuite, des compteurs de cellules automatisés sont utilisés pour évaluer la viabilité cellulaire et les effets de la sonication et de l’épuisement du cholestérol. Sur l’activité mitochondriale des cellules leucémiques sont évaluées par le test XTT. En fin de compte, les données suggèrent que les ultrasons à basse fréquence peuvent être utilisés pour endommager les cellules malignes, ce qui est potentialisé par l’utilisation d’un agent appauvrissant le cholestérol.

Notre laboratoire s’intéresse à la thérapie par sonar, une nouvelle modalité thérapeutique qui combine les effets antinéoplasiques des ultrasons avec des agents spécialisés pour amplifier les effets du son. Notre protocole évalue la sensibilité sonique des cellules néoplasiques et normales et détermine des approches anothérapeutiques potentielles qui justifient une investigation préclinique plus approfondie. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir du mal avec l’équipement utilisé pour évaluer la stabilité du système Soo, car il peut s’écouler un certain temps avant d’apprendre à appliquer ces dispositifs de manière optimale.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les procédures de nettoyage et de stabilisation utilisées pour évaluer le système de sonication sont impératives pour obtenir des résultats reproductibles. Avant de commencer une expérience, utilisez du chloroforme et un coton-tige pour nettoyer l’union entre le klaxon et le convertisseur. Ensuite, appliquez une huile légère sur les filets du klaxon et du convertisseur.

Pour éliminer davantage les copeaux de métal, la rouille ou l’accumulation d’oxydation, retirez l’huile et tout autre contaminant de l’union avec plus de chloroforme et rattachez le klaxon au convertisseur. Pour coupler correctement le système, retirez le klaxon du bas de la coupelle et placez une clé à douille à l’intérieur de l’un des trois petits trous près du haut du convertisseur. Maintenant, placez une clé dynamométrique équipée d’une patte d’oie d’un demi-pouce sur la partie fendue du klaxon et serrez dans le sens standard des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le couplemètre indique 39,99 pieds-livres.

Après le serrage, remettez le convertisseur et le klaxon dans la coupelle et montez les pièces sur un support à anneaux en position verticale, rattachez le convertisseur à l’alimentation électrique, puis réglez le système pour le dosage par impulsions. À l’aide d’une seconde de sonication avec une seconde entre les impulsions, ajustez ensuite le système aux amplitudes souhaitées pour évaluer l’intensité et le fonctionnement du système de feu du sauna. Commencez par tenir le compteur de cavitation à 1,5 centimètre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles à la face de la sonde du compteur.

Lisez l’écran du compteur de cavitation pour confirmer que le système fonctionne à l’intensité appropriée. Ensuite, immergez complètement le capteur de l’hydrophone dans un flacon d’échantillon contenant 12,5 millilitres d’eau et utilisez le support à anneaux pour suspendre l’hydrophone. Pour confirmer la stabilité des caractéristiques de la forme d’onde, fixez l’hydrophone à l’entrée de l’oscilloscope et confirmez la présence d’une onde sinusoïdale claire car les ondes aberrantes peuvent modifier la fréquence du système.

Pour préparer les cellules à la sonication Tout d’abord, ensemencez-les à quatre fois 10 des quatrièmes cellules par millilitre dans un flacon de 25 centimètres carrés en utilisant un milieu fraîchement préparé. Après avoir déterminé le nombre de cellules viables par exclusion du triam blue, incubez la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la culture ait atteint la concentration souhaitée. Lorsque les cellules sont prêtes pour la sonication, utilisez un vide et une fiole pour dégazer un volume d’eau distillée déminéralisée.

Utilisez ensuite l’eau pour remplir la corne de la tasse jusqu’à 15 millimètres au-dessus du haut de la corne. Faites fonctionner le système avec l’eau Degas pendant environ sept minutes. Transférez ensuite trois millilitres de cellules dans un flacon à scintillation en verre de 20 millilitres et fixez le flacon au dispositif de maintien.

Ensuite, fixez le dispositif de maintien au sommet de la corne de la tasse et utilisez le mécanisme coulissant pour régler le dispositif de maintien à une élévation de 15 millimètres du haut de la corne à la surface de l’eau. Maintenant, sonisez les cellules à l’aide de trois impulsions d’ultrasons d’une seconde avec un espacement d’une seconde entre chacune des impulsions à 33 et 50 % d’amplitude, évaluez la viabilité cellulaire après sonication par exclusion du bleu triam. Pour évaluer les dommages cellulaires, rincez l’ouverture d’un analyseur de particules Z deux au moins deux fois avec une solution saline isotonique.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules soniquées dans 20 millilitres de solution saline isotonique et transférez l’échantillon de cellule dans le support du compteur. Ensuite, soulevez la plate-forme jusqu’à l’ouverture et analysez les dommages aux cellules, la viabilité et les débris selon les instructions du fabricant. Pour évaluer la viabilité des cellules soniquées par le test XTT, sonicez les cellules en utilisant une plage de un à trois.

Une seconde d’impulsions espacées, espacées d’une seconde, pour développer une gamme de dommages que le kit XTT doit évaluer, puis faire tourner les cellules vers le bas et remettre les granulés en suspension à une fois 10 des cinquièmes cellules par millilitre dans un milieu de croissance fraîchement préparé. Graine suivante, 100 microlitres de cellules par puits dans un appartement individuel. Fond 96, plaques de microtitration à puits et triple, y compris trois puits de contrôle contenant 100 microlitres de milieu de croissance complet seul pour les lectures d’absorbance à blanc.

Incuber les cellules pendant 24 heures le matin du test, faire tourbillonner doucement des aliquotes de 37 degrés Celsius, des réactifs XTT et d’activation chauffés jusqu’à ce que les solutions soient claires. Ajoutez ensuite 0,1 millilitre du réactif d’activation à un Eloqua de cinq millilitres du réactif XTT. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de la solution XTT activée dans chaque puits des plaques inoculées U 9 37 et THP one et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.

Au bout de deux heures, secouez doucement les plaques pour répartir uniformément le colorant orange dans les puits positifs et mesurez l’absorbence sur un lecteur de plaques de microtitration entre 450 et 500 nanomètres. Enfin, mesurez à nouveau l’absorbence de tous les puits d’essai, entre 630 et 690 nanomètres. Comme prévu, des dommages cellulaires plus étendus sont observés dans la population cellulaire soniquée à 50 % qu’à l’amplitude 33 %.

L’amplitude de 33 % permet toutefois de détecter d’autres dommages lors de l’application d’agents. Comme dans cette expérience dans laquelle les effets dose-dépendants de l’agent appauvrissant le cholestérol méthyl bêta cyclodextrine. Lors de la potentialisation, la sensibilité aux ultrasons des cellules U 9 37 a été évaluée.

Bien que la viabilité des cellules non traitées à la méthylbêta-cyclodextrine ait été similaire à celle des cellules non traitées, la viabilité a nettement chuté après l’application de trois impulsions d’une seconde à une échographie de 40 kilohertz. De plus, la diminution de la viabilité après sonication semble avoir été dépendante de la dose, car cinq millimolaires de l’agent appauvrissant le cholestérol ont produit la plus forte baisse du nombre de cellules, suivis d’un millimolaire et de 0,5 millimolaire de traitements avec de la méthylbêta-cyclodextrine, comme évalué par le test XTT. Bien que les cellules THP one semblaient être légèrement plus résistantes au sonique que les cellules U 9 37, les deux lignées cellulaires de leucémie humaine ont été endommagées de manière dose-dépendante.

De plus, le couplage de concentrations plus élevées de méthylbêta-cyclodextrine avec un plus grand nombre d’impulsions ultrasonores a produit la réduction la plus faible de XTT en un dérivé orange soluble de couleur vive pour les cellules U 9 37 et THP one, correspondant à une viabilité cellulaire et une activité mitochondriale plus faibles pour les deux lignées cellulaires. À la suite de cette procédure, d’autres agents sensibilisants soniques tels que les agents producteurs d’espèces à action cytosquelettique ou réactive peuvent être évalués pour leur potentialisation de la sensibilité sonique, établissant ainsi de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent être étudiées pour leur efficacité clinique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’organiser correctement les données SON acquises à partir des compteurs TC et Z deux, car elles fournissent des informations détaillées sur l’efficacité du protocole de traitement qui peuvent être perdues.

Si aucun schéma logistique n’est utilisé Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les ultrasons à basse fréquence en combinaison avec des sensibilisants anologiques potentiels dans des modèles précliniques in vitro pour évaluer leur utilité thérapeutique potentielle.