Name: Approche génétique de lavant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules ES (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Découvrez une méthode de criblage haut débit pour identifier les gènes de résistance au stress dans les cellules ES murines. Cette approche permet de générer des modèles souris pour étudier la longévité et améliorer la santé.

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Nous tenons à remercier le Wellcome Trust Sanger Institute pour les dons de piggyBac transposon et piggyBac transposase. Ce travail a été soutenu par la bourse Butcher du Colorado et le NIH R01 AG041801 (W.S.C).

<ol><li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+also+mediate+increased+resistance+to+stress+and+prevent+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease.</a> J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).</li>
<li>Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+stress+resistance+in+cells+from+long-lived+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice.</a> Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).</li>
<li>Perez, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overexpression+of+major+antioxidant+enzymes+does+not+extend+the+lifespan+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice.</a> Aging Cell. 8, 73-75 (2009).</li>
<li>Martin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+mice+to+test+the+oxidative+damage+theory+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging.</a> Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).</li>
<li>Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+mutant+phenotypes+from+ES+cells+to+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice.</a> Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).</li>
<li>Ramirez-Solis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+splinkerette-PCR+method+for+the+isolation+and+sequencing+of+retroviral+insertion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites.</a> Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).</li>
<li>Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+piggyBac+transposon-based+genome-wide+library+of+insertionally+mutated+Blm-deficient+murine+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells.</a> Genome Res. 19, 667-673 (2009).</li>
<li>Chick, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+stress-resistance+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening for stress-resistance mutations in the mouse.</a> Front Genet. 5, 310(2014).</li>
<li>Salmon, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cell+lines+from+young+adult+mice+of+long-lived+mutant+strains+are+resistant+to+multiple+forms+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36, 543-544 (2015).</li>
<li>Baker, K. E., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+terminating+erroneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression.</a> Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).</li>
<li>Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+nonsense-mediated+mRNA+decay+permits+unbiased+gene+trapping+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).</li>
<li>Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+mouse+mutations+in+embryonic+stem+cells+by+use+of+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling.</a> Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’analyse génétique directe permet une interrogation impartiale du génome à la recherche de gènes responsables d’un phénotype spécifique. Cette méthode est très puissante pour découvrir de nouvelles fonctions génétiques. Il a été largement utilisé chez les organismes inférieurs, mais pas chez les mammifères, tels que la souris, principalement en raison du coût extrêmement élevé associé à l’infrastructure et à la logistique que cela impliquerait. Ici, nous avons déplacé le processus de criblage génétique vers la platef...

Longévité a une relation intime avec la résistance au stress. En général, les espèces à long terme démontrent souvent une résistance accrue vers de multiples facteurs de stress, tels que le peroxyde d&#39;hydrogène, le paraquat (PQ), UV, de la chaleur, et des métaux lourds 1,2. En revanche, la sensibilité accrue au stress a tendance à prédire la durée de vie réduite et / ou un phénotype de la maladie plus sujette. La voie de balayage anti-oxydant a longtemps été supposé jouer un rôle important pour conférer une résistance au stress à l&#39;animal. Cependant, à quelques exceptions près, les études d&#39;une variété d&#39;animaux transgéniques à des manipulations dans divers enzymes anti-oxydantes (par exemple, SOD) indiquent que l&#39;augmentation du niveau d&#39;enzymes d&#39;évacuation des oxydants ne pas augmenter la durée de vie ou durée de la santé 3. Ces données suggèrent que le caractère de résistance au stress constamment observés chez des animaux à long terme est médiée par d&#39;autres voies cellulaires encore être découverts. Nous avons pris une avance impartialeapproche génétique pour identifier des gènes, qui sur muté, peut conférer un phénotype de résistance au stress chez souches embryonnaires (ES) de culture des cellules. Les cellules ES offrent deux avantages majeurs dans cette étude: (1) les manipulations génétiques sophistiqués sont disponibles pour modifier le génome des cellules ES; et (2) les cellules ES résistantes au stress récupérés de l&#39;écran peuvent être directement utilisés pour la production de la souris, ce qui permet la traduction rapide dans les études animales entières pour mesurer la durée de vie et la durée de la santé. Dans ce rapport, nous avons décrit l&#39;utilisation de la lignée cellulaire ES C9, dans laquelle les allèles BLM étaient sous le contrôle d&#39;un élément sensible à la tétracycline. Traitement de la doxycycline (Dox) transitoirement éteint l&#39;expression de Blm conduisant à une augmentation des incidents échange de chromatides sœurs. Ce court-terme Blm knock-out a permis la génération de mutations homozygotes sein de la population hétérozygote sorte que des mutations récessives pour la résistance au stress pourraient être capturés dans le processus de sélection. nousdécrit également l&#39;utilisation de piggyBac (PB) en tant que le transposon mutagene au hasard pour insérer un poly-Cassette de piégeage (PB-UPA) pour muter des gènes dans le génome. Les cellules avec la perturbation d&#39;un gène par la poly-Un piège est devenu résistant à G418 et pourraient être récupérés de sorte qu&#39;une collection de mutants de piégeage de gènes (bibliothèque de piégeage de gènes) pourrait être faite, et ensuite pour produire des clones mutants qui étaient résistant au stress. Les clones résistants au stress récupérés à partir de la sélection peuvent être caractérisés assez rapidement par des techniques moléculaires en ce qui concerne le nombre d&#39;insertions (qPCR), le site d&#39;insertion (splinkerette PCR), l&#39;identité du gène perturbé (BLAST), et son niveau d&#39;expression ( RT-qPCR). L&#39;insertion de PB pourrait être remobilisé par expression transitoire de MPB transposase dans le clone de restaurer la séquence d&#39;ADN de type sauvage et donc tester pour la perte de résistance au stress. Ce sont des moyens puissants pour confirmer la causalité de la mutation, ce qui devrait être fait avantpour la production de souris coûteux. Des études antérieures ont montré que les cellules exposées à des facteurs de stress ont perdu leur 4,5 pluripotence. Ainsi, dans ce protocole, la préservation d&#39;un jeu de répliques de cellules mutantes, qui ne serait pas traitée avec les facteurs de stress est critique pour la production de la souris succès. Notre laboratoire a conçu la lignée cellulaire ES C9 et le vecteur PB-UPA, les deux sont disponibles à d&#39;autres enquêteurs sur demande. Le protocole présenté ici va commencer par la génération de novo bibliothèque de cellules ES gène piégé avec PB-UPA (figure 1A), suivis par des répliques et la sélection de stress pour isoler des clones résistants au stress (figure 1B). Nous avons démontré la sélection avec le paraquat, un puissant générateur de radicaux libres dans les cellules. Pratiquement, tout composé cytotoxique ou une toxine, par exemple, les facteurs de stress ER (par exemple, la thapsigargine et tunicamycine), oxydant neuronale (par exemple, MPP +, la dopamine 6-hydroxy, et la roténone), la chaleur, et lourdmétaux (par exemple, Cd, Se), pourraient être adaptés à la méthode de sélection de mutants résistants respectifs.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vector</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBasePuro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tissue Culture</td></tr><tr><td>500 ml Filtres Stericup</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>250 ml</td><td>Filtres EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Steriflip-GV</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Tissue Culture Biologicals</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>FBS inactivé par la chaleur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels Life Technologies</td><td></td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorure de méthyl viologène ( Paraquat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide Hybri-MAX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX 0.1 % gélatine</td><td>EMD Millipore</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>0.25 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flacon</td><td>Corning</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Fiole T75</td><td>Corning</td><td>353135</td> 100 mm 353003 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>plaque</td><td>Corning</td></tr><tr><td>150 mm 430599</td> plaque <td>Corning</td><td>96</td><td></td></tr><tr><td>puits, plaque</td><td>Corning</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96 puits, plaque à fond en U 96 puits</td>, <td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr>, <tr><td>plaque 24 puits</td>, <td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de 50 ml&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires primaires de souris</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 Fibroblastes embryonnaires de souris</td><td>Applied StemCell</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td></td><td></td>BP25312</tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td></td><td></td>BP26531</tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Compteur de cellules</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de comptage (pour TC10)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electroporation</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvettes (4&#160 ; mm gap)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Molecular Biology</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercylcer ep Gradient&nbsp ; S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene Core kit B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA Kit de clonage</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ADNc haute capacité</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Double Processed Tissue Culture Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sel sodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electrophorèse</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose&nbsp ;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>bromure d’éthidium&nbsp ;</td><td>Fisher BioReagents&nbsp ;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 BP Échelle d’ADN</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 1 Kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 2-log</td><td>New England BioLabs</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

approche génétique de l&#39;avant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules es

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Les criblages génétiques pilotés par phénotype chez la souris sont une technique puissante pour découvrir les fonctions des gènes, mais sont souvent entravés par des coûts extrêmement élevés, ce qui limite considérablement son potentiel. Nous décrivons ici l’utilisation de cellules souches embryonnaires (SE) de souris comme cellules de substitution pour dépister un phénotype d’intérêt, puis d’introduire ces cellules dans un embryon hôte pour se développer en une souris vivante porteuse du phénotype. Cette méthode fournit (1) une plate-forme rentable et à haut débit pour le criblage génétique dans les cellules de mammifères ; (2) un moyen rapide d’identifier les gènes mutés et de vérifier la causalité ; et (3) un raccourci pour développer des mutants de souris directement à partir de ces cellules ES sélectionnées pour des études sur des animaux entiers. Nous avons démontré l’utilisation du paraquat (PQ) pour sélectionner des mutants résistants et identifier les mutations qui confèrent une résistance au stress oxydatif. D’autres facteurs de stress ou composés cytotoxiques peuvent également être utilisés pour dépister les mutants résistants afin de découvrir de nouveaux déterminants génétiques d’une variété de résistance au stress cellulaire.

Dans une expérience typique de mutagenèse, la transfection se compose d&#39;un total de 3 x 10 7 cellules ES avec PB-UPA et MPB transposase. Le nombre de cellules ES gènes piégés engendrés dans deux expériences indépendantes sont résumés dans le tableau 1. L&#39;efficacité de piégeage de gènes est d&#39;environ 0,04%. Les bibliothèques combinées de piégeage de gènes mutants contiennent 22.400 indépendants, soit environ une couverture complète de génome de la souris (23.000 gè...

La résistance au stress est l&#39;une des caractéristiques de longévité et est connu pour être génétiquement régie. Ici, nous avons développé une méthode à haut débit impartiale pour le dépistage de mutations qui confèrent la résistance au stress dans des cellules ES avec laquelle de développer des modèles de souris pour les études de longévité.

Approche génétique de l&#39;avant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules ES

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Les objectifs généraux de cette méthode sont de sélectionner efficacement des cellules souches embryonnaires mutantes résistantes au stress, d'identifier rapidement les gènes associés et de générer de manière rentable des modèles murins viables. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, en permettant d'identifier les gènes impliqués dans la résistance au stress ainsi que dans l'amélioration de la durée de bonne santé et de la durée de vie chez les mammifères. L'un des avantages de cette technique est qu'elle permet une sélection rentable de mutants nouveaux ainsi que la génération de modèles murins phénotypiques après criblage de cellules souches embryonnaires utilisées comme modèle de substitution.Pour commencer la culture des cellules ES, décongeler d'abord un flacon de fibroblastes embryonnaires primaires de souris activés au mitomycine C, ou PMEF, dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius, destinés à servir de cellules nourricières pour la culture des cellules ES. Transférer les cellules dans cinq millilitres de milieu pour cellules ES et les centrifuger à 100 × g pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant et resuspendre les cellu

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