Name: Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau denregistrement de sortie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Découvrez l'électrophysiologie sur préparations isolées tronc cérébral-moelle épinière de rongeurs nouveau-nés pour enregistrer le rythme respiratoire. Cette méthode permet d'évaluer les effets pharmacologiques sur la respiration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient sincèrement le MOP 130258 des Instituts de recherche en santé du Canada et la Fondation Star pour la recherche sur la santé des enfants, ainsi que la Fondation Molly Towell, pour la fourniture de l’installation de recherche et le soutien financier. Les auteurs remercient également sincèrement le Dr Kinkead Richard pour la relecture du manuscrit et ses conseils.

Cette méthode nécessitait l&#39;utilisation de sujets animaux, autorisés par le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université Laval (protocole N ° 2012-170). 1. Configuration et préparation <ol><li> Solutions <ol><li> Préparer des solutions de ACSF selon les recettes 7,17 suivantes. D&#39;autres recettes avec des variations de concentration sont disponibles dans la littérature. Solutions magasin d&#39;achat d&#39;actions à 4 ° C pour jusqu&#39;à un mois. <ol><li> Sel solution: ajouter 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0.58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Dissoudre dans 800 ml d&#39;eau distillée puis remplir à 1 L avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Une solution de bicarbonate: ajouter 17,65 g de NaHCO 3 (21 mM final). Dissoudre dans 900 ml d&#39;eau distillée puis remplir à 1 L avec de l&#39;eau distillée. Les variations de la concentration en bicarbonate se traduiront par des variations de pH. </li><li> Une solution de glucose: ajouter 54.06g de glucose (30 mM final). Dissoudre dans 400 ml d&#39;eau distillée puis remplir à 500 ml avec de l&#39;eau distillée. </li></ol></li><li> Préparer aCSF en diluant 100 ml d&#39;une solution de sel, 100 ml d&#39;une solution de bicarbonate et 50 ml de solution de glucose dans 1 litre d&#39;eau distillée. Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer une électrode de verre par chauffage et étirage d&#39;un tube de verre jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se casse. Poncer la pointe avant de l&#39;utiliser. L&#39;électrode peut être réutilisé plusieurs fois aussi longtemps qu&#39;il reste propre. </li></ol></li><li> Installation expérimentale Remarque: Les détails de mise en place sont présentés dans la figure 2. <ol><li> Mettez l&#39;amplificateur, le déplacement de calcul de moyenne, le système d&#39;acquisition de données, le contrôleur de température et la pompe. Vérifiez l&#39;amplification du signal (gain = 10 000), la filtration (seuil bas, 10 Hz; seuil haut, 5 kHz), et le taux d&#39;échantillonnage de la conversion analogique-numérique du signal brut (2,5 kHz). </li><li> Remplissez une bouteille avec aCSF et bulle avec carbogène (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). Induire une bubbled- et réchauffé aCSF écoulement dans la chambre d&#39;enregistrement (volume 5 ml) à 4 ml / min. Maintenir la température dans la chambre d&#39;enregistrement à 26 (± 1) ° C. pH devrait être de 7,4 dans ces conditions standard. </li><li> Maintenir 50 ml de carbogène et RT-aCSF barboter dans une seringue de 50 ml à proximité de la chambre de dissection. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur et lancez le logiciel d&#39;enregistrement. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol><li> Peser et de déterminer visuellement le sexe de l&#39;animal (les mâles ont une ano-génitale plus longue distance, tandis que les femelles ont une distance ano-génitale court; les mâles les organes génitaux sont souvent sombres tandis que les organes génitaux féminins sont de couleur rose). </li><li> Anesthésier les rongeurs nouveau-nés par l&#39;une des options suivantes: cryoanesthesia (immerger complètement l&#39;animal dans la glace pendant 4 - 5 min 18), l&#39;injection (equitensine à 4 ml / kg) 19 ou par inhalation d&#39;anesthésiques volatiles (isoflurane 20 ou éther 21). Confirm un plan adéquat de l&#39;anesthésie par l&#39;absence d&#39;un réflexe de retrait de la patte. </li><li> Placez l&#39;animal sur le banc, face ventrale vers le bas. Section de la partie rostrale de la tête coronaire avec un scalpel au niveau du bregma (visible à travers la peau et le crâne). Effectuez cette étape immédiatement après que l&#39;animal est anesthésié. </li><li> Section du corps coronaire avec un scalpel dans les membres antérieurs. </li><li> Enlever la peau, les muscles, les tissus adipeux et viscère avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Depuis os sont mous à cet âge, être prudent pour ne pas endommager le système nerveux. Effectuez cette étape sur le banc. </li><li> Placer la préparation dans la chambre de dissection. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. De ce point à la fin de l&#39;enregistrement, utiliser un microscope. </li><li> Sur la face dorsale de la préparation, couper le crâne et les vertèbres de la rostrale à la partie caudale long de l&#39;axe moyen avec des ciseaux et des pinces chirurgicales et minces. Ouvrez le crâne de coupeet vertèbres afin d&#39;exposer le tissu nerveux. Utilisez la aCSF strored dans la seringue pour oxygéner la préparation. </li><li> Avec la pince, retirer l&#39;arachnoïde, un tissu mince recouvrant la surface du tissu nerveux. Conserver la pie-mère et les vaisseaux sanguins contre le tissu nerveux. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. </li><li> Placer la préparation avec la dorsale face vers le bas, et soigneusement abattre le tronc cérébral et la moelle épinière en coupant les nerfs et du tissu conjonctif avec les ciseaux tout en maintenant la préparation en place. Une approche dorsale est également possible. Garder les racines et les nerfs aussi longtemps que possible. Retirez les os pour isoler le tronc cérébral et la moelle épinière. Utilisez la aCSF stocké dans la seringue pour oxygéner la préparation. </li><li> Retirer le cervelet et le reste des structures rostrales en les sectionnant avec le scalpel. Utilisez le aCSF stockée dans l&#39;aiguille pour oxygéner la préparation. </li><li> Eventuellement fonction sur expériconception tal, retirez le pont avec le scalpel par une section coronale antérieure à l&#39;artère cérébelleuse inférieure 22. Notez que le maintien de l&#39;ensemble des pons va ralentir le rythme chez les rats et entièrement inhiber chez les souris. Les préparatifs qui ne comprennent que la partie caudale du pont affichent une activité respiratoire-like avec une fréquence stable à la racine de la C4. </li></ol> 3. Enregistrement <ol><li> Placez la préparation dans la chambre d&#39;enregistrement, ventrale face vers le haut. Fixer la préparation avec des épingles dans la partie inférieure de la moelle épinière et rostrale-plus partie du tronc cérébral. </li><li> En utilisant une seringue reliée à l&#39;électrode par son aiguille, induire une dépression dans l&#39;électrode (diamètre de la pointe de verre: de 150 à 225 um) en tirant sur le piston de la seringue, afin de combler partiellement l&#39;électrode avec aCSF. </li><li> Utilisation d&#39;un micromanipulateur, placer soigneusement l&#39;électrode à proximité de l&#39;un des quatrième racines ventrales. Autres racines ventrales peuvent aussi présenter une respiratoires comme l&#39;activité (e.g., nerf crânien XII, C1 racine ventrale). </li><li> Provoquer une dépression dans le réservoir d&#39;électrode via la seringue en tirant le piston afin d&#39;aspirer délicatement le radicelles de nerf. Puis déplacez doucement l&#39;électrode pour l&#39;appliquer contre la moelle épinière. Remarque: Idéalement, la taille des radicelles correspond à la taille de l&#39;ouverture de l&#39;électrode et crée un joint d&#39;étanchéité entre les compartiments interne et externe de l&#39;électrode ainsi. Depuis amplificateurs différentiels sont couramment utilisés pour de tels enregistrements, toute ouverture entre l&#39;intérieur de l&#39;électrode et la chambre d&#39;enregistrement réduit la qualité du signal et il est difficile d&#39;éliminer les bruits de fond. </li><li> Commencez l&#39;enregistrement. </li><li> Enregistrer le rythme produit par la préparation dans des conditions normoxiques (c.-à barboter avec du carbogène aCSF: 95% O 2 et 5% CO 2) pendant au moins 20 min afin de déterminer les paramètres de base de la préparation. </li><li> Mettez la perfusion de carbogène-barboter à aCSFaCSF stimulus (par exemple, par barbotage avec 95% de N 2 et 5% de CO2 pendant l&#39;hypoxie stimulus) pendant 15 min. Modifier la durée d&#39;exposition en fonction du protocole expérimental. Consigner la durée de l&#39;exposition sur l&#39;enregistrement et animale fiche. Utilisation tubes en acier inoxydable entre la bouteille et le ACSF chambre chaque fois que possible pour éviter la diffusion de gaz vers l&#39;extérieur du tube. </li><li> Mettez la perfusion retour à aCSF carbogène-barboter norme pendant au moins 15 minutes pour un enregistrement de récupération. Inscrire ce sur l&#39;enregistrement et animale fiche. </li><li> Terminez l&#39;enregistrement. </li></ol> 4. Analyse statistique <ol><li> A partir du signal intégré, le calcul de la fréquence que le nombre de paquets par minute (exprimée en salves / min), l&#39;amplitude de la différence entre la ligne de base et le pic de la salve (exprimée en mV), la durée de salve que la durée de du début à la fin de la salve (exprimé en s), la région d&#39;éclatement comme l&#39;aire sous la curve de la salve sur le signal intégré (exprimée en mV · s) (Figure 3). </li><li> Calculez la fréquence, l&#39;amplitude, la durée et la zone éclater éclater sous normoxique (de base), hypoxique (stimulus) et post-hypoxiques conditions (post-stimulus) de récupération comme la moyenne des les 5 dernières minutes des enregistrements pour chaque condition. Ne pas analyser la première partie de chaque condition, car il ya un délai entre la commutation de la perfusion et aCSF homogénéisation dans la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Exprimez puis stimulus (ie, l&#39;hypoxie) et post-stimulus (ie, post-hypoxiques) valeurs de récupération en pourcentage des valeurs de référence pour l&#39;enregistrement correspondant. Exprimer les résultats en tant que moyen ± SD </li></ol>

<ol><li>Feldman, J. L., Del Negro,, A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li>
<li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li>
<li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li>
<li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li>
<li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li>
<li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation%3A+an+approach+using+in+vitro+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li>
<li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li>
<li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li>
<li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li>
<li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li>
<li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li>
<li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li>
<li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions%3A+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li>
<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+regulation+in+the+brain%3A+implications+for+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li>
<li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+on+extracellular+Ca2%2B%2FK%2B+antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li>
<li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT+acting+on+5-HT%281%2F2%29+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li>
<li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li>
<li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li>
<li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hokkaido+Igaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li>
<li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li>
<li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li>
<li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li>
<li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li>
<li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li>
<li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizations+of+eupnea%2C+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou de conflits d’intérêts à divulguer.

Quantification précise de l&#39;activité respiratoire peut être difficile. En effet, la respiration est une fonction qui peut être à la fois automatique et volontaire, et que est modulée en fonction de l&#39;environnement, les besoins de l&#39;organisme, l&#39;état émotionnel et le comportement. L&#39;avantage de cette technique est l&#39;isolement des éléments neuronaux responsables de la production de la commande respiratoire. Ainsi, les enregistrements électrophysiologiques de préparations pléthysmographie et la moel...

La respiration est une activité complexe et vital commandé par le cerveau, ce qui permet dioxygène (O 2) et l&#39;absorption du dioxyde de carbone (CO 2) d&#39;élimination. L&#39;entraînement respiratoire centrale est généré par un réseau complexe situé dans le tronc cérébral dans les deux mammifères 1, 2 amphibiens, reptiles, oiseaux 3 4 et 5 poissons. Même si l&#39;étude de la respiration peut être traitée in vivo, les enquêtes mécanistes précises nécessitent un accès direct au réseau de contrôle respiratoire. À cette fin, Adrian et Buytendijk développé une préparation de poisson rouge réduite, dans laquelle des électrodes placées sur le record de surface du tronc cérébral le rythme généré associé à la ventilation des branchies 5. Cette approche a ensuite été adapté par Suzue en 1984 6 pour une utilisation chez les rongeurs nouveau-nés. L&#39;avènement de cette préparation a conduit à des avancées significatives dans la neurobiologie respiratoire. Étant donné qu&#39;il est relativement simple, la technique présentée here se prête à un large éventail d&#39;enquêtes de base de comportements moteurs rythmiques et leurs origines chez les rongeurs nouveau-nés. L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;enregistrer le corrélat neuronal de l&#39;activité inspiratoire, un rythme respiratoire de type appelé respiration fictive, produite par le réseau des voies respiratoires. Ce procédé peut être utilisé dans un large éventail d&#39;objectifs de recherche, visant les réponses inspiratoires aux variations ou la pharmacologie respiratoires dans les deux sauvages de type 7 et 8 animaux transgéniques. Étant donné que les expériences sont réalisées à basse température, sans afférences sensorielles, et dans des conditions où les concentrations de glucose et de O 2 dans le aCSF sont élevés, des questions ont été soulevées quant à la pertinence physiologique du signal enregistré. Bien qu&#39;il existe des différences claires entre in vivo et in vitro de conditions (par exemple., La fréquence de salves inspiratoire) le fait demeure que la présence deles éléments de base du réseau des voies respiratoires 6 permettent d&#39;étudier un rythme robuste associée à une fonction homéostatique essentiel 9,10. La raison derrière le développement et l&#39;utilisation de cette technique est de faciliter l&#39;accès direct aux éléments du tronc cérébral du réseau des voies respiratoires, qui sont difficilement accessibles in vivo, en particulier dans les nouveaux-nés. Le tronc cérébral est placé dans des conditions strictement contrôlées: le rythme enregistré est pas modulée par des apports afférents périphériques des poumons ou les organes de la carotide, ce qui permet l&#39;étude de se concentrer sur l&#39;entraînement respiratoire centrale elle-même 11. Ainsi, cet accès est utilisé pour appliquer des stimuli et enregistrer le signal de sortie. Contrairement à la pléthysmographie enregistrements, le rythme respiratoire est modulée par la totalité de ses composants dans tout le corps (par ex., Distension pulmonaire, senseurs chimiques périphériques), ce qui rend difficile l&#39;application de stimuli précis. Dans unewborn rat, le protocole consiste à enregistrer le quatrième signal de la racine ventrale sur un tronc cérébral isolé et une moelle épinière tronqué, maintenue dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF). Le rythme généré par les préparations de la moelle du tronc cérébral-spinal est constituée de salves lentes individuels qui sont liés au signal inspiratoire 9. Préparations isolées de la moelle épinière tronc cérébral sont facilement enregistrables chez les rats de jour postnatal 0 à 4 (P0 - P4) 7. Cette approche est couramment utilisé pour évaluer la réponse hypoxique du réseau des voies respiratoires, ainsi que la réponse à l&#39;hypercapnie, acidose ou de drogues. Un protocole d&#39;hypoxie aiguë est présenté ici. Cette stimulation est obtenue par retrait de O 2 dans le aCSF; cette approche est couramment utilisé pour évaluer la tolérance et de la réactivité à des insultes hypoxiques. Le protocole induit une dépression du rythme dès la première minute jusqu&#39;à la fin de l&#39;exposition de l&#39;hypoxie (figure 1) 12. Cette dépression est inversépendant la post-hypoxique 12 de récupération. En ce qui concerne la conception expérimentale, il est important de noter que le pont, situé à la partie rostrale du tronc cérébral, a une action inhibitrice sur le générateur de rythme 8. Ainsi, les préparations de pleine tronc cérébral et la moelle épinière rostrale affichent un rythme plus faible. L&#39;inclusion de la protubérance dans l&#39;échantillon isolé de l&#39;enregistrement est déterminée en fonction du but de l&#39;expérience 13; l&#39;étude de l&#39;influence pontique sur le réseau bulbe rachidien de exigerait enregistrements avec et sans les pons de comparer les résultats 14. En outre, l&#39;un des avantages de cette technique est la possibilité d&#39;étendre la partie rostrale de la préparation d&#39;inclure mésencéphalique et / ou régions diencéphaliques 15,16, ce qui permet d&#39;évaluer l&#39;effet de ces régions sur le réseau des voies respiratoires ponto-médullaire.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td>Utilisation sous capot</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>CCL444</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioshop</td><td>MAG510</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>SPM306</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Linde</td><td>343-02-0006&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur</td><td>de température Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Électrode d’aspiration</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>modèle 573000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur différentiel AC</td><td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td><td>modèle 1700</td><td></td></tr><tr><td>Moyenne mobile</td><td>CWE, Ardmore, PA, USA</td><td>modèle MA-821</td><td></td></tr><tr><td>Système</td> <td>d’acquisition de donnéesDataq Instruments, Akron, OH, États-Unis</td><td>modèle DI-720</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LabChart</td><td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism sofware</td><td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre de dissection</td><td>La boîte en plastique (par exemple boîte de Petri) fera l’affaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement</td><td>Base</td><td></td><td></td>faite maison</tr><tr><td></td><td>Kanetec, Bensenville, IL, États-Unis</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td><td>MB</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Ordinateur</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> fait maison</tbody></table>

Électrophysiologie sur isolés cord préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance rongeurs permet neural respiratoire réseau d&#39;enregistrement de sortie

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Bien qu’il soit bien connu que la propulsion respiratoire centrale est située dans le tronc cérébral, plusieurs aspects de sa fonction de base, de son développement et de sa réponse aux stimuli restent à comprendre pleinement. Pour surmonter la difficulté d’accès au tronc cérébral chez l’animal entier, l’isolement du tronc cérébral et d’une partie de la moelle épinière est effectué. Cette préparation est maintenue dans le liquide céphalo-rachidien artificiel où les gaz, les concentrations et la température sont contrôlés et surveillés. Le signal de sortie du réseau respiratoire est enregistré par une électrode d’aspiration placée sur la quatrième racine ventrale. De cette manière, les stimuli peuvent être appliqués directement sur le tronc cérébral, et l’effet peut être enregistré directement. Le signal enregistré est lié au signal inspiratoire envoyé au diaphragme via le nerf phrénique, et peut être décrit comme des rafales (environ 8 rafales par minute). L’analyse de ces sursauts (fréquence, amplitude, longueur et aire sous la courbe) permet de caractériser précisément l’effet du stimulus sur le réseau respiratoire. La principale limite de cette méthode est la viabilité de la préparation au-delà des premiers stades postnatals. Ainsi, cette méthode se concentre grandement sur l’étude de l’ensemble du réseau sans les entrées périphériques chez le rat nouveau-né.

Comme mentionné dans l&#39;introduction, l&#39;un des avantages les plus importants de cette technique est l&#39;accès direct au tronc cérébral pour appliquer divers stimuli. A titre d&#39;exemple, l&#39;hypoxie a été appliqué ici. La Figure 1. AB affiche un enregistrement de protocole complète, avec les deux conditions normoxiques et hypoxiques. Figure 1.CE affiche le rythme enregistrés dans des conditions normoxiques (par exemple, aCSF barboter avec 95% O 2 et 5% C...

La propulsion respiratoire centrale est située dans le tronc cérébral. La sortie motrice respiratoire spontanée d’un tronc cérébral-moelle épinière isolé est enregistrée en plaçant une électrode sur la quatrième racine ventrale. Cette approche expérimentale est précieuse pour les investigations pharmacologiques ou l’évaluation des défis respiratoires et des manipulations génétiques sur le comportement moteur rythmique.

Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau d&#39;enregistrement de sortie

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer le rythme généré par les noyaux respiratoires du tronc cérébral en l'absence d'entrées périphériques dans différentes conditions. Cela est réalisé en premier lieu en retirant la région du cou et du haut du dos du rat, où se trouve le tronc cérébral. La deuxième étape consiste à isoler le système nerveux et à retirer les os crâniens et vertébraux.Ensuite, placez l'électrode sur la quatrième racine ventrale et commencez l'enregistrement. Finalement, des enregistrements électrophysiologiques sont effectués sur le tronc cérébral et la moelle épinière isolés. Ces préparations servent à montrer le rythme généré par le tronc cérébral en réponse à divers stimuli.Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine respiratoire, comme de savoir si la molécule est impliquée dans le rythme. Les témoins de génération R permettent d’évaluer l’effet que l’extrémité médicale exerce sur le noyau respiratoire. Commencez cette procédure en plaçant un rat nouveau-né anesthésié sur une boîte.Retirer immédiatement la partie rostrale de la tête au niveau du bgma, de façon coronaire, à l’aide d’un scalpel. Ensuite, retirer le corps sous les membres antérieurs Corona. Puis, enlever les muscles cutanés et les tissus adipeux recouvrant le crâne.Ensuite, retirez la substance visqueuse et faites attention de ne pas endommager le système nerveux. Transférez ensuite le prélèvement dans la chambre de dissection. Placez la chambre de dissection sous le microscope.Appliquez ensuite le LCR A oxygéné à l’aide d’une seringue pour oxygéner la préparation sur le côté dorsal du prélèvement. Incisez le crâne le long de l’axe médian et écartez-le pour exposer le tissu nerveux. Effectuez la même procédure pour les vertèbres.Appliquez ensuite le liquide céphalorachidien artificiel (LCA) oxygéné pour oxygéner le prélèvement. Ensuite, positionnez le prélèvement avec son côté dorsal orienté vers le bas. Isolez soigneusement le cerveau, le tronc cérébral et la moelle épinière en sectionnant les nerfs et les tissus conjonctifs tout en maintenant le prélèvement en place.Ensuite, retirez le cervelet et les structures rostrales restantes. Appliquez le LCR A oxygéné à la préparation. Dans cette procédure, placez le tissu nerveux dans la chambre d’enregistrement avec sa face ventrale orientée vers le haut. Fixez-le avec des broches dans la partie la plus basse de la moelle épinière et dans la partie la plus rostrale du tronc cérébral.Ensuite, retirez la membrane arachnoïdienne, qui est un tissu mince recouvrant la surface du tissu nerveux. Veillez à ne pas retirer la pie-mère et les vaisseaux sanguins du tissu nerveux. Ensuite, remplissez l'électrode avec un LCR.À l’aide d’un micromanipulateur, placer délicatement l’électrode près de la quatrième racine ventrale. Aspirer doucement la racine nerveuse à l’aide de la seringue. Ensuite, placer l’électrode avec la racine nerveuse contre la moelle épinière.Ensuite, enregistrez les activités électrophysiologiques générées par le tissu nerveux dans des conditions normoxiques pendant au moins 20 minutes. Pour déterminer les paramètres de base de la préparation, passez la solution de perfusion de la ASCF saturée en carbogène à la ASCF stimulus d'hypoxie, puis enregistrez pendant 15 minutes. Après cela, revenez à la solution de perfusion standard au carbogène.Bubblage d'un LCS et enregistrement pendant au moins 15 minutes supplémentaires avant la fin de l'enregistrement indiqué. Voici les sorties respiratoires enregistrées à partir de la racine ventrale C4 de la préparation de la moelle épinière du tronc cérébral provenant d'un rat P4 dans des conditions normoxiques, hypoxiques et de récupération post-hypoxique. Ceci est le signal intégré et ceci est le signal brut.Et voici les enregistrements agrandis et les rafales individuelles pour chaque condition après le développement. Cette méthode ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la respiration pour explorer les groupes neuronaux et les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle et la génération de la respiration chez le nouveau-né.

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Une démonstration de l'isolement de la moelle épinière de souris néonatales pour des études électrophysiologiques.

Spinal Cord électrophysiologie

Une démonstration de la fabrication et l'utilisation d'une électrode extracellulaire aspiration utilisés pour mesurer des enregistrements électrophysiologiques des cordons de rongeur néonatal...

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Cette vidéo présente des enregistrements électrophysiologiques de préparations isolées du tronc cérébral et de la moelle épinière de rongeurs nouveau-nés. La préparation est placée dans une chambre d’enregistrement, et les sursauts inspiratoires du tronc cérébral sont enregistrés dans des conditions oxygénées et privées d’oxygène à l’aide de la quatrième racine nerveuse ventrale de la moelle épinière.

Enregistrements électrophysiologiques de préparations du tronc cérébral et de la moelle épinière d’un rongeur nouveau-né

Une méthode chirurgicale est décrite à exposer le crâne ventrale chez des rats nouveau-nés. En utilisant cette approche, il est possible d'ouvrir une craniotomie pour effectuer électrophysiologie aiguë et des expériences de microscopie à deux photons dans le tronc cérébral des bébés anesthésiés.

Une méthode pour faire un Craniotomie sur le crâne ventrale de nouveaux-nés Rongeurs

Cette procédure effectue de longue durée des enregistrements intracellulaires in vivo de neurones isolés au cours des états cérébraux physiologiquement pertinents et après l' abolition complète des activités électriques en cours, ce qui entraîne un état ​​du cerveau isoélectrique. Les constantes physiologiques de l'animal sont soigneusement surveillés pendant la transition vers l'état comateux artificiel.

Induction d&#39;un Etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité<em&gt; In Vivo</em

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Ici, nous introduisons une nouvelle technique conçue pour enregistrer l'électrodéphalographie (EEG) dans les chiots épileptiques néonataux à déplacement libre et décrire ses procédures, leurs caractéristiques et leurs applications. Cette méthode permet d'enregistrer EEG pendant plus d'une semaine.

Enregistrement d&#39;EEG dans des rats néonatals à déplacement libre à l&#39;aide d&#39;une nouvelle méthode

Dans cette étude, la méthodologie est présentée sur la façon d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques in vivo multi-sites à partir de la voie hyperdirect sous anesthésie uréthane.

Aigu<em&gt; In vivo</em&gt; Enregistrements électrophysiologiques des potentiels de terrain locaux et activité multi-unités à partir de la voie hyperdirect dans les rats anesthésiés

Cette étude présente une méthode pour l’enregistrement simultané des potentiels de champs locaux dans le cerveau, les électrocardiogrammes, les électromyogrammes et respiration des signaux d’un rat librement mobile. Cette technique, ce qui réduit les coûts de l’expérimentales et simplifie l’analyse des données, contribuera à la compréhension des interactions entre le cerveau et les organes périphériques.

Enregistrements simultanés des potentiels corticaux champ Local, électrocardiogramme, électromyogramme et respiration rythmique d’un Rat librement mobile

Ce protocole tant visuellement communique la préparation du tronc cérébral-moelle épinière et clarifie la préparation des tranches transversale du tronc cérébral d’une façon complète étape par étape. Il a été conçu pour accroître la reproductibilité et la probabilité d’obtenir des tranches viables, durables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de sortie neuronale des régions respiratoires du tronc cérébral.

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Ce protocole décrit une méthode permettant d’obtenir in vivo des enregistrements de neurones uniques à haute densité à partir du tronc cérébral de souris fixées à la tête. Cette approche est déployée pour mesurer le potentiel d’action des neurones dans le gris périaqueducal ventrolatéral - une région du tronc cérébral inactive pendant le sommeil paradoxal - avant et pendant l’anesthésie générale.

Enregistrements aigus à une unité et à plusieurs électrodes du tronc cérébral de souris fixées à la tête

Découvrez l'électrophysiologie sur préparations isolées tronc cérébral-moelle épinière de rongeurs nouveau-nés pour enregistrer le rythme respiratoire. Cette méthode permet d'évaluer les effets pharmacologiques sur la respiration.

Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau denregistrement de sortie (Vidéo) | JoVE Journal

Électrophysiologie sur isolés Cord Préparatifs du tronc cérébral-spinal de la naissance Rongeurs Permet Neural respiratoire Réseau d'enregistrement de sortie

Explorer plus de vidéos