Name: Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Apprenez à fabriquer des bicouches lipidiques supportées par la méthode SALB sans vésicules. Cette technique simplifiée utilise l'isopropanol et la microfluidique pour étudier les protéines membranaires et accélérer la découverte de médicaments.

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Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 et NRF2015NRF-POC0001-19), le Conseil national de la recherche médicale (NMRC / CBRG / 0005/2012), et l&#39;Université technologique de Nanyang à CNM

1. Formation de prises en charge lipidique en deux couches sur un support solide hydrophile <ol><li> Préparer des solutions lipidique sous licence de 10 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) et 1 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-PE) en dissolvant les poudres lipidiques respectifs (adéquatement pesé au préalable avec un bilan de masse analytique) dans une solution d&#39;isopropanol. </li><li> Diluer et mélanger les solutions d&#39;achat d&#39;actions à l&#39;isopropanol afin de préparer le mélange lipidique souhaité à la concentration finale. Pour les expériences de microscopie par fluorescence et FRAP, 0,5% en poids de Rh-PE doit être inclus dans le mélange de lipides. </li><li> Injecter le mélange de lipides dans de l&#39;isopropanol dans le canal microfluidique jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit rempli. </li><li> Incuber le mélange de lipides sur la surface en verre pendant environ 10 min. </li><li> Remplacer progressivement la solution lipidique avec une solution d&#39;eau ou un tampon en utilisant une pompe péristaltique à un débit très faible(10 à 50 pi / min). En variante, remplacer le mélange lipidique par pipetage répété. </li><li> Rincer le canal à fond avec le tampon en excès afin d&#39;éliminer l&#39;isopropanol résiduel. </li></ol> 2. Formation des membranes supportées enrichi en cholestérol Remarque: La surface solide (SiO 2) prend en charge la fusion des vésicules, mais la composition de la membrane (taux élevé de cholestérol) inhibe la fusion des vésicules parce vésicules enrichies en cholestérol ont haute rigidité à la flexion 30. <ol><li> Préparer une solution de réserve contenant 10 mg / ml DOPC lipides, 10 mg / ml de cholestérol, et de 1 mg / ml Rh-PE en dissolvant d&#39;abord les poudres respectives dans l&#39;isopropanol. </li><li> Répétez les étapes 1,2-1,6 en utilisant les solutions d&#39;achat d&#39;actions préparés à l&#39;étape 2.1. </li></ol> 3. Membrane Fluidity Assay <ol><li> Immerger la lame de verre dans du dodécyl sulfate (SDS) solution de sodium (1%) pendant 10 min. </li><li> Laver les lames avec de l&#39;eau déminéralisée et rincer l&#39;esprith éthanol. </li><li> Séchez diapositives à l&#39;aide d&#39;un faible courant d&#39;azote. </li><li> Exposer les lames à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d&#39;oxygène. </li><li> Retirez la pellicule protectrice du fond commerciale chambre microfluidique (figure 1A) en utilisant une pince à épiler et fixer la lame de verre sur le côté collant de la chambre (figure 1B). </li><li> Assembler les connecteurs et tubes dans les positions d&#39;entrée et de sortie de la chambre et les placer sur le canal microfluidique la platine du microscope (Figure 1C). </li><li> Former une bicouche lipidique marqué par fluorescence supporté dans le canal microfluidique [répétition de l&#39;étape 1 en utilisant la composition lipidique souhaité (par exemple, 0,5 mg / ml DOPC) comprenant 0,5% en poids de Rh-PE dans un solvant organique]. </li><li> Localisez le plan de bicouche avec une immersion dans l&#39;huile objectif 60X (NA 1,49) afin de capturer des images. </li><li> Prenez deux images pré-blanchiment, puis de photo-301; m de large tache circulaire avec un faisceau de 532 nm, 100 mW laser. Avant photoblanchiment, réchauffer le laser jusqu&#39;à ce que son intensité est devenue stable. Immédiatement après photoblanchiment, capturer une série d&#39;images toutes les 1 sec pendant 2 minutes afin de suivre la reprise de l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;endroit blanchi. </li></ol> 4. Cholestérol Quantification Assay <ol><li> Exposer la puce de capteur à cristal de quartz revêtu de dioxyde de silicium à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes à la puissance maximale de radiofréquence dans la chambre à plasma d&#39;oxygène. Retirez la puce de la chambre et montez immédiatement la puce dans la chambre de mesure. </li><li> Avant l&#39;expérience, la première fréquence d&#39;acquérir et de dissipation de la puce de capteur dans l&#39;air afin d&#39;assurer un montage correct. <ol><li> Pour l&#39;instrument Q-Sense E1 ou E4 QCM-D commerciale, exécutez le logiciel Q-Soft et cliquez sur &quot;Acquisition&quot; et sélectionnez &quot;Mesure de configuration&quot;. </li><li> Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, cochez la 3, 5, 7, 9, 11 et 13 harmoniques et puis cliquez sur Find and Run afin de vérifier les spectres de résonance. Réglez la température à 24 ° C. Si une ou plusieurs fréquences de résonance ne sont pas d&#39;accord avec les valeurs attendues, vérifiez la puce de montage et re-exécuter cette étape jusqu&#39;à ce qu&#39;un accord soit atteint. </li></ol></li><li> Démarrer la pompe péristaltique et le débit de solution tampon (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) dans la chambre de mesure à un débit de 100 ul / min. </li><li> Dans le logiciel, cliquez sur &quot;Acquisition&quot; et sélectionnez &quot;Redémarrer mesure&quot; afin d&#39;enregistrer les signaux de dissipation de la fréquence de résonance et de l&#39;énergie. Répétez cette étape jusqu&#39;à ce qu&#39;une ligne de base stable pour la fréquence et de dissipation des changements. Remarque: Pour les étapes ci-après, il y aura des décalages de fréquence et de dissipation supplémentaires qui peuvent être enregistrés en fonction du temps. </li><li> Injecter de l&#39;isopropanol (sans lipides) pendant 10 min. </li><li> Injecter le mélange de lipides DOPC / cholestérol aurapport molaire désiré avec une concentration totale en lipides de 0,5 mg / ml dans de l&#39;isopropanol pendant 10 min. </li><li> Injecter tampon pendant 20 min à un débit de 100 ul / min. </li><li> Injecter une solution de 1 mM de méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) préparé dans un tampon (débit 100 pl / min) jusqu&#39;à ce que le signal de fréquence atteint une valeur stable. </li><li> Mesurer les décalages de fréquence positifs relatifs qui est causée par l&#39;étape de traitement MβCD et calculer la masse de cholestérol et DOPC lipides en convertissant les valeurs de Af cho et Af DOPC à des valeurs de masse à l&#39;aide de l&#39;équation Sauerbrey [Δm = - (C / N) × Af, où C = 17,7 ng / cm 2, n: harmonique]. </li><li> Calculer la fraction molaire de cholestérol dans le SLB, en prenant en compte les poids moléculaires des lipides DOPC (786,1 g / mol) et de cholestérol (386,6 g / mol). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

Dans ce travail, un protocole solvant d&#39;échange est présenté dans laquelle les lipides dans de l&#39;alcool (isopropanol, l&#39;éthanol ou le n-propanol) sont incubées avec un support solide et ensuite l&#39;alcool est progressivement remplacé par une solution tampon aqueuse de manière à conduire une série des transitions de phase finalement produire des bicouches lipidiques de phases lamellaires-24. Il est démontré que le procédé permet la fabrication de bicouches lipidiques supportées sur des surfaces telles que l&#39;or, qui est insoluble à la vésicule procédé de fusion. Une plage optimale de la concentration de lipides (de 0,1 à 0,5 mg / ml) a été déterminé pour la formation de bicouche complète dans des formats standards expérimentaux testés jusqu&#39;à présent. A des concentrations inférieures à 0,1 lipidiques mg / ml, discrètes, des correctifs microscopiques de bicouches formé. D&#39;autre part, à des concentrations supérieures à 0,1 mg / ml et inférieure à 0,5 mg / ml, une bicouche complet et uniforme est formée. A des concentrations de lipides au-dessus de cette plage, une bicouche fluide a été formé comme toujours vérified par analyse de FRAP, cependant, la microscopie par fluorescence révèle la présence de structures lipidiques supplémentaires au-dessus de la bicouche. Frappant de constater que la morphologie de ces structures lipidiques supplémentaires, comme déterminé par analyse QCM-D, dépendait de l&#39;alcool qui a été utilisée lors de l&#39;étape d&#39;incubation. Dans le cas de l&#39;éthanol, les variations Δ f et D ô relativement élevées ressemblent à la signature QCM-D pour obtenir une couche de la vésicule adsorbé. Lorsque l&#39;isopropanol ou le n-propanol a été utilisé à la place, le Δ f est légèrement supérieure à la valeur attendue pour une bicouche (f Δ finale entre -30 à -40 Hz), tandis que le Δ D était sensiblement plus élevé. De telles réponses QCM-D seraient attendus pour de longues structures lipidiques (par exemple, des micelles en forme de vers en saillie vers l&#39;extérieur à partir de) la surface de la membrane (comme visible par microscopie de fluorescence dans certains cas). Le taux de change solvant est un autre paramètre important qui peut être critique, especially lorsque les concentrations de lipides inférieurs (par exemple, 0,1 mg / ml) sont utilisés. Rapid échange de solvant à faible concentration en lipides peut conduire à la formation de bicouches incomplets. Dans la chambre de mesure standard utilisée pour les mesures QCM-D dans le présent document (chambre de mesure Q-Sense E4), les taux de l&#39;ordre de 100 pi / min de débit, sont appropriés pour la formation de bicouche complète hautement reproductible. Pour les cellules d&#39;écoulement avec d&#39;autres geometries et le volume, le débit optimal peut varier et doit être déterminée empiriquement sur la base des étapes proposées ici. En plus de former des bicouches lipidiques supportées sur des surfaces qui sont insolubles à la fusion des vésicules, la SALB peut être utilisée pour contourner le besoin de vésicules lipidiques qui peuvent se rompre, ce qui ouvre la porte à la fabrication de membranes supportées par des compositions complexes. A titre d&#39;exemple illustratif de composition, des mélanges de lipides avec une fraction élevé de cholestérol ont été examinés. Le cholestérol est une composante importante de mammalian Les membranes cellulaires, et peuvent approcher sa fraction de 45 à 50% en moles de la composition lipidique membranaire (par exemple, dans les globules rouges). Ainsi, même un modèle simple d&#39;une bicouche lipidique qui représente une membrane cellulaire humaine devrait comprendre cholestérol. Bien que la fusion des vésicules peut être utilisé pour fabriquer des bicouches lipidiques fluides ne contenant que 10 à 15% de cholestérol, le procédé SALB permet la formation de bicouches lipidiques fluides contenant des fractions élevées de cholestérol (jusqu&#39;à 57% en moles, telle que quantifiée par des mesures QCM-D) 36. Toutefois, lorsque le taux de cholestérol a été encore élevée (jusqu&#39;à 63% en moles), en forme de bande domaines ont été observés 37. Les domaines de co-existantes étaient liquide, rappellent ceux observés dans la région de β dans le diagramme de phase du cholestérol / phospholipides monocouche à l&#39;interface air-eau. Dans l&#39;ensemble, la méthode SALB se révèle être une approche simple et efficace pour former des bicouches lipidiques supportées, notamment in cas au-delà du champ d&#39;application de la méthode de vésicule fusion classique. Jusqu&#39;à présent, la technique de microscopie par fluorescence et de QCM-D ont été principalement utilisées pour caractériser les bicouches lipidiques supportées formés par le procédé SALB. Pour l&#39;avenir, un large éventail de mesures analytiques techniques de surface sensible, y compris la résonance plasmonique de surface (SPR) 38, la microscopie à force atomique (AFM) 39,40, Fourier-spectroscopie infrarouge à transformée 41, X-ray 42 et réflectivité de neutrons 43, peut être utilisés pour caractériser et étudier les configurations de bicouches simples et complexes à préparer par le procédé SALB plus loin. Ces capacités émergentes ouvrent la porte à un plus grand nombre de scientifiques qui peuvent explorer les membranes cellulaires artificiels en profitant d&#39;un protocole expérimental simple et robuste.

La bicouche lipidique sur support solide 1 (SLB) est une plate-forme polyvalente qui conserve les caractéristiques de base des membranes biologiques tels que l&#39;épaisseur de la bicouche, diffusivité lipidique à deux dimensions, et la capacité d&#39;accueillir des biomolécules associées à la membrane. En raison de la complexité des membranes cellulaires naturelles, cette plate-forme simple a été montré pour fonctionner comme une plate-forme efficace pour les études in vitro de processus liés à la membrane tels que la formation radeau 2, protéine de liaison 3, virus et contraignant particules virus-like 4,5 , et la signalisation cellulaire 6. Formé à proximité à un support solide, la plate-forme SLB est compatible avec une gamme de techniques de mesure en surface sensible comme totale microscopie de réflexion interne (FRBR), microbalance à cristal de dissipation de quartz (QCM-D), et la spectroscopie d&#39;impédance. Plusieurs méthodes ont été développées pour produire différents types de SLBS, y compris bulle d&#39;aireffondrement 7 et dip-pen nanolithographie 8 pour les taches lipidiques submicroniques, spin-coating 9 pour les piles bicouches et de Langmuir-Blodgett (LB) 10 et la fusion des vésicules (VF) 11 pour l&#39;ensemble de découpage, simples revêtements bicouches lipidiques. Procédé VF consiste en l&#39;adsorption de petites vésicules unilamellaires à un support solide et la rupture spontanée subséquente et de fusion pour former une bicouche lipidique continue. Toutefois, dans des conditions physiologiques, vésicule rupture spontanée est principalement limitée à des matériaux à base de silicium tels que le dioxyde de silicium, le verre et le mica. En outre, les vésicules rupture ne se produit pas spontanément des vésicules lipidiques de compositions complexes, tels que ceux contenant des fractions ou élevés de cholestérol des lipides chargés négativement. Selon le système, vésicule rupture peut être provoquée par la couture en outre les conditions expérimentales telles que la température 12, pH de la solution 13, 14 et de la salinité, un choc osmotique 15 </sup&gt; ou pression 16, ou l&#39;ajout d&#39;ions divalents tels que Ca2 + 17. Alternativement, l&#39;AH peptide de membrane-actif peut être introduit dans le but de déstabiliser une couche de vésicules adsorbées, conduisant à des vésicules rupture et la formation de bicouche sur une gamme de surfaces 18-22. En outre, la formation de bicouche réussie nécessite la préparation d&#39;une population bien contrôlé de petites vésicules unilamellaires qui peut être fastidieuse et difficile à réaliser pour certaines compositions de membrane. Par conséquent, en dépit de sa grande efficacité dans le meilleur des cas (par exemple, après une vaste prétraitement de gel-dégel de vésicules 23), l&#39;application générale de la fusion des vésicules est limité par la portée des substrats appropriés et des compositions membranaires. Le procédé assisté par solvant-24-28 bicouche lipidique (SALB) est une technique de fabrication de rechange qui ne nécessite pas des vésicules lipidiques. Le procédé est basé sur le dépôt of molécules lipidiques sur une surface solide en présence d&#39;un solvant organique miscible à l&#39;eau suivi d&#39;un échange progressive de ce solvant avec une solution aqueuse de tampon afin de déclencher la formation SLB. Au cours de l&#39;étape de solvant échange, le mélange ternaire de lipides, de solvant organique et de l&#39;eau subit une phase de série de transitions avec l&#39;augmentation de la fraction d&#39;eau, ce qui conduit à la formation de structures de phases lamellaires dans la solution en vrac et une SLB sur le substrat solide. Fait important, cette voie d&#39;auto-assemblage contourne la nécessité d&#39;une rupture des vésicules, qui est habituellement l&#39;étape limitante pour la transformation de vésicules adsorbées dans un SLB. Le protocole est applicable à une grande variété de surfaces, y compris le dioxyde de silicium, l&#39;oxyde d&#39;aluminium, le chrome, l&#39;indium oxyde d&#39;étain, et l&#39;or. Dans le présent document et dans la vidéo d&#39;accompagnement, une comparaison de dépôt de lipides par la vésicule SALB et méthodes de fusion est présentée. En particulier, l&#39;influence de paramètres expérimentaux, y compris la concentration de lipides, Vitesse d&#39;écoulement, et le choix du solvant organique miscible à l&#39;eau, sur la qualité de la double couche formée par le procédé SALB sont discutés. Caractérisation analytique des SLBS fabriqués est effectuée par le QCM-D, de microscopie par fluorescence, et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) techniques. Suivi QCM-D est une technique de mesure de la masse de surface sensible qui, depuis le travail de pionnier réalisé par Keller et Kasemo 29, a été largement utilisé pour étudier quantitativement la formation de bicouche. La microscopie à fluorescence permet l&#39;inspection de l&#39;homogénéité de la membrane ainsi que la visualisation des domaines membranaires. La technique de FRAP est un outil standard pour déterminer la mobilité latérale de molécules lipidiques dans une SLB, qui est une propriété essentielle des membranes fluidiques. La première partie de cette étude consiste à analyser QCM-D de la SALB et des procédés de fusion des vésicules appliqué à la formation de bicouche tenter de dioxyde de silicium et d&#39;or. Dans la deuxième partie,la préparation et la caractérisation de membranes supportées contenant une gamme de concentrations de cholestérol avec le procédé SALB sont mises en évidence et les résultats sont comparés à ceux obtenus par la méthode de fusion de vésicules.

<table><tbody><tr><td>QCM-D substrats revêtus de dioxyde de silicium</td><td>QSense AB,&nbsp ; </td><td></td><td></td>Suède</tr><tr><td>QCM-D substrats dorés</td><td>QSense AB,&nbsp ; </td><td></td><td></td>Suède</tr><tr><td>Q-Sense E4 module</td><td>QSense AB,&nbsp ; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyant plasma Suède, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V)&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyle) (sel d’ammonium) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>cholestérol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Méthyl-&bêta ;-cyclodextrine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-propanol</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Coude mâle 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone 1.6&#160 ; mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle en verre n° 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Pompe péristaltique</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>Référence 71725</td><td></td></tr></tbody></table>

biomembrane fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (salb) méthode

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Afin d&#39;imiter les membranes cellulaires, la bicouche lipidique supportée (SLB) est une plate-forme qui permet attrayant dans l&#39;investigation in vitro des processus liés à la membrane, tout en conférant à la biocompatibilité et la biofonctionnalité des substrats solides. L&#39;adsorption spontanée et la rupture des vésicules de phospholipides est la méthode la plus couramment utilisée pour former SLBS. Toutefois, dans des conditions physiologiques, la fusion des vésicules (VF) est limitée à seulement un sous-ensemble de compositions lipidiques et des supports solides. Ici, nous décrivons un procédé général une étape appelée la méthode de formation assistée par solvant-lipide bicouche (SALB) afin de former SLBS qui ne nécessite pas de vésicules. Le procédé implique le dépôt SALB de molécules de lipides sur une surface solide en présence de solvants organiques miscibles à l&#39;eau (par exemple l&#39;isopropanol) et ultérieur solvant d&#39;échange avec une solution tampon aqueuse de manière à déclencher la formation SLB. L&#39;étape d&#39;échange de solvant continu permet l&#39;application de laProcédé selon une configuration d&#39;écoulement à travers convenant à la formation de la bicouche de surveillance et modification ultérieure en utilisant une large gamme de biocapteurs de surface sensible. La méthode SALB peut être utilisé pour fabriquer SLBS sur un large éventail de surfaces hydrophiles solides, y compris ceux qui sont insolubles à la fusion des vésicules. En outre, il permet la fabrication de composés de SLBS compositions lipidiques qui ne peuvent être préparés en utilisant le procédé de fusion de vésicules. Ici, l&#39;on compare les résultats obtenus avec les méthodes et la fusion des vésicules SALB classiques d&#39;illustration sur deux surfaces hydrophiles, du dioxyde de silicium et d&#39;or. Pour optimiser les conditions expérimentales pour la préparation de bicouches de bonne qualité préparés par le procédé SALB, l&#39;effet de divers paramètres, notamment le type de solvant organique dans l&#39;étape de dépôt, la vitesse d&#39;échange de solvant, et la concentration en lipides est traité en même temps que des conseils de dépannage . Formation des membranes supportées contenant fractions élevés de cholestérol est aussi démonstré avec la méthode SALB, soulignant les capacités techniques de la technique SALB pour une large gamme de configurations de membranes.

Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l&#39;or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

L'objectif général de cette procédure est de fabriquer des membranes supportées par la méthode de formation de bicouche lipidique assistée par solvant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie membranaire, telles que la compréhension des propriétés fondamentales des lipides et des protéines membranaires, ainsi que de permettre des applications telles que la découverte de médicaments et le diagnostic moléculaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de fabriquer des lipides supportés en couche dans de nombreux cas, ce qui n'est pas possible avec la méthode conventionnelle.La procédure est également facile à utiliser et nécessite des préparations d'échantillons minimales. Les implications de cette technique s'étendent à notre thérapie et à notre diagnostic, car elle permet l'étude de cibles médicamenteuses importantes telles que les protéines membranaires. La méthode peut également être utilisée pour fabriquer des substrats biocompatibles destinés à des applications en science des matériaux.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons discuté des difficultés liées aux méthodes conventionnelles de fabrication de membranes, en vue de présenter la procédure aux étudiants diplômés débutants de notre laboratoire. Préparez une solution mère de lipides à 10 milligrammes par millilitre de lipide DOPC en dissolvant la poudre de lipide dans une solution d'isopropanol. Ensuite, dissolvez la poudre de lipide DOPE marquée avec de la rhodamine dans une solution d'isopropanol afin d'obtenir une solution mère de lipides à un milligramme par millilitre.Effectuez une dilution et mélangez les solutions mères dans l’isopropanol afin de préparer le mélange lipidique désiré à la concentration finale pour des expériences de fluorescence, de microscopie et de récupération de fluorescence après photobléachissement ou FRAP. Le mélange lipidique doit contenir 0,5 % en poids de DOPE marqué par la R domine. Injectez le mélange lipidique dans l’isopropanol dans le canal microfluidique jusqu’à ce qu’il soit rempli. Incubez le mélange lipidique sur la surface en verre pendant environ 10 minutes.L'échange de sel doit être effectué à un débit très faible, sinon la qualité de la bicouche sera médiocre. Remplacez progressivement la solution lipidique par de l'eau ou une solution tampon à l'aide d'une pompe péristaltique fonctionnant à un débit très faible. Rincez ensuite abondamment le canal avec un excès de tampon afin d'éliminer l'isopropanol résiduel pour la formation de membranes supportées enrichies en cholestérol.Préparez une solution mère contenant du DOPC, du cholestérol lipidique et du rhodamine domine, étiqueté comme lipide DOPE, en dissolvant d'abord les poudres respectives dans de l'isopropanol, puis en répétant le même protocole qu'auparavant pour réaliser le test de fluidité membranaire. Immergez d'abord la lame de verre dans une solution de sulfate de sodium ESAL à 1 % pendant 10 minutes. Rincez ensuite soigneusement les lames à l'eau déionisée et passez-les à l'éthanol.Séchez les lames à l'aide d'un flux doux d'azote. Ensuite, exposez les lames au plasma d'oxygène pendant 30 secondes à puissance maximale de fréquence radio dans la chambre de plasma d'oxygène. Puis, retirez le film protecteur recouvrant la chambre microfluidique commerciale sans fond à l'aide de pinces et fixez la lame de verre sur la face adhésive de la chambre.Assemblez les raccords et les tubes aux positions d'entrée et de sortie de la chambre, puis placez le canal microfluidique sur la platine du microscope afin de former un bicouche lipidique supportée marquée par fluorescence dans le canal microfluidique, comme précédemment, en utilisant la composition lipidique souhaitée incluant 0,5 % en poids de rhodamine, un lipide DOPE marqué, dans un solvant inorganique. Ensuite, localisez le plan de la bicouche à l’aide d’un objectif à immersion huile de 60 x. Pour capturer des images, prenez d’abord deux images pré-photoblanchiment avant le photoblanchiment.Chauffer le laser jusqu'à ce que son intensité devienne stable. Ensuite, photoblanchir un point circulaire d'une largeur de 30 microns à l'aide d'un faisceau laser de 532 nanomètres et 100 milliwatts. Immédiatement après le photoblanchiment.Capturez une série d'images toutes les une seconde pendant deux minutes afin de suivre la récupération et l'intensité de fluorescence au niveau du point de photoblanchiment pour effectuer la quantification du cholestérol. Exposez d'abord la puce de capteur en quartz revêtue de dioxyde de silicium au plasma d'oxygène pendant 30 secondes à puissance radiofréquence maximale dans la chambre de plasma d'oxygène. Retirez la puce de la chambre et montez-la immédiatement dans la chambre de mesure, où un microbalance à cristal de quartz Q Sense E4 A à quatre canaux est utilisé avant l'expérience.Acquérir la fréquence et la dissipation du capteur et de l'air afin de garantir un montage correct. Pour ce faire, exécuter le logiciel qof. Cliquer sur acquisition et sélectionner configuration de la mesure dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, puis cocher les harmoniques 3, 5, 7, 9, 11 et 13.Ensuite, cliquez sur « find and run ». Afin de vérifier les spectres de résonance, réglez la température à 24 degrés Celsius. Une fois le montage correctement effectué, démarrez la pompe péristaltique et faites circuler la solution tampon dans la chambre de mesure à un débit de 100 microlitres par minute ; dans le logiciel, cliquez sur « acquisition » et sélectionnez « restart measurement » pour enregistrer les signaux de fréquence de résonance et de dissipation d'énergie.Répétez cette étape jusqu'à l'obtention d'une ligne de base stable. Pour les décalages de fréquence et de dissipation. Injectez l'isopropanol sans lipide pendant 10 minutes.Procéder ensuite à l'injection du mélange de lipide DOPC et de cholestérol dans le rapport molaire souhaité, à une concentration lipidique totale de 0,5 milligramme par millilitre dans l'isopropanol, pendant 10 minutes. Ensuite, injecter du tampon pendant 20 minutes à un débit de 100 microlitres par minute. Puis injecter une solution de méthyl béta cyclodextrine à une concentration de un millimolaire préparée dans le tampon jusqu'à ce que le signal de fréquence atteigne une valeur stable.Mesurez les décalages de fréquence positifs relatifs provoqués par l'étape de traitement au méthyl béta cyclodextrine et calculez les quantités massiques de cholestérol et de lipides DOPC comme décrit dans le protocole textuel. Calculez ensuite la fraction molaire de cholestérol dans le bicouche lipidique supporté, en tenant compte des masses moléculaires du lipide DOPC et du cholestérol. On observe ici une image représentative obtenue par microscopie de fluorescence d'une bicouche lipidique A-D-O-P-C contenant 0,5 pour cent en poids de lipide DOPE marqué à la rhodamine, formée sur des surfaces de verre par la méthode SAL.L'expérience de récupération de fluorescence après photobléaching a montré une récupération de fluorescence presque complète, indiquant la fluidité latérale de la bicouche lipidique. Voici des courbes représentatives de QCMD montrant les décalages de fréquence et de dissipation lors de la formation d'une bicouche supportée. En utilisant la méthode SAL, des décalages finaux de fréquence de résonance et de dissipation ont été obtenus, ce qui correspond à la formation d'une bicouche plane, une fois maîtrisée.Cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des biomembranes supportées en utilisant la méthode du bicouche lipidique assistée par solvant. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de préparer des solutions lipidiques fraîches avant l'expérience et d'optimiser l'échange de solvant en fonction de votre dispositif expérimental. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la microscopie à force atomique, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la formation de domaines membranaires.

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Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Cet article fournit une description détaillée de la création d’échantillons pour le suivi d’une seule protéine dans les bicouches lipidiques soutenues par des solides. Il explique aussi un microscope à fluorescence simple avec une sensibilité à une seule molécule et un taux d’images rapide. Enfin, nous exposons la procédure d’extraction des trajectoires à une seule protéine.

Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Apprenez à fabriquer des bicouches lipidiques supportées par la méthode SALB sans vésicules. Cette technique simplifiée utilise l'isopropanol et la microfluidique pour étudier les protéines membranaires et accélérer la découverte de médicaments.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

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