Name: Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Découvrez la microscopie intravitale pour observer les interactions leucocyte-endothélial et plaquette-leucocyte dans les veines mésentériques de souris. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des processus inflammatoires in vivo.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la loi de protection des animaux allemand (TierSchG). Les souris ont été logées et manipulés conformément aux bonnes pratiques de l&#39;animal tel que défini par la FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) et le corps de bien-être animal nationale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Le comité de protection des animaux de l&#39;Université de Fribourg ainsi que les autorités locales (Regierungspräsidium Freiburg) ont approuvé toutes les expérimentations animales. 1. manipulation des animaux, préparation et induction de l&#39;inflammation <ol><li> Utilisez 4-6 semaine Enfant souris mâles avec une gamme de poids de 16 - 20 g. Remarque: Si les souris sont plus âgés ou plus lourd qu&#39;ils présentent graisse excessive entourant la cuve, limitant l&#39;observation microscopique. </li><li> Stériliser tous les outils et table de microscope avant la chirurgie. </li><li> Injecter 20 mg / kg de LPS (lipopolysaccharide) par voie intraperitoneale quatre heures avant la microscopie dans la vie de souris pour induire une Inflamm bactérienneation. </li><li> Préchauffer une solution saline à 0,9% dans un bain-marie à 37 ° C pour humidifier la chambre en matière plastique et le tissu mésentère. </li><li> Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) juste avant que la procédure de microscopie. Anesthésie alternatifs peuvent être utilisés, par exemple, 2% inhalation d&#39;isoflurane. Confirmez anesthésie appropriée par la perte de la réponse à la stimulation réflexe (orteil ou pincement de la queue avec une pression ferme). </li><li> Épiler l&#39;abdomen à l&#39;aide d&#39;un rasoir et enlever les poils lâche avec de la gaze saturé avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse, tandis que sous anesthésie. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Stériliser l&#39;abdomen en utilisant 70% d&#39;éthanol. Cette méthode est une méthode non stérile et peut être mortelle à la fin de l&#39;expérience. </li><li> Effectuez une laparotomie médiane: Ouvrez la peau de l&#39;abdomen à l&#39;aide de petites pinces courbes et de petits ciseaux. Identifier l&#39;épigastrical navires et ouvrir le péritoine dans la région de la ligne blanche, à protéger les vaisseaux. </li><li> Appliquez quelques gouttes de sérum physiologique préchauffé dans la cavité abdominale de garder le tissu humide. </li><li> des leucocytes et des plaquettes d&#39;étiquetage par fluorescence en injectant 50 ul rhodamine 6G (1 mg / ml) rétro-orbitale, comme décrit avant 9,10. </li><li> Extérioriser une boucle de ileumand lieu dans une boîte de Petri d&#39;un diamètre de 10 cm et assurez-vous de garder le tissu humide en appliquant la 37 ° C préchauffé solution saline (0,9%) tous les autres minutes. </li></ol> 3. Microscopie intravitale <ol><li> Passer la souris sous le microscope et amener la veine mésentérique d&#39;un diamètre de 200 à 300 um dans le centre de la vue. Choisissez un navire sans environnement gras visible. </li><li> Ne pas toucher les vaisseaux mesentery évitant ainsi la stimulation de l&#39;endothélium. Manipulez la boucle de l&#39;iléon prudence. </li><li> Visualiser les interactions entre cellules endothéliales sanguinsavec un microscope inversé ou verticale et une caméra à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;microscope. Fiche sang des interactions des cellules endothéliales pendant 1 min à 4 veines différentes par souris. </li><li> Euthanasier la souris par dislocation cervicale après l&#39;achèvement d&#39;expériences d&#39;imagerie. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Effectuer l&#39;analyse hors ligne et aveuglé pour tous les paramètres. Procéder à une analyse en utilisant n&#39;importe quel logiciel approprié. </li><li> Confirmez conditions stables et comparables interindividually flux sanguin en haute résolution temporelle ciné-clips (taux de trame maximale) ont porté sur les flux de globules intraluminal. </li><li> Quantifier le nombre de leucocytes roulement. Avoisinant tracez une ligne verticale à travers la veine et compter tous les leucocytes qui traversent cette ligne en 1 min. </li><li> Déterminer la vitesse de roulement en mesurant le temps d&#39;une seule leucocytes a besoin de passer à une distance de 50 um tout en roulant de manière stable sur l&#39;endothélium. Pour ce faire, tirer deux lignes verticales sur une distance de 50 um trâce la veine. <ol><li> Mesurer le temps un leucocyte représentant a besoin d&#39;obtenir d&#39;une ligne à l&#39;other.Calculate la vitesse des leucocytes en divisant 50 um à travers le temps nécessaire (um / s). </li></ol></li><li> Mesurer l&#39;adhérence des leucocytes dans un domaine de 0,04 mm 2. Pour ce faire, dessiner un carré avec la longueur de côté de 200 um dans la veine. <ol><li> Comptez le nombre de leucocytes adhérents fermes, définis comme aucun mouvement visible pendant 30 secondes, dans ce carré. </li></ol></li><li> Comptez le nombre de plaquettes liés à l&#39;un des leucocytes à quantifier les interactions plaquettes-leucocytes. </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
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<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici la préparation et la performance de la microscopie intravitale de veines de mésentère des souris in vivo. Cette méthode nous donne l&#39;occasion d&#39;observer les interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-endothélial 11 directement dans l&#39;organisme vivant. Comme un début de réponse à l&#39;inflammation de l&#39;endothélium obtient activé et interagit avec les leucocytes et les plaquettes entraînant dans le laminage, l&#39;adhérence et ...

Le but de ce protocole est de décrire une technique simplifiée de microscopie intravitale de veines de mesentery chez les souris vivant pour l&#39;observation directe des interactions leucocytes-endothélial et leuco-plaquettaire dans des conditions inflammatoires. Microscopie intravitale a été développé pour étudier les interactions leucocytes-endothélial in vivo dans des conditions inflammatoires 1,2, ce qui est non pas anodine mais importante pour comprendre le recrutement des leucocytes inflammatoires et la fonction. La méthode que nous décrivons dans ce protocole a été développé sur la base de publications publiées antérieurement. Semblable à la visualisation plaquettes incorporation dans un thrombus croissante 3 et parallèlement à ce qui a été publié plus tôt 4, une veine mésentérique extériorisé est examiné par microscopie lumière transmise. Il existe divers autres modèles de la microscopie intra-vital tels que le muscle crémaster de rats 5 ou le foie des souris et des rats 6. Microscopie intravitale du mésentère veine a été développée et appliquée dans les études précédentes par plusieurs groupes. Nous avons utilisé cette technique pour observer des différences dans le recrutement des leucocytes entre les souris de type sauvage et le tryptophane hydroxylase1 (TPH1) - / - souris, qui sont déficientes de la sérotonine non-neuronales et comparé les résultats à des souris dont la sérotonine plaquettaire a été pharmacologiquement appauvri par à long terme inhibiteur de la demande d&#39;un recaptage de la sérotonine fluoxétine 7. Nous avons également examiné les interactions leucocytes-endothélial après le traitement par la fluoxétine aiguë 8. Dans ce protocole, nous nous concentrons sur la microscopie intravitale de veines de mesentery, parce que ce modèle peut être réalisé rapidement, et permet des mesures valides de interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-leucocytes. Cela est beaucoup plus difficile et beaucoup de temps dans la microscopie intravitale d&#39;autres organes, tels que les os, le foie, la peau, ou le muscle crémaster. Le model décrite ici est idéale pour l&#39;évaluation reproductible inflammatoire de l&#39;interaction cellule-cellule avec challengeing après un stimulus inflammatoire, comme l&#39;injection intraperitoneale de lipopolysaccharide.

<table><tbody><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides d’Escherichia coli 055 :B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

interactions microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Microscopie intravitale est une méthode qui peut être utilisée pour étudier des processus différents dans les différentes régions et des vaisseaux chez les animaux vivants. Dans ce protocole, nous décrivons la microscopie intravitale de veines de mesentery. Ceci peut être réalisé en un court laps de temps avec des résultats reproductibles montrant les interactions des leucocytes-endothélial in vivo. Nous décrivons un cadre inflammatoire après LPS défi de l&#39;endothélium. Mais dans ce modèle on peut appliquer de nombreux types différents de conditions inflammatoires, comme bactérienne, chimique ou biologique et d&#39;enquêter sur l&#39;administration de médicaments et de leurs effets directs sur l&#39;animal vivant et son impact sur le recrutement des leucocytes. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de traitements différents de souris et de leurs effets sur la réponse inflammatoire dans les vaisseaux. Ici, nous décrivons la visualisation des leucocytes et des plaquettes par marquage par fluorescence de la rhodamine 6G avec ceux-ci. En outre, toute imagerie spécifique peut être performed en utilisant des molécules cibles marquées par fluorescence.

Un aperçu de la création expérimentale décrite dans ce protocole est montré à la figure 1. Il montre une souris avec un iléon boucle extériorisée et ses navires, qui peut être observé en microscopie intravitale. La figure 2 montre certain degré d&#39;activation chez les animaux non traités en raison de la procédure elle-même. Mais il n&#39;y a presque pas de roulement lent ou adhésion ferme des leucocytes par rapport à des souris LPS-traités. La figure 2 montre égalemen...

Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les interactions entre les leucocytes, les cellules endothéliales et les plaquettes au cours de l'inflammation in vivo. Cette approche consiste d'abord à prétraiter une souris avec les substances d'intérêt et à marquer les cellules sanguines ; un iléon en anneau, ainsi que les vaisseaux mésentériques associés, sont ensuite extériorisés, et les interactions cellulaires STO qui se produisent dans une veine mésentérique sélectionnée sont observées par microscopie intravitale. En fin de compte, les interactions entre les leucocytes et les plaquettes, ainsi qu'avec les cellules endothéliales ou entre elles, peuvent être analysées.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'inflammation, telles que les types d'interactions leucocyte-endothélium ou plaquette-leucocyte qui se produisent in vivo lors de différents modèles d'inflammation ou après différents prétraitements d'intérêt. Quatre heures avant l'imagerie intravitale, injecter 20 milligrammes par kilogramme de LPS IP chez une souris mâle de 16 à 20 grammes, âgée de quatre à six semaines, afin d'induire une réponse inflammatoire bactérienne simulée.

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Microscopie intravitale à suivre spatiale et temporelle des événements hémodynamiques et inflammatoires dans la microcirculation piales.

Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation en temps réel des interactions cellules sanguines-endothéliales dans les veines mésentériales d’un modèle murin injecté par voie intrapéritonéale avec du lipopolysaccharide.

Microscopie intravitale pour analyser les interactions cellules sanguines-endothéliales dans un modèle murin d’inflammation

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Ici, nous montrons comment effectuer la microscopie intravitale sur les venules post-capillaires du muscle de cremaster de souris. Communément appliqués à différents modèles d’inflammation et de septicémie, en particulier ceux induits par les chimiothérapeutiques et les cytokines, nous soulignons sa pertinence dans l’étude des muscolopathies impliquant l’infiltration musculaire exagérée de leucocyte.

Infiltration de Leukocyte de Cremaster Muscle chez les souris évaluées par microscopie intravitale

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Ce protocole présente une méthode pour induire une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique et visualiser les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) dans les veinules mésentériques à l’aide de la microscopie intravitale. Le flux sanguin dans l’artère mésentérique supérieure a été limité pendant 1 h, suivi d’une reperfusion, permettant une quantification directe de l’adhésion leucocytaire et de la NETose.

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

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Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Découvrez la microscopie intravitale pour observer les interactions leucocyte-endothélial et plaquette-leucocyte dans les veines mésentériques de souris. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des processus inflammatoires in vivo.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

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