Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

L’objectif global de cette procédure est de déposer un mince assemblage de collagène sur les cellules dans un dispositif microfluidique. Ceci est accompli en modifiant d’abord le collagène natif acidifié par méthylation pour créer des molécules de collagène chargées positivement. La deuxième étape consiste à modifier le collagène natif acidifié par l’ation pour créer des molécules de collagène chargées négativement.

Ensuite, les dispositifs microfluidiques sont préparés et ensemencés avec des hépatocytes, qui sont laissés se fixer et se propager pendant la nuit. La dernière étape consiste à déposer l’assemblage du collagène en exposant alternativement les cellules aux solutions de collagène chargées positivement et négativement pour créer 10 bicouches de collagène au-dessus de la couche cellulaire. En fin de compte, la microscopie de phase et d’immunofluorescence ainsi que les dosages de l’albumine et de l’urée sont utilisés pour montrer le développement et le maintien de la polarité cellulaire et de la fonction sécrétoire.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet la culture d’hépatocytes dans des microdispositifs en utilisant des techniques similaires à celles appliquées dans les cultures sur plaque depuis plus de 20 ans. Il ne nécessite pas de conceptions de dispositifs complexes et la matrice déposée est très mince de l’ordre de 100 nanomètres. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lors d’un brainstorming sur la façon de traduire les techniques de culture cellulaire de Capy en classe des plaques aux dispositifs microfluidiques.

Les méthodes sandwich au collagène fonctionnent dans des systèmes microscopiques ouverts, mais les hydrogels utilisés sont incompatibles avec les microdispositifs fermés avec des hauteurs de canal limitées. Diluez 100 milligrammes d’une solution de collagène acidifié natif à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre avec de la glace, de l’eau froide et stérile, et placez la solution sur de la glace pour éviter l’alation. Ensuite, ajustez le pH de la solution de collagène entre neuf et 10 avec quelques gouttes d’un hydroxyde de sodium normal et remuez doucement la solution à température ambiante pendant 30 minutes.

Au fur et à mesure que le collagène précipite, la solution commencera à devenir trouble, faites tourner la solution de collagène précipitée qui 3000 fois G pendant 25 minutes. Ensuite, un précipité clair semblable à un gel doit être visible au fond des tubes, aspirez le nat, puis mettez en suspension le collagène précipité dans 200 millilitres de méthanol avec 0,1 d’acide chlorhydrique normal pour permettre à la réaction de méthylation de se produire en agitant à température ambiante pendant quatre jours après la centrifugeuse de méthylation, la solution à 3000 fois G pendant 25 minutes pour granuler le collagène méthylé, Ensuite, aspirez et éliminez le supinate de méthanol acidifié. Ensuite, dissolvez le collagène méthylé dans 25 millilitres de PBS stérile et filtrez la solution à travers une passoire cellulaire de 60 microns.

Ajustez le pH de la solution à 7,3 à 7,4 en utilisant des incréments de 20 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal. Évaluez la concentration de la solution de collagène à l’aide d’un kit ELIZA de collagène de rat commercial ou d’un kit de dosage de l’hydroxyproline. Diluez ensuite la solution à trois milligrammes par millilitre avec du PBS stérile.

Stérilisez la solution de collagène méthylé en la transférant dans une bouteille en verre avec un bouchon à vis. Appliquez soigneusement trois millilitres de chloroforme au fond de la bouteille et laissez la bouteille prendre toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin.

De manière aseptique, retirez la couche supérieure de collagène méthylé. Stockez le collagène méthylé à quatre degrés Celsius et utilisez-le dans un délai d’un mois. Diluez encore 100 milligrammes de solution de collagène acidifié natif à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre avec de la glace, de l’eau froide et stérile, et placez la solution sur de la glace pour éviter la dation comme indiqué précédemment, ajustez le pH de la solution de collagène avec de l’hydroxyde de sodium et remuez la solution à température ambiante pour précipiter le collagène.

Ensuite, dissolvez 40 milligrammes de six anhydrides cyniques dans 10 millilitres d’acétone. Ajoutez lentement ce mélange par incréments de 0,5 millilitre à la solution de collagène tout en remuant et en surveillant en permanence le pH de la solution. Maintenez le pH au-dessus de 9,0 en ajoutant une ou deux gouttes d’un hydroxyde de sodium normal lorsque le pH approche de 9,0, en remuant continuellement à température ambiante pendant 120 minutes.

Après avoir ajouté toutes les six solutions cyniques et hydrures, observez le mélange devenir clair à mesure que le collagène succinate se dissout, continuez à vérifier périodiquement le pH pour vous assurer qu’il reste supérieur à 9,0. Lorsque tout le collagène succinate est dissous, ajustez le pH de la solution à 4,0 en utilisant des incréments de 20 microlitres d’un acide chlorhydrique normal. Observez la solution, redevenez trouble à mesure que le collagène succinate précipite.

Ensuite, centrifugez la solution à 3000 fois G pendant 25 minutes. Pour granuler le collagène succinate, asbury et éliminer le snat acidifié avec de l’anhydride snic non réactif, dissoudre le collagène succinate avec un pipetage répété dans 25 millilitres de PBS stérile, ce qui donne une concentration finale d’environ trois milligrammes par millilitre. Filtrez ensuite la solution à travers une passoire à cellules de 60 microns, puis ajustez le pH de la solution entre 7,3 et 7,4.

À l’aide d’incréments de 20 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal, évaluez la concentration de la solution à l’aide d’un kit ELIZA de collagène de rat commercial ou d’un kit de dosage d’hydroxyproline. Diluez ensuite la solution à trois milligrammes par millilitre. À l’aide de PBS stériles, stérilisez cette solution de collagène de la même manière que la solution de collagène méthylé.

Commencez par fabriquer un dispositif microfluidique à l’aide d’une technique standard qui comporte des chambres de culture cellulaire de 100 microns de haut, de 0,4 à 1,5 millimètre de large et d’un à 10 millimètres de long pour la croissance cellulaire. Utilisez un nettoyeur plasma pour oxyder les surfaces de l’appareil et une lame de verre. Appuyez ensuite sur les deux ensemble pour former un lien.

Après avoir stérilisé l’appareil par exposition à la lumière UV pendant au moins 30 minutes. Remplissez la chambre avec 15 microgrammes par millilitre, de la fibronectine dans du PBS stérile et incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, voyez l’appareil avec des cellules comme décrit dans le protocole texte qui l’accompagne.

Dans une hotte de culture tissulaire à flux laminaire, préparez des volumes suffisants de solutions de collagène méthylé et ated pour 10 applications de chaque solution par dispositif, ainsi que quelques millilitres extrêmes de milieux. Gardez les solutions sur la glace. Alternez le rinçage des appareils avec 20 microlitres de solutions de collagène méthylé puis té.

Attendre une minute entre chaque application. Rincez l’appareil 10 fois au total par solution. Travaillez rapidement pour minimiser le temps pendant lequel les cellules sont sans média pendant la croissance des couches de collagène, il est possible d’observer le collagène s’accumuler lentement à l’entrée et à la sortie du dispositif microfluidique.

Si la résistance à l’écoulement du fluide augmente, rincez l’appareil une ou deux fois avec un fluide, puis poursuivez la superposition. Après avoir appliqué toutes les couches, rincez deux fois l’appareil avec un milieu frais et remettez-le dans l’incubateur. La méthylation et l’ation modifient les caractéristiques de charge des molécules de collagène.

L’ation élimine les groupes chargés positivement et les remplace par des groupes chargés négativement, et la méthylation supprime les groupes chargés négativement, créant des molécules nettes chargées positivement, permettant le dépôt couche par couche des deux variantes de collagène sur des surfaces chargées telles que les cellules. Les hépatocytes primaires ensemencés sur du verre recouvert de fibronectine dans un dispositif microfluidique peuvent être recouverts de cette couche par couche. L’assemblage de la matrice de collagène, le dépôt de 10 bicouches sur les cellules créent une épaisseur de couche de collagène d’environ 140 nanomètres d’hépatocytes sans collagène supérieur couche par couche.

Les matrices perdent leur phénotype différencié, se contractent et se décollent de la surface des dispositifs microfluidiques au fil du temps. En revanche, les hépatocytes recouverts d’un assemblage de collagène ultra mince conservent leur morphologie différenciée, une viabilité supérieure à 90 % et une polarisation sur 14 jours. En plus de la viabilité cellulaire, de la morphologie et de la polarisation, la technique du collagène couche par couche récupère et stabilise également la fonction des hépatocytes primaires, comme indiqué ici, Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de méthyler et de succiner le collagène pour créer des solutions de collagène nettes chargées positivement et négativement et comment les utiliser dans le dépôt couche par couche pour créer de minces assemblages de collagène au-dessus des cellules dans des dispositifs microfluidiques.