Name: Les échafaudages composites de fibres interfaciale Polyelectrolyte pour sortie temporellement contrôlée des biomolécules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez la fabrication d'échafaudages composites à base de fibres IPC pour la libération contrôlée de biomolécules en ingénierie tissulaire. Cette méthode permet de reproduire la niche cellulaire avec précision.

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Ce travail a été soutenu par le National Research Foundation de Singapour administré par l&#39;un de ses centres de recherche d&#39;excellence, l&#39;Institut Mechanobiology, Singapour. MFAC est soutenu par l&#39;Agence pour la science, la technologie et la recherche (Singapour) et l&#39;Agence nationale pour la recherche (France) programme commun sous le numéro de projet 1122703037. BKKT est soutenu par l&#39;Institut Mechanobiology. Nous remercions M. Daniel HC Wong pour la relecture du manuscrit et Mme Dawn JH Neo pour aider à la production vidéo.

1. Préparation des solutions de polyélectrolytes <ol><li> Purifier chitosane, comme détaillé dans Liao et al. En bref, créer une solution à 1% de chitosane dans 2% (p / v) (v / v) d&#39;acide acétique et de vide filtre à l&#39;aide de grade 93 papier filtre. Neutraliser le filtrat à l&#39;aide de NaOH 5M jusqu&#39;à ce que le pH est stabilisé à 7. Centrifuger la chitosane précipité à 1200 xg pendant 10 min. Décanter le surnageant et ajouter de l&#39;eau déminéralisée pour laver le chitosane. Répéter l&#39;étape de centrifugation et de lavage deux fois de plus. Congeler le chitosane précipité à -80 ° C et lyophilize O / N pour obtenir la forme purifiée. Stockez chitosane purifié dans une armoire déshumidifié. </li><li> Peser 1 g de chitosane purifié dans une boîte de culture de tissu stérile. Placez le chitosane dans la boîte de culture de tissu le plus près possible de la lampe UV dans l&#39;enceinte de sécurité biologique et d&#39;exposer à la lumière UV pendant 15 minutes. En utilisant des pinces stériles, placer le chitosane stérilisé dans un récipient en verre. Dissoudre chitosane en utilisant filtré 0.Acide acétique 15 M à une concentration finale comprise entre 0,5% et 1% (p / v). </li><li> Peser 0,1 g de sel de sodium de l&#39;acide alginique et dissoudre dans 10 ml d&#39;eau distillée désionisée (DDI) pour obtenir une eau 1% (p / v). Mélanger le sel de sodium de l&#39;acide alginique pendant au moins 2 heures sur le mélangeur vortex pour garantir une dissolution complète. Filtrer la solution d&#39;alginate à travers le filtre de seringue de 0,2 um. Conserver la solution d&#39;alginate à 4 ° C. </li><li> Reconstituer les facteurs humains recombinants de croissance comme facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) ou bêta - facteur de croissance nerveuse (NGF), tel que recommandé par le fabricant. </li></ol> 2. Dessin de fibres de la CIB <ol><li> Mélanger les protéines, les facteurs de croissance ou d&#39;autres biomolécules dans 10-20 pl aliquote de la solution de polyélectrolyte qui a une charge nette similaire. Les molécules biologiques avec charge négative (par exemple sérum-albumine bovine [BSA]) net doivent être mélangés avec une solution d&#39;alginate. Les molécules biologiques avec charge nette positive (par exemple VEGF) doivent être mélangés avecsolution de chitosane. </li><li> Placez petites portions (10-20 pi) de chitosane et d&#39;alginate sur une surface plane et stable recouverte avec du parafilm. Les gouttelettes d&#39;alginate et de chitosane doit être placé à proximité mais pas en contact les uns avec les autres. </li><li> Tremper légèrement chaque astuce sur une paire de pinces dans les chitosane et alginate gouttelettes. Apportez les gouttelettes de polyélectrolytes ensemble en pinçant les forceps. Lorsque les gouttelettes entrent en contact les uns avec les autres, tirer lentement la pince verticalement vers le haut pour tirer la fibre IPC de l&#39;interface des deux gouttelettes (figure 1A). </li><li> Placez soigneusement l&#39;extrémité de la fibre IPC tiré sur la pince sur un collecteur, comme un échafaudage polymère plat apposé sur un mandrin en rotation (voir la section 3 et 4). Tournez le mandrin à une vitesse fixe de 10 mm / s pour permettre la formation d&#39;uniforme et sans bourrelet fibres de la CIB. L&#39;augmentation de la vitesse de l&#39;étirage des fibres IPC former des billes, ce qui entraînera une libération d&#39;éclatement de incorporéterminaison de fibre biochimique et prématurée. 10 </li><li> Pour déterminer l&#39;efficacité d&#39;incorporation, de recueillir tous les liquides restants laissés sur le parafilm par dilution avec 500 pi de 1X tampon phosphate salin (PBS). Mesurer la teneur en protéine ou facteur de croissance dans le résidu par dosage BCA (pour BSA), ELISA (pour le VEGF et NGF) ou un test permettant de détecter les biomolécules incorporé. </li></ol> 3. La fabrication de composite hydrogel échafaudage de Pullulan-Dextran (PD) polysaccharide et fibres de la CIB <ol><li> Fabrication cadre de pullulane sacrificielle pour la collecte des fibres IPC <ol><li> Peser polysaccharide pullulane et mélanger avec distillée déminéralisée (DDI) de l&#39;eau pour créer un 20% (p / v) solution aqueuse. Mélanger la solution de pullulane O / N pour assurer l&#39;homogénéité. </li><li> Cast 15 g de solution de pullulane dans un 10 cm de culture de tissu à diamètre polystyrène (TCPS) plat. Sécher la solution de pullulane O / N à 37 ° C. Couper les films de pullulane dans 7mm x 7 mm cadres carrés. </li></ol></li><li> Préparer une solution de polysaccharide pullulane-dextran <ol><li> Créer une solution à 30% de polysaccharides pullulane et le dextrane (v / p) (rapport 3: 1) dans l&#39;eau DDI. Mélanger O / N pour assurer l&#39;homogénéité de la solution de polysaccharide. Ajouter lentement dans du bicarbonate de sodium à la solution de polysaccharide pour obtenir une concentration finale de 20% (p / v). Mélanger O / N pour assurer l&#39;homogénéité de la solution. Conserver la solution de polysaccharide à 4 ° C. </li></ol></li><li> Collecte des fibres de la CIB sur le cadre pullulane <ol><li> Fixez le cadre de pullulane sacrificielle (section 3.1) en utilisant une pince crocodile. Collez la pince crocodile et le cadre pullulane sur la fin du mandrin en rotation à l&#39;aide de ruban adhésif plastifié. Tournez le mandrin avec le cadre apposée à une vitesse constante de 10 mm / sec. Le cadre de pullulane peut être apposé sur le mandrin tournant dans les orientations souhaitées. </li></ol></li><li> Dessiner les fibres de la CIB en utilisant une paire de pinces (section 1) et attach l&#39;extrémité tirée des fibres de la CIB sur le cadre pullulane rotation. Dessiner les fibres de la CIB à une vitesse constante. En arrivant à l&#39;extrémité terminale de la fibre IPC, sécher la construction O fibres-sur-cadre / N à température ambiante. </li><li> Incorporation des fibres dans la CIB en PD hydrogel échafaudage </li><li> Pour chaque gramme de réticuler la solution de pullulane-dextrane, ajouter 100 ul de 11% (p / v) de sodium et le trimétaphosphate solution aqueuse d&#39;hydroxyde 100 ul de sodium 10M. 7 Mélanger la solution à 60 tpm en utilisant une plaque d&#39;agitation pendant de 1 à 2 min. Après l&#39;addition de trimétaphosphate de sodium et l&#39;hydroxyde de sodium, la solution de polysaccharide se réticuler presque immédiatement. Verser la solution de polysaccharide visqueux sur la construction des fibres-sur-cadre pour intégrer pleinement les fibres de la CIB. Incuber les fibres pullulane-dextran-IPC combinées (PD-CIP) à 60 ° C pendant 30 min pour former un chimiquement réticulés échafaudages composites (figure 1B). </li><li> ATTENTION: Effectuer l&#39;étape 3.3.2 dans la hotte et utiliser equi de protection appropriépement que l&#39;acide acétique est corrosif et inflammable. </li><li> Pour induire la formation de pores dans l&#39;échafaudage PD-IPC, plonger l&#39;ensemble échafaudage dans 20% (p / v) d&#39;acide acétique pendant 20 min. </li><li> Retirer réactifs ayant pas réagi par lavage échafaudages PD-IPC en 1X PBS pendant 5 min en agitant à 100 rpm. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Retirer l&#39;excès de PBS et de geler immédiatement les échafaudages PD-IPC à -80 ° CO / N. Lyophiliser les échafaudages au moins 24 heures avant l&#39;utilisation dans toute libération ou de la bioactivité des essais contrôlés. </li></ol> 4. La fabrication de composite échafaudage de PCL et fibres de la CIB ATTENTION: Le dichlorométhane est une substance dangereuse. Utilisez la hotte et l&#39;équipement de protection personnelle lors de la manipulation du dichlorométhane. <ol><li> Création vierges et motifs PDMS substrats <ol><li> Créer un polydiméthylsiloxane vierge (PDMS) substrat élastomère en utilisant un morceau de l&#39;EPTC de dimension souhaitée à l&#39;aide processus de lithographie douce. Créer patteRNED PDMS substrats en utilisant des méthodes lithographiques standards mous de poly (méthacrylate de méthyle) des modèles avec la topographie désirée. 12 </li></ol></li><li> Fabrication cadre PCL sacrificielle pour la collecte des fibres IPC <ol><li> Peser PCL et dissoudre dans du dichlorométhane pour créer un 0,9% (p / v) de solution. Pour chaque 1 cm2 de surface du substrat PDMS, déposer 500 pi de solution de PCL à 0,9%. Laissez la totalité du solvant dichlorométhane pour évaporer pleinement à la hotte. Répéter le processus de coulée de 0,9% PCL pour épaissir le film à l&#39;épaisseur désirée. Retirez le film PCL séchée du substrat PDMS. Créez un trou dans le cadre PCL utilisant un perforateur de taille appropriée. 2 </li></ol></li><li> Collecte des fibres de la CIB sur le cadre PCL <ol><li> Apposer le cadre PCL sacrificielle avec le trou (de 4.2.1) sur une pince crocodile. Collez la pince crocodile sur le mandrin en rotation en utilisant du ruban adhésif plastifié. Attachez l&#39;extrémité de la fibre tirée IPC sur le Fram PCLe avant de commencer la rotation à une vitesse constante de 10 mm / sec (section 2). Après la fin de l&#39;IPC fibrage, sécher la fibre sur châssis construction O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Intégration fibres sur châssis construire dans le substrat PCL motifs <ol><li> Déposez 500 pi de solution de PCL de 0,9% sur le substrat PDMS pour créer une base vierge PCL ou à motifs, comme l&#39;exige. Fonte des couches multiples de solution de PCL à 0,9% pour obtenir un échafaudage à l&#39;épaisseur souhaitée. Laissez la totalité du solvant dichlorométhane pour évaporer pleinement à la hotte. </li><li> Placez la construction fibre sur-cadre (section 4.3.1) sur le dessus de la base PCL. Ajouter la solution de PCL de 0,9% sur les plusieurs fois en fibres-sur-cadre construire pour obtenir l&#39;épaisseur désirée et intégrer pleinement les fibres de la CIB, la fabrication d&#39;un échafaudage composite PCL-CIB (figure 1C). </li></ol></li></ol> 5. Mesure de la dissémination d&#39;agents biologiques Composite IPC échafaudages <ol><li> Placez composite PD-IPC ouÉchafaudages PCL-CIB et autonome fibres de la CIB séparément dans une plaque de 24 puits. </li><li> Immerger l&#39;échafaud et autonome fibres IPC avec 500 pi de PBS 1X. Incuber les échantillons à 37 ° C. Recueillir PBS à divers points de temps (la libération des médias) et les remplacer par 500 pi de PBS 1X. </li><li> Mesurer la quantité de protéines ou de facteur de croissance dans les médias de libération en utilisant un dosage BCA (BSA), ELISA (VEGF et NGF) ou un autre dosage approprié de calculer le profil de libération cumulatif pour la biomolécule incorporé. </li></ol> 6. L&#39;ensemencement des cellules sur les échafaudages composites IPC pour tester la bioactivité des agents biologiques libérés <ol><li> Stériliser les échafaudages composites lyophilisés PD-CIB ou PCL-IPC en utilisant la lumière UV dans l&#39;enceinte de sécurité biologique pendant au moins 20 min. </li><li> Utiliser des techniques de culture cellulaire standard pour obtenir une suspension de cellules de 2 x 10 5 cellules dans 200 ul de milieu de croissance. Ensemencer la suspension cellulaire concentrée sur les échafaudages composites. After 20 min, top-up le volume de milieu de croissance pour submerger totalement les échafaudages. </li><li> Mesurer l&#39;activité des cellules par des techniques classiques telles que l&#39;activité métabolique bleu Alamar dosage, le dosage de l&#39;excroissance des neurites PC12 ou immunofluorescence. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

IPC fibres sont formées par l&#39;interaction de deux polyélectrolytes de charges opposées. Le procédé utilise l&#39;extraction du complexe à partir de l&#39;interface des polyélectrolytes, en facilitant un processus d&#39;auto-assemblage pour la formation de fibres stable. Le mécanisme de formation de fibres IPC assure que toute biomolécule ajouté dans un polyélectrolyte chargé de manière similaire peut être incorporé au cours du procédé de complexation. 10,11 A l&#39;inverse, l&#39;addition d&#39;une biomol...

La matrice extracellulaire a des signaux biochimiques et biophysiques inhérents qui dirigent les comportements cellulaires. L’imitation de ce microenvironnement physiologique tridimensionnel (3D) est une stratégie largement explorée pour les applications de médecine régénérative et d’ingénierie tissulaire. Par exemple, les substrats d’origine naturelle et synthétique ont été modifiés à l’aide de repères topographiques afin d’imiter l’environnement cellulaire biophysique. 1 Par exemple, les échafaudages en polycaprolactone (PCL) peuvent être facilement modelés en coulant sur des substrats PDMS à motifs. 2 Cependant, la plupart des échafaudages synthétiques récapitulent de manière inadéquate l’environnement biochimique contrôlé in vivo. La modification en vrac ou en surface des matériaux synthétiques ne présente que des signaux biochimiques pour la fixation des cellules, mais manque toujours de régulation temporelle de l’administration biochimique. 3 Ainsi, il est nécessaire de disposer d’échafaudages optimaux capables d’imiter le système de livraison biochimique régulé dans le temps de la matrice extracellulaire. 
Les systèmes d’administration biochimique tels que les microsphères sont en proie à des problèmes de perte de bioactivité et de faible efficacité d’incorporation en raison de la sévérité et de la complexité du processus de synthèse en plusieurs étapes. 4-6 Il a été démontré que les méthodes alternatives qui utilisent une méthode de fabrication et d’incorporation en une seule étape ont un excellent potentiel pour créer un microenvironnement biochimique favorable sans l’inefficacité de l’incorporation et la perte de bioactivité qui l’accompagnent. Une solution viable est l’utilisation de fibres de complexation polyélectrolytique (IPC) interfaciales pour délivrer et protéger les agents biologiques. Lorsque deux solutions aqueuses de polyélectrolytes de charge opposée sont réunies, les fibres IPC peuvent être retirées de l’interface. Pratiquement n’importe quel type de biomolécule hydrophlique en solution aqueuse peut être ajouté dans la solution de polyélectrolyte chargée négativement ou positivement, facilitant ainsi l’incorporation de biomolécules utiles dans la fibre IPC pendant le processus de complexation. De plus, ce processus ne nécessite que des conditions aqueuses et ambiantes, réduisant ainsi le risque de perte de bioactivité. En utilisant cette méthode, les facteurs de croissance actifs2,7 même les cellules8,9 ont été délivrés avec succès. De plus, la méthode simple de formation des fibres IPC permet de mouler dans n’importe quelle forme ou orientation. La stabilité de ces fibres a été avantageuse dans leur incorporation à la foisdans les polymères hydrophobes2 et hydrophiles 7 pour créer des échafaudages composites. Ces échafaudages composites avec des fibres IPC sont bénéfiques pour créer un environnement biochimique physiologiquement pertinent tout en fournissant un ancrage physique aux cellules. 
Dans cette étude, nous montrons une méthode pour incorporer des fibres IPC dans un échafaudage hydrophile et un échafaudage hydrophobe avec une topographie pour une libération contrôlée de biomolécules actives. En tant que preuve de concept, nous incorporons des fibres IPC à base de chitosane et d’alginate dans l’hydrogel hydrophile biocompatible, non immunogène et antigénique pullulan-dextran ou l’échafaudage hydrophobe polycaprolactone biocompatible.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp ;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Japon</td><td></td><td>Poids moléculaire (MW) 200 kDa. Ce matériau est du pullulan de qualité pharmaceutique utilisé pour fabriquer des cadres en pullulan et des échafaudages-IPC.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Ce matériau n’est plus produit par Sigma Aldrich. L’alternative suggérée est le numéro de catalogue 31392 (Sigma Aldrich). Ce matériau est utilisé pour fabriquer des échafaudages-IPC.</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Le bicarbonate de sodium doit être ajouté lentement à la solution de polysaccharide pullulan-dextran. L’ajout rapide de bicarbonate de sodium entraînera des précipitations.</td></tr><tr><td>Trimétaphosphate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Ce produit chimique est hygroscopique et doit être stocké dans l’armoire de déshumidification. La solution aqueuse de trimétaphosphate de sodium doit toujours être préparée à l’état frais.</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Ce matériau est dangereux et doit être manipulé avec un équipement de protection approprié tel que des gants en nitrile.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Degré d’acétylation de 75 % à 85 %. La purification du chitosane est nécessaire pour créer des fibres IPC stables.</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Merck</td><td></td><td>Cela peut être remplacé par un autre type de marque. Ce matériau est corrosif et inflammable. Des équipements de protection tels qu’un écran facial, des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et un couvre-chaussures doivent être portés lors de la manipulation de ce produit chimique dans la hotte.</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’acide alginique d’algues brunes, faible viscosité</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Dissoudre dans l’eau pendant la nuit. Filtrer à travers stérile 0,2&nbsp ; et micro ; Filtre à seringue avant utilisation. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr>Sérum <td>de bovin Albumine</td><td>Sinopharm Réactif</td><td></td><td>chimique Dissoudre dans du PBS stérile et filtrer à l’aide de 0,2 & micro ; m Filtre à seringue avant utilisation.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de dosage BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Ce kit a été utilisé pour mesurer la libération de BSA à partir d’échafaudages-IPC.</td></tr><tr><td>Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire recombinant humain</td><td>R& D systems</td><td>293-VE</td><td>Dissoudre le facteur de croissance dans une solution d’héparine à 0,2 % jusqu’à une concentration finale de 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de porcine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Cela peut être remplacé par un autre type de marque. Dissoudre le sel d’héparine dans de l’eau stérile à une concentration finale de 1 % et filtrer à 0,2 & micro ; m Filtre à seringue avant utilisation.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Ce type de cellule primaire a été utilisé dans le test pour déterminer la bioactivité du VEGF après libération des échafaudages-IPC.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Ceci est utilisé pour mesurer l’activité métabolique cellulaire. Incuber Alamar blue avec des cellules et le maintenir dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 2 à 4 heures. Mesurez l’absorbance à 570 nm pour déterminer le pourcentage de réduction du bleu d’Alamar, qui est corrélé à l’activité cellulaire.</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Lyophilizer</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Il s’agit d’un lyophilisateur non programmable qui fonctionne à -105 à -110&nbsp ; &deg ;C. Il peut être remplacé par d’autres lyophilisateurs de laboratoire standard.</td></tr><tr><td>Polycaprolactone (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Il n’est plus fabriqué par Sigma Aldrich. Il peut être remplacé par le numéro de catalogue Sigma Aldrich 704105.</td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Il peut être remplacé par un autre type de marque. Cette matière est dangereuse et doit être manipulée dans la hotte. Un équipement de protection doit être porté en tout temps lors de la manipulation de ce produit chimique.</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS ; 184 Kit d’élastomère de silicone)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Le kit d’élastomère est livré avec une base polymère et un réticulant. Le mélange de la base polymère et du réticulant dans des rapports différents entraînera une rigidité différente du PDMS.</td></tr><tr><td>Facteur de croissance du nerf bêta recombinant humain (NGF)</td><td>R& D systems</td><td>256-GF</td><td>Reconstitué dans de l’eau DI stérile jusqu’à une concentration finale de 100&nbsp ; et micro ; g&#8288 ;/&#8288 ;ml. Aliquote et stockage en -20 &deg ; C jusqu’à l’utilisation.</td></tr><tr><td>Cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Ce type de cellule a été utilisé dans le test pour déterminer l’effet synergique du NGF et de la nanotopographie.</td></tr><tr><td>Cellules de phéochromocytome PC12 du rat&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Ce type de cellule a été utilisé dans le test de croissance des neurites pour déterminer la bioactivité du NGF. Après l’exposition à un milieu de libération avec NGF, mesurer le nombre de cellules avec des extensions de neurites et normaliser au nombre total de cellules.</td></tr><tr><td>Papier filtre de grade 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Ceci est utilisé pour la purification du chitosane après sa précipitation avec de l’hydroxyde de sodium à pH 7.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse à godet oscillant</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>À utiliser lors de la purification du chitosane à une vitesse de 1 200 x g.</td></tr><tr><td>Moteur avec mandrin tournant à vitesse constante</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>Le moteur est utilisé pour la fabrication de fibres IPC sur châssis pullulan ou PCL.</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Stériliser par filtration (0,2 & micro ; m) et l’autoclave.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plat en polystyrène de culture tissulaire (TCPS) de 10 mm de</td> <td>diamètreGreiner</td><td></td><td>Le plat TCPS est utilisé pour le moulage du cadre en pullulan.</td></tr><tr><td>Kit ELISA VEGF humain</td><td>R& D systems</td><td>DVE00</td><td>Le kit ELISA est utilisé pour la détection du VEGF dans le milieu de démoulage.</td></tr><tr><td>Kit ELISA NGF humain</td><td>R& D systems</td><td>DY256</td><td>Le kit ELISA est utilisé pour la détection du NGF dans le milieu de démoulage.</td></tr><tr><td>Ruban adhésif plastifié</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>Le ruban adhésif est utilisé pour coller en toute sécurité la pince crocodile au mandrin rotatif</td></tr></tbody></table>

les échafaudages composites de fibres interfaciale polyelectrolyte pour sortie temporellement contrôlée des biomolécules

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Divers échafaudages utilisés en ingénierie tissulaire nécessitent un environnement biochimique contrôlé pour imiter la niche cellulaire physiologique. Les fibres de complexation polyélectrolytique (IPC) interfaciales peuvent être utilisées pour l’administration contrôlée de divers agents biologiques tels que des médicaments à petites molécules, des cellules, des protéines et des facteurs de croissance. La simplicité de la méthodologie de fabrication des fibres IPC donne de la flexibilité dans son application pour l’administration contrôlée de biomolécules. Ici, nous décrivons une méthode d’incorporation de fibres IPC dans deux échafaudages polymères différents, le polysaccharide hydrophile et la polycaprolactone hydrophobe, pour créer un échafaudage composite à plusieurs composants. Nous avons montré que les fibres IPC peuvent être facilement intégrées dans ces structures polymères, améliorant ainsi la capacité de libération prolongée et la préservation des biomolécules. Nous avons également créé un échafaudage polymère composite avec des repères topographiques et une libération biochimique soutenue qui peut avoir des effets synergiques sur le comportement cellulaire. Les échafaudages polymères composites avec des fibres IPC représentent une méthode nouvelle et simple pour recréer la niche cellulaire.

Dans cet article, nous avons cherché à créer des échafaudages composites à fibres de la CIB pour la libération prolongée de diverses biomolécules. Caractéristiques des biomolécules utilisées dans cette étude sont présentés au tableau 1. Fibres de la CIB ont d&#39;abord été intégrées dans un PD hydrogel hydrophile pour créer un échafaudage composite PD-CIB (figure 1B). molécule modèle BSA a été testé d&#39;abord de déterminer la faisabilité d&#39;utiliser un échafaudage composite pour la...

Les échafaudages pour l’ingénierie tissulaire doivent récapituler le microenvironnement biochimique et biophysique complexe de la niche cellulaire. Ici, nous montrons l’utilisation de fibres de complexation polyélectrolytiques interfaciales comme plate-forme pour créer des échafaudages polymères composites à plusieurs composants avec libération biochimique soutenue.

Les échafaudages composites de fibres interfaciale Polyelectrolyte pour sortie temporellement contrôlée des biomolécules

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

L'objectif général de cette procédure est de permettre une délivrance contrôlée de biomolécules avec un contrôle spatial afin de reproduire le compartiment cellulaire à partir de supports composites polymériques hydrophiles ou hydrophobes. Cela est réalisé en créant d'abord un cadre sacrificiel constitué de polymères souhaités, qui assure l'agencement spatial des fibres libérant les biomolécules, appelées fibres d'électrolyte interfacial ou fibres IPC. La deuxième étape consiste à intégrer les fibres IPC contenant la biomolécule hydrophile ciblée dans un cadre sacrificiel.Ensuite, les fibres IPC sur les structures de cadre sont intégrées dans un échafaudage plus grand à l'aide d'un substrat à motif microscopique servant de moule d'écoulement, incorporant des indices topographiques sur le substrat. La dernière étape consiste à permettre l'assimilation complète des fibres sur le cadre, la construction et la solidification des polymères afin de créer des substrats non structurés ou à motifs microscopiques. Enfin, des tests standards peuvent être utilisés pour montrer les profils de libération et l'activité biologique des molécules cibles.Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes existantes, comme la microencapsulation, réside dans le fait qu'il est désormais possible d'incorporer des biomolécules hydrophiles dans une grande variété de matrices polymériques hydrophiles ou hydrophobes selon un procédé simple d'incorporation et de fabrication. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la délivrance de médicaments, notamment la libération contrôlée de gradients biochimiques multiples, ainsi que l'effet synergique des indices topographiques et d'une libération biochimique prolongée sur le comportement cellulaire. La démonstration visuelle de la formation de fibres polyelectrolytiques est essentielle, car ces étapes sont difficiles à apprendre.La vitesse, la concentration et la pureté de la solution de polyélectrolyte sont tous des facteurs critiques pour la formation stable des fibres de CIP. Pour commencer, mélangez les protéines, facteurs de croissance ou autres biomolécules d'intérêt dans des aliquotes de 10 à 20 microlitres des solutions de polyélectrolyte, comme décrit dans le protocole accompagnant. Ensuite, déposez de petites gouttes de 10 à 20 microlitres de chitosane et d'alginate sur une surface plane et stable recouverte de parafilm. Les gouttes de chitosane et d'alginate doivent être placées en proximité étroite, mais sans être en contact les unes avec les autres.Trempez légèrement une extrémité d'une paire de pinces dans la goutte de solution de kites sand et l'autre extrémité dans la goutte d'alginate. Rapprochez ensuite les gouttes de polyélectrolytes en pinçant les pinces. Lorsque les gouttes entrent en contact, éloignez lentement les pinces verticalement afin de tirer une fibre issue de la complexation interfaciale des polyélectrolytes, appelée fibre IPC, à partir de l'interface entre les deux gouttes.Placer soigneusement l'extrémité de la fibre IPC tirée sur un collecteur composé d'un échafaudage polymère plat fixé sur un mandrin rotatif. Faire tourner le mandrin à une vitesse constante de 10 millimètres par seconde afin de permettre la formation de fibres IPC uniformes et sans perles. Une augmentation de la vitesse de tirage des fibres IPC entraînera la formation de perles, ce qui provoquera une libération en bouffée des composés biochimiques incorporés et une terminaison prématurée des fibres.Conformément à l'observation de Liao et al. et de KO et al., lorsque la fibre se termine, diluez le liquide restant avec 500 microlitres de PBS, puis mesurez la concentration en protéines ou en facteur de croissance résiduel. Afin de déterminer l'efficacité d'incorporation des biomolécules, pesez trois grammes de polysaccharide de Pologne et ajoutez-les à 15 millilitres d'eau distillée déionisée.Pour préparer une solution aqueuse à 20 %, mélangez la solution Poland pendant la nuit afin d'assurer une homogénéité le lendemain. Versez 15 millilitres de la solution Poland dans une boîte de culture tissulaire en polystyrène de 10 centimètres de diamètre. Laissez sécher la solution pendant la nuit à 37 degrés Celsius ; une fois sèche, découpez les films en carrés de sept millimètres sur sept millimètres servant de cadres sacrificiels Poland.Ensuite, préparez une solution à 30 % des polysaccharides Poland et de la dextrine dans de l'eau distillée désionisée selon un rapport de trois pour un. Mélangez lentement pendant la nuit afin d'assurer une homogénéité, puis ajoutez du bicarbonate de sodium à la solution de polysaccharides pour obtenir une concentration finale de 20 %. Mélangez la solution pendant la nuit et conservez la solution finale de polysaccharides à quatre degrés Celsius jusqu'à son utilisation. Fixez le cadre sacrificiel Poland dans l'orientation souhaitée sur le mandrin rotatif à l'aide d'une pince crocodile et d'un ruban adhésif plastifié.Faites tourner le mandrin avec le cadre fixé à une vitesse constante de 10 millimètres par seconde. Ensuite, commencez à tirer les fibres IPC comme indiqué dans la section précédente. Toutefois, cette fois, fixez l'extrémité tirée des fibres IPC sur le cadre tournant de Pologne.Attendre la fin du tirage de la fibre IPC par la suite. Sécher les fibres sur le cadre pendant toute la nuit à température ambiante. Ensuite, libérer le cadre du mandrin rotatif en le retirant de la pince crocodile.Placer la construction dans le bouchon d'un tube de microcentrifugeuse. Ensuite, placer cinq grammes de la solution de dextrine de Pologne dans un bécher et commencer à agiter à 60 tr/min. À l'aide d'un agitateur magnétique, ajouter 500 microlitres d'une solution à 11 % de phosphate de trimétyle de sodium et 500 microlitres de soude à 10 molaire.Pour réticuler la solution. Continuer à mélanger la solution pendant une à deux minutes, puis verser la solution visqueuse de polysaccharide sur les fibres du dispositif en cadre afin d'incorporer complètement les fibres IPC. Incuber le dispositif à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes pour former un support composite réticulé chimiquement et induire la formation de pores dans le support composite.Immergez entièrement la charpente dans une solution d'acide acétique à 20 % pendant 20 minutes. Rincez ensuite la charpente trois fois dans du PBS pendant cinq minutes en agitant à 100 tr/min. Pour éliminer tous les réactifs inactifs résiduels, retirez l'excès de PBS et congélez immédiatement les charpentes composites à moins 80 degrés Celsius pendant toute la nuit.Ensuite, lyophilisez les échafaudages pendant au moins 24 heures avant de les utiliser dans des tests de libération contrôlée ou d'activité biologique. Commencez par créer un substrat en PDMS propre et structuré, présentant une topographie souhaitée, à l'aide de méthodes classiques de lithographie souple. Préparez ensuite à la fois le cadre sacrificiel en PCL pour la collecte des fibres IPC et la base en PCL structurée en dissolvant d'abord 0,9 % de PCL dans le dichlorométhane.Pour chaque centimètre carré de surface du moule d'écoulement du film en PDMS, déposer 500 microlitres de la solution de PCL à 0,9 % sur le moule. Laisser le solvant s'évaporer complètement dans la hotte, puis répéter l'opération d'écoulement du PCL à 0,9 % afin d'épaissir le film. Ensuite, préparer le cadre sacrificiel en déposant, par portions de 500 microlitres, la solution de PCL à 0,9 % sur un substrat en PDMS vierge séparé.Pour créer un support de base en PCL pur, déposez plusieurs couches de PCL afin d'obtenir une structure de l'épaisseur souhaitée. Laissez complètement évaporer tout le solvant chlorure de méthylène dans la hotte lorsqu'elle a atteint l'épaisseur désirée. Retirez le film de PCL séché du substrat PDMS pur et percez un trou dans le cadre en PCL à l'aide d'un poinçon de taille PSAP.Ensuite, fixez le cadre en PCL sur le mandrin de collecte et commencez à tirer la fibre IPC sur le cadre comme décrit précédemment. Lorsque le tirage de la fibre IPC est terminé, retirez l'ensemble fibre-sur-cadre et laissez-le sécher toute la nuit à 25 degrés Celsius. Placez l'ensemble fibre-sur-cadre au-dessus de la base en PCL structurée et appliquez plusieurs fois la solution de PCL à 0,9 % sur l'ensemble fibre-sur-cadre afin d'obtenir l'épaisseur souhaitée et de garantir que les fibres IPC soient complètement intégrées.L'albumine sérique bovine ou BSA libérée du composite de dextrine de Pologne IPD a présenté une cinétique quasi linéaire, avec une libération initiale en sursaut atténuée suivie d'un état stationnaire concomitant. Après deux mois, la BSA a atteint une libération totale de 97 %. En revanche, les fibres IPC seules ont montré une libération rapide de 80 % de la BSA en quatre heures. En utilisant ce même composite, un facteur de croissance vasculaire a également pu être libéré de manière durable à partir des fibres, en utilisant des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine comme plateforme d'essai.Le facteur de croissance libéré s'est révélé bioactif après sa libération à chaque point temporel. Dans cet exemple, le facteur de croissance nerveux a été chargé dans les fibres sur une période de 18 jours. Environ 80 % du facteur de croissance nerveux chargé a été libéré du composite P-C-L-I-P-C selon un profil de libération linéaire et prolongé, comme démontré par un test de bourgeonnement neuritique sur cellules PC12.La quantité de facteur de croissance nerveux bioactif libérée à partir du support et dans le milieu à chaque point temporel a eu un effet similaire sur l'élaboration des neurites à celui observé lors de l'ajout de 30 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance nerveux dans un milieu ordinaire. Les supports composites P-C-L-I-P-C, contenant à la fois une topographie et un relargage contrôlé de facteur de croissance nerveux, pourraient exercer un effet synergique sur le comportement cellulaire. Les cellules souches mésenchymateuses humaines cultivées sur des supports composites nanostructurés ont montré un niveau plus élevé de différenciation neuronale par rapport aux cellules exposées soit à la seule topographie, soit au seul facteur de croissance.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de mélanger la molécule hydrophile souhaitée à la solution de polyélectrolyte de même charge nette afin de l'incorporer dans les fibres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer un échafaudage polycomposite doté d'une capacité de libération contrôlée de molécules actives. Les progrès importants présentés dans cette vidéo devraient vous permettre de concevoir un échafaudage pulmonaire capable de libérer de manière prolongée des facteurs de croissance, de libérer plusieurs facteurs de croissance simultanément, et de créer un gradient de signaux biochimiques permettant de recréer le microenvironnement physiologique.N'oubliez pas que le travail avec l'acide acétique, l'hydroxyde de sodium et le chlorure de méthyle peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle et d'une hotte de sécurité doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

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Fabrication d&#39;une mémoire de forme &quot;auto-ajustement&quot; à base de PCL bioactifs, Polymer Échafaudages

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Les échafaudages composites de fibres interfaciale Polyelectrolyte pour sortie temporellement contrôlée des biomolécules

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