Name: Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante In Vitro Modèle expérimental (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Apprenez à créer des cultures neuronales 3D couplées à des réseaux de micro-électrodes pour étudier l'activité électrophysiologique. Cette méthode innovante améliore la compréhension des réseaux neuronaux in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient Giorgio Carlini pour le soutien technique dans l&#39;élaboration de la structure de confinement et Dott. Ornella LoBrutto pour la révision approfondie du manuscrit. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de 7 ème programme-cadre de l&#39;Union européenne (TIC-FET FP7 / 2007-2013, FET Jeunes Explorateurs régime) sous convention de subvention 284772 CERVEAU BOW (www.brainbowproject.eu).

Le protocole expérimental a été approuvé par la législation européenne de protection des animaux (2010/63 / UE), par le ministère italien de la Santé, conformément à la DL 116/1992 et par les lignes directrices de l&#39;Université de Gênes (Prot. N. 13130, mai 2011). Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d&#39;animaux pour le projet et pour minimiser leur souffrance. 1. Préparation des matériaux et supports <ol><li> Construire le moule pour construire les PDMS (Poly-diméthyl-siloxane) contrainte au moyen d&#39;un CNC (commande numérique par ordinateur) fraiseuse. Un tel moule est réalisé en polycarbonate avec le cylindre central en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ce matériau permet une extraction plus facile du masque une fois que le PDMS a durci. REMARQUE: La conception du moule a été réalisé par Computer-Aided-Design (CAD), puis livré à la fraiseuse CNC. </li><li> Préparer l&#39;élastomère PDMS. PDMS est un polymère organique. Il est composé de deux éléments, Un agent de durcissement et un polymère. Mélangez par un rapport en volume de 1:10, une partie d&#39;agent de durcissement et neuf parties de polymère. Mettez les deux composants dans une boîte de Pétri, secouez et insérez le mélange dans la chambre à vide pendant 10 min pour éliminer les bulles d&#39;air. 3 g de PDMS sont suffisantes pour une contrainte. </li><li> Construire la contrainte PDMS. Insérez le matériau PDMS dans le mouleur et le mettre dans le four pendant 30 min à 120 ° C. La contrainte PDMS a la forme d&#39;un cylindre idéal avec un diamètre externe et interne de 22,0 mm et 3,0, respectivement, et une hauteur de 650 pm. </li><li> Le jour avant le placage, coupler le masque à la zone active des réseaux de micro-électrodes (AME) à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler sous un stéréomicroscope et stériliser le masque PDMS dans le four à 120 ° C. </li><li> Stériliser les microbilles de verre (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen de 42,3 ± certifié 1,1 pm) dans 70% d&#39;éthanol pendant 2 heures dans un flacon conique et tourner evEry 30 min pour exposer tous les microbilles. </li><li> Retirer la solution d&#39;éthanol à partir de la fiole et les microbilles rincer deux fois avec de l&#39;eau stérilisée. </li><li> Conditionner la partie centrale de la zone délimitée par la MEA masque PDMS (diamètre égal à 3,0 mm) avec 24 ul d&#39;une solution mixte de Poly-D-Lysine et laminine à 0,05 ug / ml. </li><li> Enduire les microbilles avec des protéines d&#39;adhérence, de la laminine et de poly-D-lysine à 0,05 ug / ml et de les laisser pendant une nuit à l&#39;étuve à 37 ° C, pour obtenir un réseau neuronal stable et de longue durée. </li><li> Retirer les facteurs d&#39;adhésion à la fois à partir de la surface du verre de la MEA et de microbilles de verre. Aspirer environ 95% de la solution de revêtement avec une pipette et appliquer une petite 24μl- en volume d&#39;eau stérile à la surface du MEA. Aspirer à nouveau plus de 95% de l&#39;eau et laissez la MEA à sec sous le capot laminaire pendant 1 h avant l&#39;ensemencement des cellules. NOTE: Dans le cas de microbilles place, aspirer le revêtementsolution et faire un premier lavage avec de l&#39;eau stérilisée et un second avec le milieu de base et son supplément comme B27, afin de conditionner la surface de verre où les neurones seront étalées. Ne laissez pas les microbilles sec. Les laisser en suspension dans le milieu de culture à l&#39;intérieur du flacon. </li><li> Distribuer, au moyen d&#39;une pipette -200 μl-, la suspension de microbilles traités (environ 32 000) sur une plaque à puits multiples avec insert de membrane (diamètre des pores 0,4 pm), où ils auto-assemblage formant une couche uniforme. </li><li> Remplir chaque puits de la membrane avec 0,5 ml de milieu et le mettre dans l&#39;incubateur (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) jusqu&#39;à ce que les neurones sont prêts à être plaqué (3.2). </li></ol> 2. Dissection d&#39;embryons et de la dissociation des tissus <ol><li> Maison rats femelles adultes (200-250 g) à une température constante (22 ± 1 ° C) et l&#39;humidité relative (50%) selon un calendrier clair-obscur régulière (la lumière sur les sept heures-19 heures) dans leanimalerie. Veiller à ce que la nourriture et l&#39;eau sont disponibles gratuitement. </li><li> Anesthésier un rat femelle enceinte après 18 jours de développement (E18) en utilisant 3% d&#39;isoflurane. Ensuite, sacrifier l&#39;animal par dislocation cervicale. </li><li> Retirer hippocampes de l&#39;embryon de rat et les placer dans une solution saline équilibrée de la glace froide de Hank sans Ca 2+ et Mg 2+. Au jour 18 de l&#39;hippocampe de développement et de tissus de cortex sont très doux et ne nécessitent pas d&#39;être coupé en petits morceaux. De plus amples détails peuvent être trouvés 18,19. </li><li> Dissocier le tissu à 0,125% de solution de trypsine / 0,05% de Hank contenant de 18 à 20 pour la DNAse min à 37 ° C. </li><li> Retirer la solution de surnageant avec une pipette Pasteur et arrêter la digestion enzymatique par addition de milieu avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 5 min. </li><li> Retirer le moyen de FBS et laver une fois avec du milieu avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml. Retirer à nouveau le milieu avec un pip Pasteurette et remplir à nouveau avec une petite quantité (500 pi) de milieu de croissance avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml. </li><li> Dissocier le culot tissulaire mécaniquement avec une pipette Pasteur étroite jusqu&#39;à une suspension laiteuse de cellules est apparent. Il est pas nécessaire de centrifuger la suspension cellulaire. </li><li> Diluer le faible volume de suspension de cellules avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 ml. Compter le concentration cellulaire obtenue avec une chambre de hémocytomètre. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de cellules de 600-700 cellules / ul. </li></ol> 3. Cellule Placage <ol><li> Cellules de la plaque à une densité d&#39;environ 2000 cellules / mm 2 sur la zone active de la MEA, définis par la contrainte de PDMS pour créer un réseau neuronal 2D. NOTE: Chaque hippocampe contient environ 5 x 10 5 cellules, (1 x 10 6 pour un seul embryon). Disséquer 6 embryons pour obtenir un montant total de 6 x 106 cellules dans 2 ml, et une concentration d&#39;environ 3.000 cellules / ul. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de la cellule et la plaque environ 600-700 cellules / ul. Si la zone de MEA délimitée par la contrainte est d&#39;environ 7,065 PDMS mm 2, et le nombre total de cellules étalées à 600 cellules / ul ul x 24 = 14.400 cellules, la densité finale de 2.038 cellules / mm 2. </li><li> Placez les dispositifs de MEA dans l&#39;incubateur humidifié avec atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C. </li><li> Distribuer 160 pl de la suspension à une concentration cellulaire de 600-700 cellules / ul (environ 100 000 cellules) sur la surface de la monocouche de microbilles placée à l&#39;intérieur des plaques multipuits pour terminer l&#39;étape préliminaire à la construction de culture en trois dimensions. Mettre les plaques à puits multiples dans l&#39;incubateur humidifié avec atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C. </li></ol> 4. Construction 3D Neuronal réseau <ol><li> 6-8 heures après le placage, transférer la suspension (microbilles avec les neurones) des plaques à puits multiples très soigneusement l&#39;intérieur de la zone délimitée par la contrainte PDMS en utilisant une pipette fixé pour un volume d&#39;environ 30-40 ul. Après chaque transfert, attendez pendant environ une demi-minute, pour permettre aux microbilles se auto-assembler dans une structure hexagonale compacte. </li><li> Une fois toutes les couches sont déposées et spontanément assemblés, remplir avec une forte baisse d&#39;environ 300 pi de milieu du haut de la zone délimitée par la contrainte PDMS. </li><li> Mettre la structure 3D couplée à la MEA dans l&#39;incubateur (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) pendant 48 heures avant d&#39;ajouter un volume final (environ 1 ml) de milieu de croissance avec la culture de son complément. NOTE: Considérons le nombre total de perles sur les plaques à puits multiples avec insert de membrane (30 000) et le nombre de perles sur une seule couche sur le dispositif de MEA (6000). La structure 3D résultante se compose de 5 couches de microbeads et des cellules. Tenant compte du fait que le réseau neuronal 3D est pas géométriquement parfaite, la structure 3D qui en résulte pourrait être composé de 5-8 couches. </li><li> Le jour après l&#39;étalement, ajouter soigneusement le volume final du milieu (environ 900 pi) à l&#39;intérieur de l&#39;anneau de MEA. Maintenir les cultures 3D dans une atmosphère humidifiée de CO2 (5%) à 37 ° C pendant 4-5 semaines. Remplacer la moitié du milieu une fois par semaine. </li></ol> 5. microscopie confocale Acquisition <ol><li> Fixer les échantillons biologiques à l&#39;étape du microscope dans un support. Réglez le laser (Argon, de 496 à 555 nm), la vitesse de balayage (400 Hz) à laquelle d&#39;acquérir l&#39;image, le gain et l&#39;offset (-0,3%) de PMT pour chaque image pour capturer le filtre bande passante d&#39;émission correcte et dans l&#39;ordre pour éviter la saturation et à augmenter le rapport signal à bruit. La section Résultats rapporte les valeurs utilisées pour acquérir les images de la figure 4. </li><li> Pour l&#39;acquisition de la séquence z -stack, sapinst sélectionner, la valeur de z position de la partie supérieure et la couche inférieure de l&#39;échantillon, puis sélectionnez la taille de l&#39;étape pour faire l&#39;acquisition. </li></ol>

<ol><li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li>
<li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li>
<li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li>
<li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li>
<li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li>
<li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+%28Part+1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li>
<li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng%22%5BJournal%5D)">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li>
<li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+En%22%5BJournal%5D)">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Review%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li>
<li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S%22%5BJournal%5D)">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cell%22">Culturing Nerve Cell</a>. , 2nd edition, MIT Press. (1998).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li>
<li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li>
<li>3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies. Frega, M., et al. Neural Engineering Conference, , IEEE. 957-960 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans ce travail, un roman expérimental dans la plateforme vitro constitué de 3D ​​conçu cultures de neurones couplés à AME pour électrophysiologie de réseau a été présenté. L&#39;utilisation des microbilles comme échafaudage pour permettre au long de l&#39;excroissance neuritique axe des z a été adapté pour être intégré avec le MEA plane. De cette façon, les résultats micro-système obtenus dans un modèle in vitro 3D valide et fiable pour étudier la dynamique électrophysiologiques émergents <su...

In vitro en deux dimensions (2D), les réseaux de neurones couplés à micro-électrodes (AME) Arrays arethe modèle expérimental étalon-or adoptée pour étudier l&#39;interaction entre les dynamiques neuronales et de la connectivité sous-jacente. Lors du développement, les neurones de recréer des réseaux complexes qui affichent ainsi l&#39;activité definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (ie, des éclats, des éclats de réseau, l&#39;activité de dopage aléatoire). AME enregistrent l&#39;activité électrophysiologique de nombreux sites (de quelques dizaines à des milliers de microélectrodes), permettant une étude détaillée de la dynamique exprimées au niveau du réseau. En outre, l&#39;utilisation de cultures dissociées rend possibile de concevoir-réseaux d&#39;ingénierie. Il est plus facile de comprendre de cette manière les relations fonctionnelles entre l&#39;activité électrophysiologique enregistrées et les paramètres de l&#39;organisation de réseau comme la densité cellulaire 3, degré de modularité 4,5, la présence de la pop neuronale hétérogèneglement 6, etc. Cependant, toutes les études in vitro sur des cellules en culture dissociés sont basés sur des réseaux neuronaux 2D. Cette approche conduit à des simplifications excessives par rapport à la (intrinsèquement 3 dimensions 3D) système in vivo: (i) dans un modèle 2D, Somata et de croissance cônes sont aplaties et l&#39;excroissance des axones-dendrites peut pas se propager dans toutes les directions 7. (ii) 2D in vitro réseaux exposition stéréotypé dynamique électrophysiologiques dominés par l&#39;éclatement activité impliquant la plupart des neurones du réseau 8. Récemment, différentes solutions ont été développées pour permettre la construction d&#39;dissocié in vitro 3D réseaux neuronaux. L&#39;idée commune consiste à créer un échafaudage où les neurones peuvent se développer dans un mode 3D. Un tel échafaudage peut être réalisé avec des gels de polymères et de matrices poreuses solides 9-13. En exploitant les propriétés mécaniques des polymères, il est possible d&#39;incorporer des cellules à l&#39;intérieur thesstructures de e en définissant un bloc uniforme des cultures 3D de neurosphères 11. La principale caractéristique de cette approche est la propriété mécanique rigide des neurosphères 9,12. Cependant, ces matériaux ont une porosité limitée, et ils ne garantissent pas la migration des cellules à l&#39;intérieur de la matrice. Pour pallier cet inconvénient, une solution possible consiste à découper la matrice en modules de «base». Malheureusement, la taille et la forme de la diversité des particules pourrait entraver l&#39;emballage dans des structures en couches régulières. Dans 7, Cullen et ses collègues ont conçu une construction neuronale 3D constitué de neurones et / ou des astrocytes dans un extracellulaire échafaudage à base de matrice bioactive. Un tel tissu neural conçu permis dans les enquêtes in vitro pour étudier et manipuler les réponses neurobiologiques dans des micro-environnements 3D. Ce modèle est composée de neurones et de cellules gliales distribuées dans toute la matrice extracellulaire (ECM) et / ou des échafaudages d&#39;hydrogel (500 à 600 pm d&#39;épaisseur). Dans ce condition, une viabilité cellulaire optimale (supérieur à 90%) a été trouvée en étalant les cellules à une densité finale d&#39;environ 3750 - 5000 cellules / mm 3. Il est à noter qu&#39;une telle valeur de densité est beaucoup plus faible que celle de la condition in vivo, où la densité de cellules du cortex cérébral de souris est d&#39;environ 90 000 cellules / mm 3 14. Pour surmonter cette limitation Pautot et ses collaborateurs 15 réalisé un système 3D in vitro où la densité cellulaire et la connectivité réseau sont contrôlés à ressembler à des conditions in vivo, tout en permettant l&#39;imagerie en temps réel du réseau. En pratique, ce procédé est basé sur le concept que dissociées sont des neurones en culture capable de croître sur des microbilles de silice. Ces perles offrent une surface assez grande pour les corps cellulaires neuronaux à respecter et pour leurs arborisations à grandir, mûrir, étendre, et de définir des contacts synaptiques avec d&#39;autres neurones croissance. Cette méthode exploite les propriétés d&#39;assemblage spontané de perles mono-dispersées à form 3D couches réseaux hexagonaux contenant des sous-ensembles distincts de neurones sur des couches différentes avec la connectivité entre les neurones contraint sur différentes perles. La densité cellulaire obtenue avec cette méthode était d&#39;environ 75 000 cellules / mm 3. Récemment, nous avons adapté la méthode de Pautot aux AME 16: les résultats obtenus montrent que l&#39;activité électrophysiologique 3D présente un répertoire plus large d&#39;activités que celui exprimé par des réseaux 2D. Cultures matures 3D présentent une dynamique améliorée dans laquelle les deux rafale de réseau et aléatoire l&#39;activité de pointe coexistent. De même, Tang-Schomer et ses collaborateurs ont réalisé 17 un échafaudage poreux à base de protéine de soie qui maintient une culture corticale primaire in vitro pour plusieurs mois, et enregistré l&#39;activité électrophysiologique à l&#39;aide d&#39;une électrode en tungstène. Dans ce travail, les procédures expérimentales de construire des réseaux neuronaux 3D couplés à AME sera décrite.

<table><tbody><tr><td>Laminine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0,05 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0,05 & micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0,125 % dilué 1:2 dans HBSS sans CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0,05 % dilué... dans la solution de Hanks</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049</td><td>milieu de culture</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>milieu à 2 % supplent</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>de gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>de poly-diméthyl-siloxane (PDMS)</td><td>Corning Sigma</td><td>481939</td><td>agent de durcissement et le polymère</td></tr><tr><td>Micro-Electrode Arrays Multi Channel Systems</td><td>(MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA avec : Grille d’électrodes 8x8 ; Espacement et diamètre des électrodes 200 et 30 & micro ; m, respectivement ; anneau en plastique sans fil</td></tr><tr><td>Microbille</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp ; 1 gr Partie en verre Taille Stds 40 & micro ; m</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar Sigma</td><td>CLS 3413</td><td>plaques multipuits avec insert membranaire (6,5 mm de diamètre, poreux 0,4 & micro ; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp ;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr> Solution <tr><td>tampon Hanks&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Téflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>polytétrafluoroéthylène</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Rat</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie confocale verticale</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 WATER objectif</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 Objectif EAU</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 Objectif WATER</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

cultures interface 3d engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: une innovante<em&gt; in vitro</em&gt; modèle expérimental

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Actuellement, les réseaux à grande échelle dérivés de neurones dissociés qui se développent et se développent in vitro sur des dispositifs de micro-transducteurs extracellulaires constituent le modèle expérimental de référence pour étudier les mécanismes neurophysiologiques de base impliqués dans la formation et le maintien des assemblages de cellules neuronales. Cependant, les études in vitro se sont limitées à l’enregistrement de l’activité électrophysiologique générée par les réseaux de neurones bidimensionnels (2D). Néanmoins, étant donné la relation complexe entre la structure et la dynamique, une amélioration significative est nécessaire pour étudier la formation et le développement de la dynamique des réseaux tridimensionnels (3D). Dans ce travail, une nouvelle plateforme expérimentale dans laquelle des réseaux 3D hippocampiques ou corticaux sont couplés à des réseaux de micro-électrodes planes (MEA) est présentée. Les réseaux 3D sont réalisés en enchaînant des neurones dans un échafaudage constitué de microbilles de verre (30-40 μm de diamètre) sur lesquelles les neurones sont capables de croître et de former des assemblages 3D complexes interconnectés. De cette façon, il est possible de concevoir des réseaux 3D composés de 5 à 8 couches avec une densité cellulaire finale attendue. La complexité croissante de l’organisation morphologique de l’assemblage 3D induit une valorisation des motifs électrophysiologiques affichés par ce type de réseaux. Par rapport aux réseaux 2D standard, où l’activité de rafale hautement stéréotypée émerge, la structure 3D modifie l’activité de rafale en termes de durée et de fréquence, et permet l’observation d’une activité de pic plus aléatoire. En ce sens, le modèle 3D développé ressemble davantage aux réseaux de neurones in vivo.

. Dans ce mode opératoire, un rôle important est joué par les microbilles qui définissent l&#39;échafaudage mécanique pour la croissance du réseau neuronal 3D figures affichage 1A et B la disposition des microbilles (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen certifiée de 42,3 ± 1,1 pm) dans le plan. La particularité de ces structures est que microbilles auto assembler spontanément définissant une géométrie hexagonale compacte (figure 1B et C). L&#39;échafaudage ains...

Dans ce travail, un nouveau modèle expérimental dans lequel des cultures neuronales 3D sont couplées à des réseaux de micro-électrodes planes (MEA) est presented. 3D les réseaux sont construits en enracinant des neurones dans un échafaudage composé de microbilles de verre sur lesquelles les neurones se développent et forment des structures 3D interconnectées.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

L'objectif général de cette procédure est de présenter un nouveau modèle de réseaux neuronaux tridimensionnels in vitro couplés à des réseaux de microélectrodes. Cela est réalisé en premier lieu en conditionnant la partie centrale du MEA avec une solution mixte de poly-D-lysine et de laminine, puis en recouvrant les microbilles de protéines d'adhésion, à savoir la laminine et la polylysine. La deuxième étape consiste à distribuer la suspension de microbilles traitées dans une plaque multipuits, où elles s'auto-assembleront et formeront une couche uniforme.La troisième étape de la procédure consiste à ensemencer les cellules sur la zone active de la MEA à une densité de 2000 cellules par millimètre carré afin de créer des réseaux neuronaux en 2D. Six à huit heures après l'ensemencement, la suspension est transférée des plaques multi-puits vers la MEA et les microbilles sont laissées libres de s'auto-assembler en une structure compacte hexagonale. Enfin, la microscopie confocale est utilisée pour visualiser les réseaux en 3D, qui sont comparés aux réseaux neuronaux conventionnels en 2D cultivés sur MEA.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures cellulaires dimensionnelles in vitro BDI, réside dans le fait que, dans un modèle dimensionnel BDI, les corps cellulaires et les cônes de croissance sont aplatis, et les axones ne peuvent pas s'étendre dans toutes les directions. De plus, l'activité en salves domine la dynamique électrophysiologique des réseaux BDI dimensionnels, tandis que dans un réseau tridimensionnel, une activité sporadique aléatoire coexiste également. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant l'article de recherche de Sophie Potto publié dans Nature Methods en 2008, dans lequel elle utilisait des MICROBITS comme support pour construire des réseaux neuronaux tridimensionnels.Nous avons ensuite adapté cette méthode afin d'effectuer les premiers enregistrements tridimensionnels in vitro. Pour préparer l'élastomère en PDMS, mélanger l'agent de réticulation et un polymère selon un rapport volumétrique de un pour neuf dans une boîte de Pétri. Agiter ensuite le mélange et le placer dans une chambre à vide pendant 10 minutes afin d'éliminer les bulles d'air.Pour construire la contrainte en PDMS, insérez le matériau PDMS dans le moule, puis placez-le au four pendant 30 minutes à 120 degrés Celsius. La contrainte en PDMS doit avoir la forme d'un cylindre dont le diamètre externe et le diamètre interne mesurent respectivement 22,0 et 3,0 millimètres, et une hauteur de 650 micromètres la veille de la mise en culture. Associez le masque à la zone active de l'EMN sous un microscope stéréo, puis stérilisez le masque en PDMS au four à 120 degrés Celsius.Ensuite, stérilisez les billes de verre dans un flacon conique contenant de l'éthanol à 70 % pendant deux heures, en effectuant une rotation toutes les 30 minutes afin d'exposer l'ensemble des billes par la suite. Éliminez la solution d'éthanol du flacon et rincez les billes deux fois avec de l'eau stérilisée. Puis, conditionnez la partie centrale de la zone MEA délimitée par le masque en PDMS avec 24 microlitres de solution mixte de polylysine et de laminine à 0,05 microgramme par millilitre.Recouvrir les microbilles avec des protéines d'adhérence, de la laminine et de la polylysine à 0,05 microgramme par millilitre. Par la suite, les placer au four à 37 degrés Celsius pendant la nuit afin d'obtenir un réseau neuronal stable et durable. Ensuite, distribuer la suspension de microbilles traitées dans la plaque multi-puits munie d'un insert à membrane, où elles s'auto-assembleront et formeront une couche uniforme.Ensuite, remplir chaque puits de la membrane avec 0,5 millilitre de milieu. Placer au four à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu'à ce que les neurones soient prêts à être ensemencés à cette étape. Après avoir sacrifié un rat femelle gravide à E18, obtenir les embryons de rat, puis retirer les hippocampes de chaque embryon de rat.Les placer dans du Hank glacé. Solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium. Ensuite, dissocier le tissu dans une solution de Hank contenant 0,125 % de tryine et 0,05 % d'ADN pendant 18 à 20 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant du milieu contenant 10 % de FBS pendant cinq minutes. Puis retirez le milieu contenant le FBS et rincez une fois avec le milieu de croissance, son supplément 1 % de L-glutamine et la gentamicine à 10 microgrammes par millilitre.Ensuite, retirez le milieu. Remplacez-le à nouveau par 500 microlitres de milieu de croissance. Complétez-le avec 1 % de L-glutamine et de la gentamicine à 10 microgrammes par millilitre.Dissocier mécaniquement le culot de tissu à l’aide d’une pipette PES étroite jusqu’à l’obtention d’une suspension cellulaire laiteuse. Ensuite, diluer un petit volume de suspension cellulaire avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 millilitres. Déterminer la concentration cellulaire obtenue à l’aide d’une chambre de cytométrie sanguine.Ensuite, diluez cette concentration selon un rapport de un à cinq afin d'obtenir la concentration cellulaire souhaitée de 600 à 700 cellules par microlitre. Ensemencez les cellules à une densité de 2000 cellules par millimètre carré sur la zone active de la MEA définie par la contrainte en PDMS pour créer un réseau neuronal en 2D. Puis, placez le dispositif MEA dans l'incubateur sous atmosphère d'oxyde de carbone humidifiée à 5 % à 37 degrés Celsius.Pour effectuer l'étape préliminaire de la construction d'une culture 3D, répartir 160 microlitres de la suspension ayant une concentration cellulaire de 600 à 700 cellules par microlitre sur la surface de la monocouche de microbilles positionnée à l'intérieur des plaques multi-puits. Ensuite, placer les plaques multi-puits dans l'incubateur sous atmosphère d'oxyde de carbone humidifiée à 5 % à 37 degrés Celsius. Six à huit heures après le semis, transférer 30 à 40 microlitres de la suspension contenant les microbilles et les neurones vers la zone de la MEA délimitée par la contrainte en PDMS. Après chaque transfert, attendre environ trente secondes pour permettre aux microbilles de s'auto-assembler en une structure hexagonale.Une fois que toutes les couches sont déposées et assemblées spontanément avec 300 microlitres de milieu au-dessus de la zone délimitée par la contrainte en PDMS, placez la structure 3D couplée à la MEA dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Par la suite, ajoutez un millilitre de milieu de croissance contenant son supplément. Après trois semaines in vitro, la structure 3D est stable, même en l’absence de la contrainte en PDMS, comme illustré.Voici une image en contraste interférentiel différentiel (DIC) d'une monocouche de billes couplées à la surface de la MEA. La position des points noirs représente la disposition spatiale des électrodes. La coloration immunofluorescente pour la map two, traduite par le signal rouge, montre la distribution de l'arborisation dendritique et de l'ADA des neurones autour des microbilles directement couplées au plan d'électrodes de la MEA.Cette image montre la projection maximale d'une séquence Zack d'une culture 3D affichant un réseau fortement interconnecté dans lequel les neurones sont marqués pour le nouveau N exprimé dans les neurones post-mitotiques matures, ainsi que pour le GABA. Voici un enregistrement électrophysiologique représentatif des réseaux hippocampiques en configuration 3D. Et voici un enregistrement électrophysiologique représentatif des réseaux hippocampiques en configuration 2D.Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en sept heures. Cependant, il convient de noter que, comme la procédure comporte plusieurs étapes effectuées à différents jours, l'estimation du temps nécessaire pour réaliser l'ensemble du protocole n'est qu'une indication. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer par ensemencer une couche 2D de neurones diurétiques sur l'électrode de la MEA, puis de transférer très soigneusement la suspension de microéléments et de neurones depuis la plaque multi-puits vers la MEA afin de former la structure 3D après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences computationnelles pour explorer comment la connectivité du réseau peut façonner la dynamique émergente du réseau. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de construire un réseau neuronal tridimensionnel in vitro couplé à des réseaux de microélectrodes.

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole fournit les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l'enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME.

Comment la culture, d&#39;enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

Cette vidéo démontre le développement d’une culture neuronale 3D couplée à un réseau de microélectrodes planes avec des neurones de l’hippocampe. Les neurones isolés forment un réseau 2D sur la zone active du réseau de microélectrodes et adhèrent aux microbilles de verre dans une plaque multipuits avec un insert de membrane. Lors du transfert de ces microbilles enrobées de neurones dans l’électrode, elles s’organisent en un réseau neuronal 3D interconnecté.

Construire des réseaux neuronaux tridimensionnels couplés à des réseaux de micro-électrodes

Cette vidéo montre la procédure d’utilisation du réseau de multiélectrodes (MEA) pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D. Cette méthode permet de comprendre la dynamique des réseaux neuronaux et l’activité des rafales de réseaux synaptiques dans les sphères 3D.

Utilisation de réseaux de multiélectrodes pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D

Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l'espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l'adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur ​​les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.

Conception, Traitement de surface, Cellulaire Placage et culture des réseaux neuronaux modulaires Composé de circuits Fonctionnellement Inter-connectées

Nous présentons un protocole pour cultiver des explants primaires de neurones murins du ganglion spiralé sur des réseaux multi-électrodes afin d’étudier les profils de réponse neuronale et d’optimiser les paramètres de stimulation. Ces études visent à améliorer l’interface neurone-électrode des implants cochléaires au profit de l’audition des patients ainsi que de la consommation d’énergie du dispositif.

Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Nous modifions et mettre en œuvre un protocole précédemment publié décrivant la différenciation rapide, reproductible et efficace des humains induite par cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) dans les neurones corticaux excitateurs 12. Plus précisément, notre modification permet un contrôle de la densité des cellules neuronales et l'utilisation sur des réseaux de micro-électrodes pour mesurer les propriétés électrophysiologiques au niveau du réseau.

Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l&#39;activité réseau sur Arrays Micro-électrode

Dans ce protocole, nous avons pour objectif de décrire une méthode reproductible pour les neurones de cellules souches dérivées pluripotentes humaines combinant dissociée et astrocytes ensemble en 3D sphère cocultures, maintenir ces sphères dans des conditions de flottement libres et par la suite mesure de l’activité synaptique circuit des sphères avec immunoanalyse et enregistrements multiélectrodes tableau.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole vise à démontrer comment combiner in vitro les baies de la microélectrode avec dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d’action dans les cultures de neurones. Analyse des données, à savoir la détection et la caractérisation des potentiels d’action, de la multiplication est effectuée en utilisant une nouvelle avancée, pourtant facile à utiliser et disponible gratuitement, outil de calcul.

Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale

L’impression 3D à l’échelle micrométrique permet le prototypage rapide de dispositifs polymères pour les cultures cellulaires neuronales. En tant que preuve de principe, les connexions structurelles entre les neurones ont été contraintes par la création de barrières et de canaux influençant la croissance des neurites, tandis que les conséquences fonctionnelles d’une telle manipulation ont été observées par électrophysiologie extracellulaire.

Polymérisation à deux photons : impression 3D de dispositifs de culture de cellules neuronales à micro-échelle

Ici, nous utilisons la HD-MEA pour approfondir la dynamique computationnelle des ensembles neuronaux à grande échelle, en particulier dans l’hippocampe, les circuits de bulbes olfactifs et les réseaux neuronaux humains. La capture de l’activité spatio-temporelle, combinée à des outils informatiques, fournit des informations sur la complexité des ensembles neuronaux. La méthode améliore la compréhension des fonctions cérébrales, identifiant potentiellement des biomarqueurs et des traitements...

Enregistrement et analyse de la dynamique d’ensemble neuronal multimodal à grande échelle sur un réseau de microélectrodes haute densité intégré au CMOS

Ce protocole vise à plaquer de manière stable des assembloïdes fusionnés dorsaux-ventraux sur des réseaux multi-électrodes pour modéliser l’épilepsie in vitro.

Une plate-forme multi-électrodes pour modéliser l’épilepsie à l’aide d’assembloïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Apprenez à créer des cultures neuronales 3D couplées à des réseaux de micro-électrodes pour étudier l'activité électrophysiologique. Cette méthode innovante améliore la compréhension des réseaux neuronaux in vitro.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante

Explorer plus de vidéos