Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante In Vitro Modèle expérimental

L’objectif global de cette procédure est de présenter un nouveau modèle de réseaux neuronaux tridimensionnels in vitro couplés à des réseaux de microélectrodes. Ceci est accompli en conditionnant d’abord la partie centrale du MEA avec une solution mixte de poly de lysine et de laminine, puis en enrobant les microbilles avec des protéines d’adhésion, de la laminine et de la polylysine. La deuxième étape consiste à répartir la suspension des microbilles traitées sur une plaque multipuits où elles s’auto-assembleront et formeront une couche uniforme.

La troisième étape de la procédure consiste à plaquer les cellules sur la zone active du MEA à une densité de 2000 cellules par millimètre carré pour créer des réseaux neuronaux 2D. Six à huit heures après le placage, la suspension est transférée des plaques multipuits au MEA et les microbilles sont autorisées à s’auto-assembler dans une structure compacte hexagonale. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour visualiser les réseaux 3D, qui sont comparés aux réseaux neuronaux 2D conventionnels développés sur MEA.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les cultures cellulaires dimensionnelles BDI in vitro, est que dans un modèle dimensionnel BDI, les cônes de somata et de croissance sont aplatis, Andon et rise ne peuvent pas se propager dans toutes les directions. De plus, l’activité d’éclatement domine la dynamique électrophysiologique des réseaux dimensionnels BDI tandis que dans un réseau tridimensionnel, une activité de balayage aléatoire coexiste également. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons lu l’article de recherche de Sophie Potto publié dans Nature Method en 2008, dans lequel elle utilisait les MICROBITS comme un échafaudage pour construire des réseaux tridimensionnels.

Nous avons ensuite adapté cette méthode à moi pour réaliser les premiers enregistrements in vitro en trois dimensions. Pour préparer l’élastomère PDMS, mélangez l’agent de durcissement et un polymère dans un rapport de volume de un à neuf dans une boîte de Pétri. Ensuite, secouez le mélange et placez-le dans la chambre à vide pendant 10 minutes pour éliminer les bulles d’air.

Pour construire la contrainte PDMS, insérez le matériau PDMS dans l’ancien mouleur, puis mettez-le au four pendant 30 minutes à 120 degrés Celsius. La contrainte PDMS doit avoir la forme d’un cylindre d’un diamètre extérieur et intérieur de 22,0 et 3,0 millimètres respectivement, et d’une hauteur de 650 micromètres la veille du placage. Couplez le masque à la zone active du MEA sous un stéréomicroscope, puis stérilisez le masque PDMS au four à 120 degrés Celsius.

Ensuite, stérilisez les microbilles de verre dans un flacon conique contenant de l’éthanol à 70 % pendant deux heures, en tournant toutes les 30 minutes pour exposer toutes les microbilles par la suite. Retirez la solution d’éthanol du flacon et rincez les microbilles deux fois avec de l’eau stérilisée. Conditionnez ensuite la partie centrale de la zone MEA délimitée par le masque PDMS avec 24 microlitres de solution mixte de polylysine et de laminine à 0,05 microgramme par millilitre.

Enduisez les microbilles de protéines d’adhésion, de stratifié et de polylysine à raison de 0,05 microgramme par millilitre. Par la suite, placez-les dans l’incubateur pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour obtenir un réseau neuronal stable et durable. Ensuite, répartissez la suspension des microbilles traitées sur la plaque multipuits avec un insert de membrane où elles s’auto-assembleront et formeront une couche uniforme.

Remplissez ensuite chaque puits de la membrane avec 0,5 millilitres de milieu. Mettez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les neurones soient prêts à être plaqués dans cette étape. Après avoir sacrifié une rat femelle enceinte E 18, obtenez les embryons de rat, puis retirez les hippopotames de chaque embryon de rat.

Placez-les dans des élans glacés. Solution saline équilibrée sans calcium ni magnésium. Ensuite, dissociez le tissu dans une solution de Hanks à 0,125 % d’essai contenant 0,05 % d’ADN pendant 18 à 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Après cela, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette Peor. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant un milieu avec 10 % FBS pendant cinq minutes. Retirez ensuite le milieu avec FBS et lavez une fois avec le milieu de croissance, son supplément 1 % L-glutamine et Gentamycine à 10 microgrammes par millilitre.

Par la suite, retirez le support. Remplissez-le à nouveau avec 500 microlitres de croissance. Douleur moyenne. Son supplément 1 %L-glutamine et Gentamycin à 10 microgrammes par millilitre.

Dissocier mécaniquement la pastille tissulaire à l’aide d’une pipette PEs étroite jusqu’à ce qu’une suspension laiteuse de cellules apparaisse. Après cela, diluez un petit volume de suspension cellulaire avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 millilitres. Comptez la concentration cellulaire obtenue avec la chambre du cytomètre hémologique.

Diluez ensuite cette concentration dans un rapport de un à cinq afin d’obtenir la concentration cellulaire souhaitée de 600 à 700 cellules par microlitre. Plaquez les cellules à une densité de 2000 cellules par millimètre carré sur la zone active de la MEA définie par la contrainte PDMS pour créer un réseau neuronal 2D. Ensuite, placez l’appareil MEA dans l’incubateur avec une atmosphère de dioxyde de carbone humidifiée à 5 % à 37 degrés Celsius.

Pour compléter l’étape préliminaire à la construction de la culture 3D, répartissez 160 microlitres de suspension avec une concentration cellulaire de 600 à 700 cellules par microlitre sur la surface de la monocouche de microbilles positionnée à l’intérieur des plaques multi-puits. Placez ensuite les plaques multipuits dans l’incubateur avec une atmosphère de dioxyde de carbone humidifiée à 5 % à 37 degrés Celsius, six à huit heures après le placage, transférez 30 à 40 microlitres de la suspension avec des microbilles et des neurones dans la zone de la MEA délimitée par la contrainte PDMS. Après chaque transfert, attendez environ une demi-minute pour permettre aux microbilles de s’auto-assembler dans une structure hexagonale.

Une fois toutes les couches déposées et assemblées spontanément à 300 microlitres de milieu sur le dessus de la zone délimitée par la contrainte PDMS. Mettez la structure 3D couplée au MEA dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après cela, ajoutez un millilitre de milieu de croissance avec son supplément après trois semaines in vitro, la structure 3D est stable même sans la contrainte PDMS montrée.

Voici une image DIC d’une seule couche de billes couplée à la surface MEA. La position des points noirs représente la disposition spatiale des électrodes. La coloration immunofluorescente pour la carte deux, qui est réfléchie par le signal rouge, affiche la distribution de l’arborisation dendritique et de l’ADA des neurones autour des microbilles directement couplées au plan de l’électrode de la MEA.

Cette image montre la projection maximale d’une séquence de Zack d’une culture 3D montrant un réseau hautement interconnecté où les neurones sont marqués pour le nouveau N exprimé dans les neurones post-mitotiques matures. Et pour gaba, voici l’enregistrement électrophysiologique représentatif des réseaux hippocampiques en configuration 3D. Et voici l’enregistrement électrophysiologique représentatif des réseaux de l’hippocampe en configuration 2D.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en sept heures. Cependant, il convient de noter que, puisque la procédure comporte plusieurs étapes qui ont été effectuées au cours de différentes journées, l’estimation du temps nécessaire pour réaliser l’ensemble de la procédure n’est qu’une indication. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de plaquer d’abord une couche 2D de diurétique neuronal à l’électrode du mea, puis de transférer très soigneusement la suspension des microbits et des neurones de la plaque multi-puits au mea afin de réaliser la structure 3D après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences computationnelles pour explorer comment la connectivité des réseaux peut façonner la dynamique émergente des réseaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un réseau neuronal tridimensionnel in vitro couplé à des réseaux de micro-électrodes.