Un criblables In Vivo Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent Caenorhabditis elegans

L’objectif général de l’expérience suivante est d’identifier la toxicité mitochondriale ou les effets bénéfiques des médicaments à l’aide de l’organisme modèle. C élégance. Ceci est réalisé par la quantification in vivo des niveaux d’un TP dans des souches transgéniques d’élans de mer qui expriment l’enzyme crucifère de la luciole fusionnée à la protéine fluorescente verte.

Le gène de fusion confère deux propriétés distinctes aux nématodes. La première est que lorsqu’on leur donne le substrat Lucifer, les nématodes émettent de la lumière dans le domaine visible proportionnellement à leurs réserves cellulaires A TP. Et la seconde est que lorsqu’ils sont éclairés avec la longueur d’onde appropriée, ils présenteront une forte fluorescence verte.

La fluorescence est indépendante des niveaux de nématodes d’un TP et est proportionnelle à leur masse ou à leur nombre. Par conséquent, il peut être utilisé pour normaliser les mesures de bioluminescence. Au cours d’un essai typique, une population de vers dont le développement est synchronisé est élevée jusqu’au stade larvaire L quatre.

Les nématodes sont ensuite traités avec les composés médicamenteux d’essai pendant un certain temps avant de mesurer la fluorescence et la bioluminescence. Les résultats montrent une toxicité potentielle des médicaments. Lorsque la bioluminescence est réduite, un signal amélioré indique qu’il faut procéder à d’autres tests pour des effets bénéfiques sur la fonction mitochondriale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le criblage de médicaments sur des cellules cultivées, est que le dépistage est effectué dans le contexte physiologique d’un organisme multicellulaire vivant entier avec près de 50 % d’ophtalmologie génétique chez l’homme. Et comme chez l’homme, l’élégance nécessite en fait une phosphorylation oxydative mitochondriale pour se développer à l’âge adulte et ses mitochondries partagent également avec les mitochondries de mammifères de nombreuses caractéristiques en termes de structure, de fonction, de leur bioénergétique. Les paramètres critiques du protocole comprennent le stade de développement auquel les expositions ont initié, la durée de l’exposition au nématode, à la drogue d’intérêt et l’ensemencement d’un nombre similaire de nématodes à chacun des puits, et bien sûr, l’évitement de la contamination le premier jour. Dans des conditions stériles, transférez les nématodes d’une plaque de milieu de croissance de nématode de six centimètres dans deux millilitres de milieu complet S dans un flacon contenant 30 grammes par litre d’e coli.

OP 50 dans le milieu S complet, puis incuber le ballon en l’agitant le quatrième jour, blanchir la culture de nématodes GR pour récolter les œufs et synchroniser la population de vers. Ensuite, incubez les œufs pendant la nuit dans une fiole en verre contenant 15 millilitres de milieu complet S en secouant le lendemain, le cinquième jour, les nématodes seront au même stade de croissance. Pour déterminer le nombre de vers éclos à l’aide d’une pointe propre à chaque fois, transférez trois aliquotes de 100 microlitres de nématodes dans des microtubes séparés contenant 900 microlitres de milieu, complétés par 0,01 % entre 20 pipetage de haut en bas à quelques reprises pour libérer les vers adhérant à la pointe.

Ensuite, comptez les nématodes dans quatre gouttelettes distinctes de 10 microlitres de chacun des tubes de dilution triplés, et calculez le volume de la suspension de nématodes nécessaire pour mettre en place deux cultures de 20 millilitres avec 10 nématodes par 10 microlitres, décantez les volumes approximatifs en deux tubes coniques pré-pesés de 15 millilitres. Pesez les tubes pour déterminer le volume réel distribué. Ensuite, ajustez les volumes cibles en tourbillonnant doucement et retirez le volume en excès.

Maintenant, lavez les nématodes dans un total de 14 millilitres de S frais, milieu complet par tube et suspendez les granulés dans cinq millilitres de milieu complet S avec 30 grammes par litre d’equali. OP 50. Transférez les nématodes dans des flacons coniques en verre contenant 15 millilitres de S avec 30 grammes par litre d’equali.

OP 50 à un volume total de 20 millilitres par fiole et consigner l’heure de l’alimentation. Faites la moyenne du nombre de nématodes dans neuf gouttelettes de 10 microlitres pour confirmer que les cultures sont diluées à 10 nématodes par 10 microlitres. Placez les cultures dans l’incubateur pendant 42 à 44 heures.

Le septième jour, tirez les cultures de nématodes dans un seul flacon en tourbillonnant doucement et continuellement. Transférez ensuite trois, quatre millilitres d’aliquotes de nématodes dans une seule auge stérile de 60 millilitres. Utilisez une pipette à huit canaux vers Eloqua, 25 microlitres de nématodes en suspension par puits dans 96.

Plaques de microtitration bien noires avec des fonds plats et transparents. Remettez ensuite les couvercles dans les assiettes et mettez les assiettes de côté. Chaque fois que deux plaques ont été ensemencées, transférez deux autres aliquotes de 2,5 millilitres de nématodes dans l’auge pour remplacer le volume perdu.

Après avoir ensemencé 13 à 14 plaques de nématodes, ajoutez 74 microlitres de milieu complet S dans chaque puits et transférez les plaques dans une chambre humide et un incubateur à agitation jusqu’à l’administration du médicament, pendant que les plaques agitent. Décongeler 2 96 plaques de médicament à souder pour les essais. Puis à l’aide d’une pipette multicanaux et en changeant les pointes à chaque fois.

Transférez un microlitre de la première colonne de la première plaque de médicament aux colonnes un à cinq d’une plaque de nématode. Transférez un autre microlitre de la deuxième colonne de la plaque de médicament aux colonnes huit à 12 de la plaque de nématode. Ajoutez ensuite un microlitre de véhicule aux colonnes six et sept de la plaque de nématode.

Utilisez les colonnes restantes de la plaque de médicament pour traiter le reste des plaques de nématodes de la même manière, en vous assurant d’inclure également deux plaques traitées pour tous les véhicules. Ensuite, remettez toutes les plaques dans les chambres humides de l’incubateur à secouer pendant encore 20 à 22 heures le huitième jour. Pour préparer une plaque de contrôle d’arrière-plan pour les lectures de fluorescence, combinez le contenu du puits d’une plaque de nématodes traitée pour tous les véhicules et laissez les nématodes se déposer pendant deux à trois minutes.

Ensuite, collectez les bactéries contenant du snat et chargez 100 échantillons de microlitres dans chaque puits d’une microplaque noire à fond transparent. Observez la plaque au microscope, en notant les puits dans lesquels les nématodes peuvent être vus pour permettre l’exclusion de ces puits de l’estimation du fond fluorescent. Ensuite, lisez la fluorescence pour mesurer la bioluminescence de chaque plaque.

À son tour, distribuez 50 microlitres de tampon de luminescence fraîchement préparé à chacun, placez bien la plaque sur une plate-forme d’agitation et démarrez la minuterie après trois minutes. Lire la luminescence à une seconde par mesure. Dans cette première expérience représentative, la pourriture connue d’un complexe mitochondrial un inhibiteur a réduit la production lumineuse par les nématodes après des expositions relativement courtes et plus longues à une gamme de concentrations.

Dans cette expérience, il a été démontré que l’herbicide paraquat diminue considérablement la bioluminescence, la fluorescence GFP et la bioluminescence normalisée de la souche C PE 2 54. De plus, la baisse de la bioluminescence était supérieure à celle de la fluorescence, ce qui correspond aux effets connus de la diminution de la fonction mitochondriale et de la réduction de la production de TP provoquée par le médicament. Ce graphique illustre l’exemple d’un composé qui améliore la bioluminescence du nématode, l’oxaloacétate intermédiaire du cycle de l’acide citrique, à une concentration unique de huit millimolaires.

Notez que la variabilité expérimentale observée entre ces répétitions n’est pas inhabituelle pour les expériences basées sur Lucifer. Ici, on a observé que les composés inhibiteurs de la luciférase Firefly affectaient l’activité des luciférers in vitro à 25 micromolaires et 100 micromolaires avec une atténuation presque complète de l’activité par le composé DDD. 1, 4 3 4, bien qu’elle ne soit pas directement comparable, une baisse significative de la bioluminescence a également été observée après un traitement in vivo par un composé inhibiteur de Lucifer.

Démontrer que les changements de bioluminescence peuvent résulter de l’action des inhibiteurs de l’enzyme Lucifer plutôt que de changements dans les niveaux de A TP in vivo. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de considérer que les composés peuvent affecter directement l’activité de l’enzyme luciférase de la luciole plutôt que d’affecter l’état énergétique du ver. Et par conséquent, les sous-chaleurs peuvent être validées à l’aide de nombreuses techniques d’évaluation de la fonction mitochondriale, comme, par exemple, la détermination de la consommation d’oxygène, la détermination du potentiel de membrane mitochondriale des espèces réactives de l’oxygène ou la visualisation des mitochondries dans les souches d’élégance marine.

Avec l’étiquette GFP, les mitochondries.