Name: 3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Apprenez la culture de chondrocytes articulaires humains dans des hydrogels 3D biomimétiques pour l'ingénierie du cartilage. Cette méthode permet d'étudier la régénération tissulaire et les maladies articulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier le département de chirurgie orthopédique de Stanford et la bourse de démarrage translationnelle de Stanford Coulter pour le financement. J.H.L. tient à remercier la bourse d’études supérieures de la National Science Foundation et la bourse de doctorat DARE pour leur soutien.

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices des sujets Stanford University humaines et approuvés protocole Institutional Review Board. 1. articulaire chondrocytes Isolation <ol><li> Obtenir cartilage à partir de tissus rejetés durant arthroplastie totale du genou et de disséquer comme décrit précédemment 8. </li><li> Sélectionner visuellement les condyles fémoraux interne ou externe d&#39;échantillons de cartilage pour surfaces lisses et de faire l&#39;incision à la surface du cartilage par le biais d&#39;un scalpel afin d&#39;éliminer les biopsies 4-5 mm de cartilage sans affecter l&#39;os sous-chondral. </li><li> Isoler des chondrocytes à partir de la matrice extracellulaire par dissociation enzymatique du tissu avec traitement O / N avec de la collagénase purifiée. Utilisation rapport 1: 1 de collagénase II (125 U / ml) et de la collagénase IV (160 U / ml) dans des milieux de croissance des chondrocytes à 37 ° C. </li><li> Le jour suivant, filtrer le tissu digéré contenant les cellules dissociées à travers un 70mm pores maillage de nylon. Laver deux fois avec 20 ml de DMEM / F12 et centrifuger à 600 g pendant 5 min. </li><li> Plaque chondrocytes isolées à une densité de 1 x 10 6 cellules / 60 mm boîte de culture suivant la remise en suspension dans du DMEM / F12 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 25 pg / ascorbate ml, 2 mM de L-glutamine, antibiotiques (100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, et 0,25 pg / ml fungizone). Conserver les plaques à 37 ° C et maintenir les cultures primaires de chondrocytes en monocouche à haute densité préalablement à l&#39;encapsulation dans des hydrogels biomimétiques. </li></ol> 2. biomimétique hydrogel Fabrication Remarque: cette méthode permet la synthèse biomimétique d&#39;un hydrogel contenant du poly (diacrylate d&#39;éthylèneglycol) (PEGDA, MW 5000 g / mole), la chondroïtine sulfate-méthacrylate (CS-MA) dans du DPBS. L&#39;ajout de photo-initiateur permet réticulation photoactivé. La composition d&#39;hydrogel finale contient 7% de peséet / volume (p / v) de PEGDA, 3% p / v de CS-MA, et 0,05% p / v de photo-initiateur. <ol><li> Synthétiser CS-MA par fonctionnalisation polymère CS avec des groupes méthacrylate. <ol><li> Préparer une solution tamponnée de 50 mM d&#39;acide 2-morpholinoéthanesulfonique (MES) et 0,5 M de chlorure de sodium (NaCl) en dissolvant 1,952 g de MES et 5,84 g de NaCl dans 200 ml d&#39;eau désionisée (DIH 2 O). Dissoudre 5 g de sel de sodium de sulfate de chondroïtine dans la solution tamponnée. </li><li> Ajouter 0,532 g (4,62 mmol) de N-hydroxysuccinimide (NHS) et 1,771 g (9,24 mmol) de (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide chlorhydrate (EDC) 1-éthyl-3- (rapport molaire NHS: EDC = 1: 2) à la solution et remuer pendant 5 min. </li><li> Ajouter 0,765 g (4,62 mmoles) de méthacrylate de 2-aminoéthyle (AEMA) (rapport molaire de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) à la solution et maintenir la réaction à température ambiante pendant 24 h. </li><li> Purifier le mélange par dialyse contre de l&#39;eau déminéralisée (diH 2 O) pour 4 jours en utilisant un tube de dialyse (12-14 kDa MWCO). </li><li> Filtrer la purified solution à travers un filtre de 0,22 um et placer les tubes ouverts contenant la solution dans le dessiccateur et le vide O / N. Veiller à ce que tous les tubes sont protégés de la lumière. Stocker le polymère dissous à -20 ° C à l&#39;abri de la lumière et de l&#39;humidité. </li></ol></li></ol> 3. Cellule Encapsulation <ol><li> Autoclaver les films et cylindriques tiges PCR (pour poinçonner les hydrogels 3D cellules chargées) et stériliser le moule cylindrique de gel sur-mesure par immersion dans 0,2 um filtrée éthanol à 70% en culture de tissus hotte sous lumière UV. </li><li> Sceller le fond du moule de gel avec un film PCR autoclave sans bulles d&#39;air ou des lacunes pour éviter les fuites. Gardez-le dans une plaque stérile de 150 mm. </li><li> Le jour avant l&#39;encapsulation des cellules dans hydrogel biomimétique, dissocier le chondrocyte monocouche de haute densité avec O / N collagénase II dans le traitement et la collagénase IV solution. Utilisez 125 U / ml pour la collagénase II et 160 U / ml pour chaque collagénase VI de la croissance des chondrocytes médiasà 37 ° C. </li><li> Prendre un tube de 50 ml et ajouter 5% en poids / volume (p / v) de poly (diacrylate d&#39;éthylèneglycol) (PEGDA, MM = 5000 g / mole), 3% p / v de sulfate de chondroïtine-méthacrylate (CS-MA), et 0,05% p / v dans du DPBS photoinitiateur. Vortex le tube pour mélanger la solution et le garder de côté. Protéger le tube de la lumière. </li><li> Recueillir les cellules dissociées dans un tube Falcon de 50 ml, compter et centrifuger à 460 g pendant 5 min. Aspirer tout le support du tube de cellules et ajouter le matériau de gel mixte ci-dessus pour les cellules remettre en suspension à une densité de 15 x 10 6 cellules / ml. Mélangez-le 30 fois à fond, tout en évitant la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Pipette 72 ul de la suspension ou d&#39;hydrogel seule cellule-hydrogel dans le moule de gel cylindrique sur mesure et d&#39;induire la gélification par l&#39;exposition à la lumière UV (365 nm de longueur d&#39;onde) à 3 mW / m 2 pendant 5 min. Préparer une solution d&#39;hydrogel sans contenu cellulaire. Utilisez ces constructions que les contrôles négatifs pour l&#39;avenir des tests biochimiques et mécaniques. Measure l&#39;intensité de la lumière UV avec une intensité de mètre UV. Pour ajuster l&#39;intensité, modifier la distance entre la source de lumière UV et l&#39;échafaudage d&#39;hydrogel pendant la gélification. REMARQUE: Depuis l&#39;hydrogel contient CS, la contribution acellulaire est soustraite de la teneur en GAG biochimique des hydrogels de cellules chargées de représenter uniquement les GAG cellulaire. </li><li> Utiliser un scalpel pour couper le film pour peler facilement et retirez soigneusement. Avec l&#39;aide des tiges cylindriques, pousser le gel dans une plaque à 6 puits avec 5 ml de DPBS stériles pour se laver de gel non polymérisé et les cellules lâches. </li><li> Culture de cellules hydrogels chargés dans des plaques de 24 puits contenant 1,5 ml de milieu de croissance des chondrocytes dans chaque puits. Utilisez une spatule jetable pour transférer les hydrogels lavés dans le puits. </li><li> Évaluer la viabilité des cellules par coloration morts 24 heures après l&#39;encapsulation en direct en utilisant un kit viabilité / cytotoxicité. Culture hydrogels de cellules chargées et les hydrogels vides pour 3-6 semaines changeant en gro de chondrocytes fraiswth médias tous les 2 jours avant la récolte pour les analyses. </li></ol> 4. Extraction de l&#39;ARN et le gène d&#39;expression Analyses <ol><li> Aspirer délicatement le support et mettez stérile PBS 1X sur la cellule chargée ainsi que les hydrogels de commande vides. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;une spatule stérile, transférer chaque hydrogel à 1,5 ml tube Eppendorf propre et ajouter 250 ul de Tri-réactif dans chaque tube. Suivez les instructions du fabricant pour isoler l&#39;ARN. </li><li> Après isolement de l&#39;ARN et quantification utilisation de celui-ci 1 ug de chaque échantillon et effectuer une transcription inverse en ADNc en utilisant le kit de transcription inverse en Haute Capacité ADNc. </li><li> Pour utiliser la PCR quantitative TaqMan Arrays Gene Expression pour l&#39;examen de l&#39;expression de vos gènes d&#39;intérêt. Normaliser les niveaux d&#39;expression des gènes à l&#39;intérieur de GAPDH. </li><li> Pour les conditions de PCR comprennent une incubation de 2 min à 50 ° C pour inactiver les amplicons précédents avec l&#39;uracile ADN glycosylase, suivie d&#39;une 1060; min d&#39;incubation à 95 ° C pour activer la polymérase Taq. Puis effectuer quarante cycles de PCR, composé de 15 sec à 95 ° C, et de 1 min à 60 ° C. </li></ol> 5. Analyses biochimiques <ol><li> Pour chacune des constructions cellulaires-hydrogel de quantifier l&#39;ADN et des glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) la production comme suit. </li><li> Aspirer délicatement le support et mettez stérile PBS 1X sur la cellule chargée ainsi que les hydrogels de commande vides. Peser un tube vide et de mettre l&#39;hydrogel à l&#39;intérieur après buvard sur papier de soie et enregistrer le poids ou le poids humide des hydrogels. </li><li> Congeler chaque hydrogel à -20 ° C dans un tube Eppendorf de 1,5 ml séparé pour la digestion enzymatique et utiliser plus tard une aliquote du produit digéré de fonctionner dosage Picogreen (pour l&#39;ADN) et de diméthyl-méthylène dosage bleu (pour GAG). </li><li> Préparer la solution de papainase pour digestion enzymatique des hydrogels. <ol><li> Préparer d&#39;abord le tampon PBE en pesant 7,1 g de sodium phosphat dee dibasique (Na 2 HPO 4) et 1,6 g de sel de disodium éthylènediaminetétraacétique acide (EDTA-Na 2). Dissoudre dans 500 ml de dH 2 O, ajuster le pH à 6,5 et filtrer la solution purifiée à travers un filtre de 0,22 mm. </li><li> Dissoudre 0,035 g de L-cystéine dans 20 ml de tampon PBE. Filtrer la solution et 100 ul d&#39;enzyme papaïne stérile. </li></ol></li><li> Lorsqu&#39;il est prêt pour effectuer les essais, prendre les tubes de -20 ° C et ajouter 300 ul de la solution de papaïne prêt à hydrogels congelés. Ecrasez le gel avec un mortier et un pilon et bien mélanger avec le pilon du moteur. </li><li> Porter le volume à 500 pl avec une solution de papaïne supplémentaire. Effectuez la même procédure pour les gels de contrôle. Incuber à 60 ° C pendant 16 heures 3,9. La solution contenant l&#39;hydrogel peut donc digéré l&#39;ADN utilisé pour la quantification et GAG. Mesurer la teneur en ADN en utilisant le test Picogreen avec Lambda ADN de phage en standard la suite de la pr du fabricantotocole. </li><li> Quantifier le contenu sulfaté GAG utilisant le bleu de 1,9-diméthylméthylène (DMMB) Essai de fixation de colorant avec du sulfate de chondroïtine requin en standard 10. Déterminer la teneur en GAG en divisant la quantité de GAG ​​pour le poids humide correspondante. </li></ol> 6. Essais mécaniques <ol><li> Effectuer des tests de compression non confinés en utilisant un système d&#39;essai Instron 5944 équipée d&#39;une cellule de charge 10 N. <ol><li> Après les jours souhaités de la culture in vitro, effectuer le test de compression sur l&#39;échafaud de la cellule-hydrogel et les hydrogels de contrôle acellulaire. </li><li> Plonger les échantillons dans un bain de PBS à la température ambiante et de compresser à un taux de 1% de déformation / sec à une souche maximum de 15% depuis la souche 11,12 physiologique connu par le tissu du cartilage sous condition de chargement a été signalé à 10-20% 13,14. </li></ol></li><li> Créer la tension en fonction des courbes de contrainte et ajustement de la courbe en utilisant une équation polynomiale de troisième ordre. Déterminer les compressive module tangent de la courbe équation d&#39;ajustement pour des valeurs de contrainte de 15%. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme indiqué dans ce protocole, les hydrogels 3D sont capables de maintenir chondrocytes phénotype dans la culture, en évitant le processus de dédifférenciation cellulaire dans les cellules fibrocartilagineuses habituellement rencontrés avec les cultures monocouches 15. En outre, des cultures à long terme de la construction chondrocytes- hydrogel ont révélé un environnement favorable qui maintient les caractéristiques cellulaires intrinsèques associés à l&#39;âge et la maladie. Utilisation d&#39;un hydrogel biomimétique 3D présente plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, l&#39;inclusion de sulfate de chondroïtine (CS), une composante majeure trouvé dans le cartilage articulaire, permettent aux cellules de dégrader la matrice d&#39;hydrogel en sécrétant chondroitinase et fixer cartilage nouvellement synthétisé extra-cellulaire matrice 5, 16. En outre, CS a été démontré pour avoir des propriétés anti-inflammatoires dans l&#39;articulation arthritique. L&#39;hydrogel biomimétique peut également être utilisé en tant que matériau d&#39;échafaudage pour la distribution des cellules dans la réparation du cartilage, et peut être modifié chimiquementpour faciliter une meilleure intégration de 17,18 tissu biomatériau. L&#39;utilisation des hydrogels de PEG-CS permet cultures à long terme des chondrocytes et l&#39;évaluation des propriétés biochimiques et mécaniques. Ici, nous montrons comment cette plate-forme peut être utile pour les analyses comparatives des diverses sources de chondrocytes différenciés afin de définir le type de cellule optimale pour l&#39;ingénierie de cartilage. Fait intéressant, les chondrocytes encapsulés dans des hydrogels restent viables et prolifèrent en fonction de leurs capacités intrinsèques. Les supports de la composition d&#39;hydrogel, en fait, la croissance de sains jeunes et adultes chondrocytes comme représenté sur la Figure 2. La composition et la structure des hydrogels décrits favorise également la formation de tissu cartilagineux, comme indiqué par le dépôt d&#39;une matrice extracellulaire fonctionnelle évaluée par des glycosaminoglycanes (GAG ) quantification. Un avantage supplémentaire est que les constructions de chondrocytes hydrogelpeuvent être évalués pour les propriétés mécaniques du tissu cartilagineux nouvellement formé. Notez que le test de compression simple doit être effectué sur l&#39;hydrogel acellulaire pour la comparaison. Les hydrogels, en fait, ont une rigidité intrinsèque en raison de la rigidité des groupements CS. Souche de compression simple de 5-20% (à un taux de déformation de 1% / s) peut être appliqué pour le contrôle mécanique du tissu cartilagineux 11,12 depuis la souche physiologique connu par le tissu du cartilage sous condition de chargement a été signalé à être 10-20 13,14%. La réponse des deux cellules chargées et acellulaire hydrogels à contrôle mécanique a été évaluée à la culture point final. Dans l&#39;exemple décrit ci-dessus, nous avons observé une rigidité comparable des constructions contenant des chondrocytes juvéniles et adultes par opposition à la raideur inférieure des constructions contenant des chondrocytes arthrosiques. De telles propriétés mécaniques de la construction de cellules d&#39;hydrogel permettent l&#39;évaluation des propriétés fonctionnelles de latissu formé donnant une analyse en profondeur de la capacité de la maturation des cellules. En conclusion, l&#39;utilisation des hydrogels biomimétiques 3D pour étudier le potentiel différent de population de chondrocytes pour générer tissu cartilagineux peut être largement appliquée. Outre les études in vitro décrits ici, la transplantation in vivo des constructions cellulaires chargées peut être envisagé d&#39;étudier la maturation des cellules et le potentiel de régénération dans le contexte physiologique. D&#39;autres modifications de la plate-forme d&#39;hydrogel avec des facteurs biomimétiques supplémentaires peuvent également être envisagées pour optimiser la prolifération des chondrocytes et de la maturation.

Avec son potentiel d’autoréparation limité, le cartilage articulaire humain subit des dommages irréversibles fréquents. Des efforts considérables sont actuellement concentrés sur le développement d’approches cellulaires efficaces pour le traitement des lésions du cartilage articulaire. Le succès de ces thérapies cellulaires dépend fortement de la sélection d’une source cellulaire optimale et du maintien de son potentiel de régénération. Les chondrocytes sont une source cellulaire courante pour la réparation du cartilage, mais leur approvisionnement est limité et peut se dédifférencier lors de l’expansion in vitro en culture monocouche 2D, limitant ainsi leur génération de cartilage hyalin 1. 
L’objectif de ce protocole est d’établir une plateforme d’hydrogel en 3 dimensions pour une étude comparative in vitro de chondrocytes humains d’âges et d’états pathologiques différents. Contrairement à la culture bidimensionnelle (2D) conventionnelle, les hydrogels tridimensionnels (3D) permettent aux chondrocytes de conserver leur morphologie et leur phénotype et fournissent un environnement physiologiquement pertinent permettant aux chondrocytes de produire du tissu cartilagineux 2,3. En plus de fournir une structure physique 3D pour la culture de chondrocytes, les hydrogels imitent la fonction de la matrice extracellulaire (MEC) du cartilage natif. Plus précisément, l’inclusion de méthacrylate de sulfate de chondroïtine fournit un réservoir potentiel pour les facteurs paracrines 4 sécrétés et permet la dégradation à médiation cellulaire et le renouvellement de la matrice 5. Bien que de nombreux systèmes de culture d’hydrogel 3D aient été largement utilisés dans diverses études, y compris les gels d’agarose et d’alginate, nous avons utilisé un système de culture 3D biomimétique qui présente des avantages distincts pour la culture de chondrocytes. Le sulfate de chondroïtine (CS) est un composant abondant dans le cartilage articulaire et il a été démontré que les hydrogels PEG-CS maintiennent et même améliorent le phénotype chondrogénique et facilitent la dégradation et le renouvellement de la matrice à médiation cellulaire 2,5. De plus, les propriétés mécaniques de l’échafaudage d’hydrogel peuvent être facilement modulées en modifiant la concentration de PEG et peuvent donc être utilisées pour améliorer davantage le potentiel de régénération des chondrocytes ou d’un type cellulaire apparenté 6,7. Le PEG/CSMA est également biocompatible et a donc le potentiel d’une application clinique directe dans les défauts du cartilage, par exemple. La limitation de ce système est sa complexité et l’utilisation de la photopolymérisation qui peut potentiellement affecter la viabilité cellulaire par rapport à des systèmes plus simples comme l’agarose, mais les avantages pour la culture de chondrocytes l’emportent sur les limites potentielles.
La culture d’hydrogel 3D est compatible avec les tests conventionnels pour l’évaluation du phénotype cellulaire (expression génique, immunocoloration des protéines) et des résultats fonctionnels (quantification de la production de matrice cartilagineuse, tests mécaniques). Cet environnement 3D favorable a été testé pour comparer le potentiel de régénération tissulaire des chondrocytes humains de trois populations d’âges différents dans des cultures 3D à long terme. 
Les résultats ont été évalués à l’aide d’essais phénotypiques et fonctionnels. Les chondrocytes juvéniles, adultes et OA ont montré des réponses différentielles dans la culture d’hydrogel biomimétique 3D. Après 3 et 6 semaines, l’expression des gènes chondrogènes a été régulée à la hausse dans les chondrocytes juvéniles et adultes, mais a été régulée à la baisse dans les chondrocytes OA. Le dépôt de composants du tissu cartilagineux, y compris l’aggrécane, le collagène de type II et le glycosaminoglycane (GAG), était élevé pour les chondrocytes juvéniles et adultes, mais pas pour les chondrocytes OA. Les modules de compression des constructions cartilagineuses résultantes ont également montré des tendances similaires. En conclusion, les chondrocytes juvéniles et adultes ont montré une disposition chondrogénique et matricielle cartilagineuse jusqu’à 6 semaines de culture 3D dans des hydrogels. En revanche, les chondrocytes arthrosiques ont révélé une perte de phénotype cartilagineux et une capacité minimale à générer un cartilage robuste.

<table><tbody><tr><td>chondrocytes juvéniles (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System )</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>chondrocytes adultes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>poly(diacrylate d’éthylène glycol)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-morpholinoéthananesulfonique acide</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>photoinitiateur</td><td>Irgacure&nbsp ;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de chondroïtine sel de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide chlorhydrate</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoéthyle méthacrylate</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>tube de dialyse</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp ;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase 2</td><td>Worthington Biochimique&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Collagénase 4</td><td>Worthington Biochimique&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>média DMEM/F12</td><td>HyClone, Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>SH3002301&nbsp ;</td><td></td></tr> test <tr><td>live/dead</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri réactif</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Kit Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystéine</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-diméthylméthylène bleu&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement de lumière UV - XX-15LW Lampe de banc, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Système d’essai Instron 5944&nbsp ;</td><td>Instron Corporation</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes culture and cartilage generation

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Le cartilage articulaire humain est très sensible aux dommages et a un potentiel d’autoréparation et de régénération limité. Les stratégies cellulaires pour modifier le tissu cartilagineux offrent une solution prometteuse pour réparer le cartilage articulaire. Pour sélectionner la source cellulaire optimale pour la réparation tissulaire, il est important de développer une plate-forme de culture appropriée pour examiner systématiquement les différences biologiques et biomécaniques dans le cartilage issu de l’ingénierie tissulaire par différentes sources cellulaires. Ici, nous avons appliqué une plateforme de culture d’hydrogel biomimétique tridimensionnelle (3D) pour examiner systématiquement le potentiel de régénération du cartilage des chondrocytes juvéniles, adultes et arthrosiques (OA). L’hydrogel biomimétique 3D était composé d’un composant synthétique poly(éthylène glycol) et d’un composant bioactif sulfate de chondroïtine, qui fournit un microenvironnement physiologiquement pertinent pour la culture in vitro de chondrocytes. De plus, l’échafaudage peut potentiellement être utilisé pour l’administration de cellules pour la réparation du cartilage in vivo. Le tissu cartilagineux modifié dans l’échafaudage peut être évalué à l’aide de l’expression quantitative des gènes, de la coloration par immunofluorescence, des tests biochimiques et des tests mécaniques. En utilisant ces résultats, nous avons pu caractériser le potentiel de régénération différentielle des chondrocytes d’âges différents, à la fois au niveau de l’expression génique et dans les propriétés biochimiques et biomécaniques du tissu cartilagineux modifié. Le modèle de culture 3D pourrait être appliqué pour étudier les différences moléculaires et fonctionnelles entre les chondrocytes et les cellules progénitrices à différents stades de développement normal ou aberrant.

Hydrogels bioactifs contenant PEG et groupements CS (Figure 1) représentent une plateforme idéale pour la culture et la maturation des chondrocytes articulaires humains 2,3,5,7. Les chondrocytes provenant de différents âges et états pathologiques peuvent être cultivées à la méthode décrite et analysés pour déterminer leur phénotype, l&#39;expression des gènes et des propriétés biochimiques et mécaniques du tissu cartilagineux généré. Trois échantillons de chondrocytes, juvenile- 6 mois, 34 ans et adulte-osteoarthritic- de 74 ans, ont été récoltés après 3 semaines de culture dans des hydrogels biomimétiques 3D. Analyse de l&#39;expression génique des chondrocytes normaux, les deux juvéniles et adultes, a montré une augmentation de l&#39;expression des gènes COL2A1 et COL6A1 chondrocytes. Au contraire, les chondrocytes malades ont montré une diminution spectaculaire de Col2a1 tout en conservant l&#39;expression de COL6A1 (figure 2) montre une perte de phénotype chondrogénique en dépit d&#39;être cultivées dans un milieu favorable biomimétique. Les hydrogels CS-PEG servent aussi un environnement dynamique pour les chondrocytes de proliférer, digèrent la matrice pré-existante de PEG et CS et déposent leur matrice péricellulaire et extracellulaire, les principaux composants du tissu cartilagineux mature. Compte tenu de ces capacités, l&#39;expansion des chondrocytes après 3 semaines de culture in vitro peut être estimée par quantification de l&#39;ADN avec le colorant Picogreen. L&#39;analyse comparative des trois groupes de cellules montrent que la densité de cellules de juvéniles et adultes populations était inchangée alors que les chondrocytes arthrosiques présentaient une diminution spectaculaire par rapport à jour 1 de la culture. Une perte de la teneur en ADN a également été observée pour d&#39;autres OA mais pas possible chondrocytes suggérant la mort cellulaire lors de la culture à long terme (figure 3). La matrice sécrétée a été quantifiée comme le contenu sulfaté GAG par dosage de liaison au colorant DMMB au stade de point final après 3 semaines de cultures. Contenu GAG est normalisée par le poids humide de l&#39;hydrogel comme Recorded avant la digestion enzymatique et la contribution acellulaire est soustraite. Comme le montre la Figure 4, les chondrocytes déposé une quantité importante de GAG similaire pendant 3 semaines de culture en 3D hydrogels. La présence d&#39;un échafaudage physique permet l&#39;évaluation des propriétés biomécaniques des échantillons grâce à des essais de compression non confiné 2,3. Alors que les hydrogels acellulaires subissent une diminution de la compression des modules, des constructions de cellules chargées de maintenir les modules en compression au bout de 3 semaines en culture (figure 4). Le phénotypique, des analyses biochimiques et biomécaniques décrites ici sont donc utiles pour évaluer et comprendre le potentiel des populations de chondrocytes différentes pour le cartilage d&#39;ingénierie. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Figure 1. PEG-CS hydrogels biomimétiques pour 3D chondrocytes culture. Les chondrocytes sont remis en suspension dans un mélange contenant du poly (diacrylate d&#39;éthylèneglycol) (PEGDA) et la chondroïtine sulfate-méthacrylate (CS-MA) et coulé dans le moule cylindrique de gel-mesure. Après l&#39;exposition aux UV, solidifiés gels sont collectées à partir des moules et la viabilité cellulaire est évaluée par coloration morts en direct 24 h post-encapsulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Figure 2. Expression des gènes chondrogéniques dans les chondrocytes humains cultivés dans des hydrogels biomimétiques 3D. D&#39;expression génique quantitative des marqueurs du cartilage Col2a1 et COL6A1 par juvéniles, adultes et OA chondrocytes après 3 semaines de culture dans des hydrogels biomimétiques 3D. Les valeurs sont normalisées au niveau de l&#39;expression des gènes au jour 1. Erreur bars représentent moyenne ± SD. p * &lt;0,05 comme déterminé par un test t de Student bilatéral. Modifié à partir Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Figure 3. contenu de l&#39;ADN dans les chondrocytes humains cultivés dans des hydrogels biomimétiques 3D. ADN de quantification par dosage Picogreen dans juvéniles, adultes et OA chondrocytes après 3 semaines de culture dans des hydrogels biomimétiques 3D. Les valeurs sont normalisées à niveau de l&#39;ADN au jour 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; la figure 4. GAG mesure de la teneur et non confiné essai de compression de chondrocytes humains au jour 1 et au bout de 3 semaines de culture dans des hydrogels biomimétiques 3D. (A) GAG quantification par dosage DMMB en chondrocytes au jour 1 et au bout de 3 semaines de culture, hydrogels biomimétiques 3D. Les valeurs sont normalisées à poids (ww) mouiller et exprimées en pg / g. (B) Module de compression (kPa) de acellulaires et cellulaires chargés hydrogels au jour 1 et après 3 semaines de culture dans les hydrogels biomimétiques 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La réparation du cartilage représente un défi médical non relevé et les approches cellulaires pour concevoir le cartilage articulaire humain sont une solution prometteuse. Ici, nous décrivons les hydrogels biomimétiques tridimensionnels (3D) comme un outil idéal pour l’expansion et la maturation des chondrocytes articulaires humains.

3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une culture tridimensionnelle en hydrogel biomimétique afin d'agrandir les chondrocytes articulaires et de générer du cartilage articulaire humain. Cela est accompli en premier lieu en disséquant les condyles fémoraux obtenus lors d'une arthroplastie totale du genou, en retirant le tissu cartilagineux de l'os sous-chondral, puis en isolant les chondrocytes de la matrice extracellulaire par dissociation enzymatique. La deuxième étape consiste à synthétiser le polymère méthacrylé de sulfate de chondroïtine pour la fabrication d'un hydrogel biomimétique.Ensuite, les chondrocytes sont encapsulés dans des hydrogels biomimétiques tridimensionnels, et les constructions sont cultivées pendant trois à six semaines in vitro. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant la croissance et la maturation des chondrocytes articulaires par des tests biochimiques et mécaniques. Le principal avantage de l'utilisation d'une plateforme tridimensionnelle biométrique à base d'hydrogel pour la culture des chondrocytes est qu'elle fournit un microenvironnement physiologiquement pertinent, car elle intègre les composants natifs du cartilage.Voici l'avantage que présentent les chondrocytes, qui peuvent maintenir leur physiologie et leur phénotype pendant une période plus longue. L'incorporation d'un polymère bioactif, le chondroïtine surface, dans l'hydrogel tridimensionnel permet le remodelage matriciel et le renouvellement matriciel médiés par les chondrocytes. En outre, les propriétés mécaniques et biochimiques de la matrice hydrogel peuvent être facilement modifiées.Cette technique est compatible avec les essais conventionnels permettant d'évaluer le phénotype cellulaire et les résultats fonctionnels. Elle peut être utilisée pour étudier les caractéristiques intrinsèques des chondrocytes associées à un stade ancien de la maladie, ainsi que pour évaluer la maturation cellulaire et le potentiel régénératif dans un contexte physiologique. Pour commencer, préparez le milieu de dissociation en combinant une partie de collagénase deux à 125 unités par millilitre avec une partie de collagénase quatre à 160 unités par millilitre dans le milieu de croissance choy, en utilisant un tissu cartilagineux frais généralement mis au rebut lors d'une arthroplastie totale du genou.Prenez un scalpel stérile et prélève une biopsie sur la surface lisse de l'un des condyles fémoraux. Ensuite, taillez la biopsie en fines tranches. Ajoutez les tranches de cartilage au milieu de dissociation combiné selon un rapport d'un à trois en volume, puis placez la boîte à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit afin de libérer les chondrocytes de la matrice extracellulaire le lendemain.Filtrer le tissu digéré contenant les cellules dissociées à l’aide d’un tamis en nylon de 70 microns de taille de pore. Ensuite, laver les cellules deux fois avec 20 millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 préchauffé et former un culot cellulaire par centrifugation à 600 G pendant cinq minutes. Puis dénombrer les chondrocytes isolés sur une plaque de cytomètre.1 million de cellules sur une boîte de culture de 60 millimètres et recouvrir avec un milieu D-M-E-M-F 12 complémenté. Maintenir les cultures primaires de choy en couche unique à haute densité en suivant les techniques de culture standard. Synthétiser le méthacrylate de chondroïtine sulfate en ajoutant 1,952 gramme de deux morph éth éthane sul acide et 5,84 grammes de chlorure de sodium dans 200 millilitres d’eau déionisée, puis agiter la solution jusqu’à dissolution complète.Ensuite, dissolvez cinq grammes de sel sodique de sulfate de chondroïtine dans la solution tamponnée. Ajoutez alors 0,532 gramme de N-hydroxy-CIN-amide et 1,771 gramme de chlorhydrate d'éthyl-1, diméthyl-3,3-aminopropyl-1-carbodiimide à la solution, puis agitez pendant cinq minutes. Une fois dissous, ajoutez 0,765 gramme de méthacrylate d'aminéthyle à la solution et maintenez la réaction à température ambiante pendant 24 heures, protégée de la lumière par une feuille d'aluminium.Purifiez le mélange final par dialyse contre de l'eau déionisée pendant quatre jours, en utilisant un tube de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 12 à 14 kilodaltons. Ensuite, filtrez la solution purifiée à travers un filtre de 0,22 micron et congélez-la à moins 20 degrés Celsius. Placez les tubes ouverts contenant la solution dans un dessiccateur.Protégez-les de la lumière en les recouvrant de papier d’aluminium et appliquez un vide pendant toute la nuit. Conservez le polymère dissous à moins 20 degrés Celsius dans des tubes Falcon, enveloppés de paraffine et de papier d’aluminium pour les protéger de la lumière et de l’humidité, la veille de l’encapsulation cellulaire. Retirez le milieu des cytes cultivés et recouvrez les cellules avec le milieu de dissociation.Incuber les cellules dans la solution de collagénase toute la nuit à 37 degrés Celsius. Stériliser par autoclavage le film PCR et les barreaux cylindriques, puis stériliser le moule cylindrique sur mesure en le plongeant dans de l'éthanol à 70 % filtré sur 0,2 micron, placé sous une hotte de culture tissulaire sous lumière UV toute la nuit. Le jour suivant, retirer les moules de l'éthanol et les laisser sécher sous la hotte de culture tissulaire. Ensuite, placer le moule dans une plaque stérile de 150 millimètres. Une fois sec, sceller le fond des moules à l’aide du film PCR stérilisé par autoclavage.Éviter toute bulle d'air ou tout espace afin de prévenir les fuites. Ensuite, prendre un tube de 50 millilitres et ajouter 10 % du chondroitine sulfate méthacrylé préparé, 10 % de diacrylate de polyéthylène glycol et 5 % poids par volume. Ajouter un initiateur photochimique dans du DPBS pour atteindre une concentration finale de 3,5 % et 0,05 % respectivement.Protégez le tube de la lumière et vortexez brièvement le mélange. Récupérez les cellules dissociées dans un tube conique de 50 millilitres et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre. Faites centrifuger les cellules à 460 × g pendant cinq minutes et resuspendez-les dans le matériau de gel mixte à une densité de 15 millions de cellules par millilitre.Mélanger la solution 30 fois en prenant soin d'éviter la formation de bulles. Ensuite, pipeter 72 microlitres de la suspension d'hydrogel contenant les cellules ou de l'hydrogel seul dans le moule cylindrique sur mesure. Induire la gélification en exposant les gels à une lumière UV de 365 nanomètres à une intensité de trois milliwatts par mètre carré pendant cinq minutes.Une fois gélifié, utilisez un scalpel pour couper le film et le retirer délicatement. À l’aide des tiges cylindriques, faites sortir le gel dans une plaque de six puits contenant cinq millilitres de DPBS stérile afin d’éliminer tout gel restant non polymérisé et les cellules libres. Ensuite, transférez les hydrogels lavés dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 1,5 millilitre de milieu de croissance Chondra site par puit.Incuber soigneusement les hydrogels à 37 degrés Celsius et changer le milieu tous les deux jours. Évaluer la viabilité cellulaire par coloration vivant-mort 24 heures après l'encapsulation en utilisant des techniques standard de culture, les hydrogels chargés de cellules et les hydrogels vides pendant trois à six semaines avant la récolte et l'analyse. Après le nombre souhaité de jours de culture in vitro, retirer les échantillons de l'incubateur pour effectuer le test de compression sur le support d'hydrogel cellulaire et les hydrogels témoins acellulaires.Placer les échantillons un par un à température ambiante dans un bain de PBS attaché à un système d'essai mécanique équipé d'une cellule de charge de 10 Newton, puis comprimer à une vitesse de 1 % de déformation par seconde jusqu'à une déformation maximale de 15 %. Pour analyser les essais mécaniques, tracer les courbes contrainte-déformation pour chaque échantillon et effectuer un ajustement de courbe. À l'aide d'une équation polynomiale du troisième ordre, déterminer le module tangent en compression à partir de l'équation d'ajustement de courbe pour des valeurs de déformation de 15 % après trois semaines de culture. Dans des hydrogels biomimétiques 3D, l'analyse de l'expression génique des chondrocytes normaux, tant juvéniles qu'adultes, a montré une augmentation de l'expression des gènes des chondrocytes, notamment du collagène II A1 et du collagène VI A1. En revanche, les chondrocytes malades ont montré une diminution marquée du collagène II A1 tout en maintenant l'expression du collagène VI A1, indiquant une perte du phénotype chondrocytaire malgré une culture dans un environnement biomimétique favorable.L'expansion des chondrocytes après trois semaines de culture peut être estimée par la quantification de l'ADN à l'aide du colorant pico green. Une analyse comparative des trois groupes de cellules montre que la densité cellulaire des populations juvéniles et adultes est restée inchangée, tandis que les chondrocytes ostéo-arthritiques présentaient une diminution marquée par rapport au jour un de la culture. La matrice de chondrocytes sécrétée a été quantifiée en mesurant la teneur en glycosaminoglycanes sulfatés après trois semaines de culture.Comme le montre cet exemple, les chondrocytes ont déposé une quantité importante de GAG au cours de trois semaines de culture, ce qui pourrait avoir contribué à l'amélioration des propriétés mécaniques des hydrogels chargés en cellules par rapport aux témoins. Outre son application à des études individuelles, le modèle de culture en hydrogel biomimétique tridimensionnel peut facilement être transposé à un modèle de défaut de cartilage en épaisseur totale afin de caractériser les résultats fonctionnels et biochimiques dans la régénération à long terme du cartilage articulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des chondrocytes humains à partir de prélèvements articulaires du genou et produire des échafaudages tridimensionnels en hydrogel pour la culture prolongée des chondrocytes et la génération de greffons. L'utilisation des hydrogels 3D OME permettra à nos équipes et à d'autres chercheurs de comparer le potentiel congénique de différentes populations de chondrocytes matures, ainsi que celui de nouvelles populations de cellules souches et de cellules progénitrices.À l'avenir, ces techniques pourront être étendues afin d'incorporer des facteurs mimétiques supplémentaires pour formuler un échafaudage optimal pouvant être utilisé pour la régénération et la réparation du cartilage.

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JoVE Journal

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Un système 3D pour les chondrocytes articulaires humains Culture dans le liquide synovial

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Apprenez la culture de chondrocytes articulaires humains dans des hydrogels 3D biomimétiques pour l'ingénierie du cartilage. Cette méthode permet d'étudier la régénération tissulaire et les maladies articulaires.

3D hydrogel échafaudages pour articulaire chondrocytes Culture and Cartilage Generation

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