Name: Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par lintestin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez le transport lipidique intestinal avec des cellules Caco-2 en tant que modèle in vitro. Cette méthode permet d'isoler et d'analyser les lipoprotéines par ultracentrifugation sur gradient de densité.

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Ce travail a été soutenu par le Seed Grant Award du California Northstate University College of Pharmacy (à AMN). Les auteurs tiennent à remercier le California Northstate University College of Pharmacy d’avoir couvert les frais de publication de cet article, et George Talbott pour son aide dans la révision de ce manuscrit.

1. Maintien des cellules Caco-2 <ol><li> Utilisation plats réguliers de culture tissulaire <ol><li> Décongeler les cellules Caco-2 à partir d&#39;un flacon congelé en plaçant le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 °, et tout de suite les ajouter à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de croissance (sérum bovin fœtal préchauffé à 15% (FBS ) dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)). <ol><li> Lorsque les cellules Caco-2 ont atteint 50-70% de confluence, les diviser 1: 6 par incubation des cellules avec 3 ml de 0,05% de trypsine / 0,53 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient détachés (15 min) . Pour éviter l&#39;agglutination des cellules, mélanger les cellules à plusieurs reprises par pipetage doux. Ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé. </li></ol></li><li> Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l&#39;avant et vers l&#39;arrière suivie d&#39;une direction vers la gauche et vers la droite. Évitez les plats tourbillonnantcar il peut conduire à une dispersion de cellules inégales. </li><li> Placez les plats sur une surface plane dans un incubateur à 37 ° de fourni avec 5% de CO 2. Des surfaces inclinées peuvent également résulter en une dispersion de cellules inégales. </li><li> Modifiez les milieux de croissance d&#39;une journée après le début de l&#39;incubation. </li><li> Surveiller les cellules et enregistrer le jour où ils atteignent la confluence. Il faudra environ 1 semaine pour que les cellules atteignent la confluence de la journée, ils sont divisés. </li><li> Changer le milieu de croissance deux fois par semaine avant que les cellules atteignent la confluence. Une fois que les cellules ont atteint la confluence, modifier les milieux de croissance tous les autres jours. Après que les cellules sont 7-jours post-confluentes, changer le milieu de croissance quotidienne. Remarque: Les cellules sont prêtes pour les expériences quand ils sont 13 jours post-confluentes (figure 1). Puisque les cellules finiront par devenir moins efficace dans la production de lipoprotéines, utiliser des cellules qui sont entre 13 à 17 jours post-confluentes 8. Passez à l&#39;étape 3 sur la façon de mener l&#39;expérience.</li></ol></li><li> Utilisation du système de membrane perméable <ol><li> Ensemencer les cellules Caco-2 dans l&#39;insert de membrane perméable tel que décrit à l&#39;étape 1.1.1.1. ci-dessus. Évitez d&#39;utiliser des cellules à partir d&#39;un flacon congelé parce que leur croissance cellulaire est normalement plus lent (période de récupération). En bref, ajouter 0,5 ml des cellules trypsinisées à la chambre apicale (compartiment supérieur) contenant 10 ml de milieu de culture préchauffé. En outre, ajouter 10 ml de milieu de croissance préchauffé à la chambre basolatérale (compartiment inférieur). Remarque: Pour la meilleure pratique, ajouter les milieux de croissance à la chambre apicale d&#39;abord, puis à la chambre basolatérale. Lorsque vous retirez les anciens médias, retirez le support basolatérale devant les médias apical. Évitez piquer la membrane de polycarbonate comme il peut rompre la membrane. </li><li> En raison de la visibilité de la cellule pauvres à travers la membrane de polycarbonate, ensemencer les cellules Caco-2 dans un plat régulière de culture de tissu avec une densité similaire, et utiliser ce plat de juger de la confluence des cellules. </li><li> Suivez steps 1.1.2-1.1.6 ci-dessus. </li></ol></li></ol> 2. La surexpression Gene <ol><li> En utilisant l&#39;approche régulière de transfection <ol><li> Ensemencer les cellules Caco-2 sur une boîte de culture de tissu comme décrit dans 1.1.1.1.-1.1.4 ci-dessus. Remarque: Lorsque les cellules sont environ 40-50% de confluence, ils sont prêts à être transfectées. </li><li> Ajouter 67 ul du réactif de transfection de 472 ul du milieu de sérum réduit dans un tube de microcentrifugation. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube. </li><li> Ajouter 23 pg de pLL3.7 protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) 9 dans le réactif de transfection / réduit mélange des médias de sérum. </li><li> Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Remplacer le milieu de croissance des cellules Caco-2 avec 8 ml de 10% de FBS dans du DMEM. </li><li> Ajouter le mélange / réactif de transfection d&#39;ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l&#39;antenne. </li><li> Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans un avant et backward direction suivie par une direction vers la gauche et vers la droite. </li><li> Placer le plat dans le 37 ° C incubateur. </li><li> Remplacez le support dans le plat avec 10 ml de milieu de croissance par jour après le début de l&#39;incubation. </li><li> Surveiller l&#39;expression des gènes. <ol><li> Surveiller l&#39;expression des gènes sans 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). En utilisant un microscope à fluorescence, déterminer le pour cent de cellules qui sont en vert. Le pourcentage représente l&#39;efficacité de transfection. </li><li> Surveiller l&#39;expression génique avec DAPI. <ol><li> Laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) à trois reprises. </li><li> Fixer les cellules par addition de 10 ml de formaldehyde à 4% dans du PBS (10 minutes d&#39;incubation à la température ambiante). </li><li> Laver les cellules avec du PBS à trois reprises. </li><li> Incuber les cellules dans l&#39;obscurité pendant 15 min à température ambiante avec 8 ml de PBS contenant 1 500: 1, DAPI% de BSA, 0,01% de digitonine. </li><li> Laver les cellules avec du PBS à trois reprises. </li><li> Uchanter un microscope à fluorescence, déterminer le nombre de cellules qui sont vert / bleu par rapport à ceux qui sont bleu (panneau supérieur Figure 2). Le pourcentage calculé représente l&#39;efficacité de transfection. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Utilisation du système de surexpression 10 lentivirus <ol><li> Seed humaines embryonnaires de rein (HEK), les cellules 293T dans une boîte de culture tissulaire de 15 cm (10% de FBS dans du DMEM que leur milieu de croissance). Remarque: Lorsque les cellules sont environ 60-70% de confluence, ils sont prêts à être transfectées. </li><li> Ajouter 162 ul de réactif de transfection à 1133 ul de médias de sérum réduit dans un tube de microcentrifugeuse 11. Eviter le contact du réactif de transfection non-dilué avec la paroi du tube. </li><li> Ajouter 24 pg de pLL3.7 eGFP (ou un autre produit d&#39;assemblage), 15,6 ug de l&#39;élément de réponse Rev (RRE), 6,0 ug de REV, et 8,4 pg du vésiculeuse glycoprotéine du virus de la stomatite (VSVG) dans le réactif de transfection / réduqué mélange des médias de sérum. </li><li> Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Remplacez le support de croissance avec 16 ml de 10% de FBS dans du DMEM. </li><li> Ajouter le mélange / réactif de transfection d&#39;ADN médias / réduite de sérum goutte à goutte à l&#39;antenne. </li><li> Secouer doucement les plats à plusieurs reprises dans une direction vers l&#39;avant et vers l&#39;arrière suivie d&#39;une direction vers la gauche et vers la droite. Il est normal de voir quelques-unes des cellules HEK293T détachés à ce point. </li><li> Placer le plat dans l&#39;incubateur. </li><li> Après 24 heures d&#39;incubation, remplacez les médias dans le plat avec 25 ml de milieu de croissance. </li><li> Le lendemain, recueillir le milieu de croissance contenant le lentivirus (première collecte). </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2.10 de recueillir plus de lentivirus (la deuxième collecte). </li><li> Mutualiser la première et la deuxième collection, et enlever les débris cellulaires par centrifugation (2500 g pendant 5 min). </li><li> Filtrer la collection avec un filtre sur flacon jetable (0,45 um pores), etconcentrer le virus par centrifugation la collection à 31 400 g pendant 2 heures à température ambiante (JA-20 rotor). Marquer le fond du tube de centrifugation où la pastille se trouve. Décanter le surnageant, et de laisser le tube inversé à température ambiante pendant environ 15 min. </li><li> Remettre en suspension le culot contenant le virus avec 100 ul de PBS 1X. Éviter les bulles. </li><li> Stocker le virus concentrée à -80 ° C. Éviter les cycles de gel-dégel. </li><li> Déterminer la quantité optimale de virus nécessaire pour transduire les cellules Caco-2 par titrage. Pour réduire les coûts, utiliser une plaque de 24 puits (0,3 ml de milieu de croissance / puits) à la place d&#39;une boîte de 10 cm de culture de tissus pour le titrage. <ol><li> Ajouter des quantités croissantes du virus concentré (0, 1, 2, 5, 10, 25, et 50 ul / puits) additionné de polybrène (concentration finale = 5 pg / ml) à 40-70% de la confluence des cellules Caco-2. Agiter la plaque de 24 puits doucement comme décrit dans 1.1.2. </li><li> Surveiller l&#39;expression de gène (étape 2.1.10.) (Figure 2 bas4 panneaux). </li></ol></li><li> Étant donné que l&#39;expression de transgène est généralement soutenue, maintenir les cellules transduites pour des expériences futures et surveiller en permanence leur expression des gènes (étape 1.2.10.). </li></ol></li></ol> 3. Stimuler la sécrétion des lipoprotéines <ol><li> Utilisation de la boîte de culture de tissu régulière <ol><li> Préparer un mélange lipidique par mélange 100X 50 mg d&#39;acide oléique, 40 mg de lécithine et 48 mg de taurocholate de sodium. Porter le volume à 900 pl avec du PBS (suffisant pour 8 plats). Vortexer le mélange lipidique vigoureusement. </li><li> Ajouter 900 ul du mélange lipidique 100X dans 89,1 ml de milieu de croissance. Mélanger et filtrer les médias contenant des lipides. Les concentrations finales (1 x) d&#39;acide oléique, la lécithine, et le taurocholate de sodium sont de 2,0 mM, 1,36 mM et 1,0 mM, respectivement. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;un milieu contenant le lipide aux cellules. </li><li> Incuber les cellules avec le support contenant des lipides pendant 4 heures dans un 37° C incubateur. </li><li> Laver les cellules avec du PBS à trois reprises. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de croissance pour les cellules afin de recueillir la sécrétion des lipoprotéines. </li><li> Incuber pendant 2 heures dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Recueillir les médias contenant des lipoprotéines. </li></ol></li><li> Utilisation du système de membrane perméable <ol><li> Suivre les étapes 3.1.1-3.1.2 pour préparer le mélange de lipides. </li><li> Ajouter 10 ml d&#39;un milieu contenant le lipide à la chambre apicale et 10 ml du milieu de culture à la chambre basolatérale. </li><li> Incuber pendant 4 heures dans un incubateur à 37 ° C. Recueillir les médias contenant des lipoprotéines dans la chambre basolatérale. </li></ol></li></ol> 4. Isolement des lipoprotéines (Figure 3) <ol><li> Retirer les débris cellulaires à partir du support contenant des lipoprotéines par centrifugation (2000 xg pendant 5 min). </li><li> Décanter les médias dans un tube de 50 ml. </li><li> Ajouter 5,95 g de chlorure de sodium pour les médias. </li><li> Si le SAmple sera analysée par le TEM, ajouter une protéase tablette de cocktail inhibiteur de maintenir l&#39;intégrité des lipoprotéines. </li><li> Porter le volume à 23 ml avec de l&#39;eau (1,2 g / ml de solution de NaCl densité). </li><li> Dissoudre les solutés complètement. </li><li> Décanter la totalité de la solution dans un tube d&#39;ultracentrifugation polycarbonate. </li><li> Superposer délicatement la solution de densité de 1,2 g / ml avec 0,5 ml d&#39;eau (1,0 g / ml densité). </li><li> Équilibrer le tube en poids et pas en volume. </li><li> Charger doucement les tubes dans le rotor de T865. </li><li> Faites tourner les échantillons dans l&#39;ultracentrifugation à 429 460 g pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Immédiatement isoler le top 0,5 ml de solution par pipetage doux. Garder le tube aussi immobile que possible. </li></ol> 5. Analyse TEM <ol><li> Préparer 5 ml d&#39;acide phosphotungstique 2% (p / v) et ajuster le pH à 6,0. </li><li> Filtrer l&#39;acide phosphotungstique à 2% d&#39;un filtre à seringue (taille des pores: 0,2 um). </li><li> Déposer 20 ul de l&#39;échantillon de lipoprotéine sur un plat stérile. </li><li> Déposer 20 ul de l&#39;acide phosphotungstique à 2% filtrée à côté de l&#39;échantillon sur le même plat. </li><li> Laissez tomber doucement une grille d&#39;EM avec le côté mat reposant sur l&#39;échantillon. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 min. </li><li> Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour retirer l&#39;échantillon de la grille. </li><li> Laissez tomber doucement la grille de EM avec le côté mat reposant sur l&#39;acide phosphotungstique à 2%. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 min. </li><li> Tapoter doucement le côté de la grille EM sur un papier filtre pour éliminer l&#39;acide phosphotungstique de la grille. </li><li> Utilisation d&#39;un TEM, capturer les images des lipoprotéines (figure 4). </li></ol>

<ol><li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li>
<li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li>
<li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li>
<li>Lo, C. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li>
<li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li>
<li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li>
<li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+biosynthetic+interaction+network+component%2C+TMEM24%2C+facilitates+insulin+reserve+pool+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li>
<li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saturated%2C+mono-%2C+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li>
<li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., Ménard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+and+human+fetal+colon%3A+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li>
<li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li>
</ol>

L’auteur n’a rien à divulguer.

Dans ce document, les deux systèmes qui peuvent être utilisés pour maintenir les cellules Caco-2 sont décrits, à savoir, la boîte de culture de tissu normal et la membrane perméable. Les avantages de l&#39;utilisation du système de membrane perméable comprend la séparation de la apical et basolatéral des compartiments, et la capacité à incuber le mélange de lipides et de recueillir la sécrétion des lipoprotéines en même temps. Cependant, les inserts de membrane perméable sont chers, et leur membrane en polycarbonate ne ...

Des études sur l&#39;absorption intestinale des graisses alimentaires, les médicaments et les vitamines et solubles dans les lipides peuvent être conduites in vivo en utilisant un modèle de la fistule lymphatique 1-4. Cependant, les techniques chirurgicales sont impliqués non seulement difficile, mais aussi coûteux. Bien que in vivo approches basées sur l&#39;analyse des fèces peuvent être utilisés, ils sont principalement utilisés pour déterminer l&#39;absorption pour cent par le tractus gastro-intestinal 2,5. Le modèle in vitro décrit dans le présent document est plus rentable, et les techniques impliquées sont sans doute moins difficile. Des études de modification génétique sont également plus économique et moins de temps lorsqu&#39;ils sont effectuées en utilisant ce modèle in vitro. Depuis matières solubles dans les lipides qui sont prises par les entérocytes sont emballés dans les lipoprotéines 6,7, l&#39;efficacité de ce modèle in vitro pour produire des lipoprotéines est crucial. Les deux intestina principalel lipoprotéines sont chylomicrons et les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les chylomicrons, lipoprotéines définies comme ayant 80 nm ou plus de diamètre, sont fabriqués strictement par l&#39;intestin grêle quand lipides sont présents en abondance dans la lumière gastro-intestinale. Comme ils sont les plus grands lipoprotéines, chylomicrons sont vraisemblablement les transporteurs de lipides les plus efficaces. Ce modèle in vitro, qui est capable de produire des chylomicrons 8, peut être utilisé pour étudier l&#39;absorption de graisse alimentaire, la vitamine liposoluble absorption par l&#39;intestin, et la biodisponibilité orale du médicament lipophile. La présence de molécules solubles dans les lipides, des vitamines, des médicaments ou dans la fraction de lipoprotéine est un indicateur de leur absorption par l&#39;intestin grêle. Comme indiqué précédemment, ce modèle peut être utilisé pour améliorer la biodisponibilité des médicaments par voie orale lipophile 6. Ce document décrit comment cellules Caco-2 devraient être maintenus dans la membrane perméable ou plats réguliers de culture de tissus, la façon dont les mi lipidiquesxture pour stimuler la production de lipoprotéines doit être préparé, la façon dont le système d&#39;expression de lentivirus peut être utilisé pour réaliser une surexpression efficace, et la façon dont les lipoprotéines isolées doit être analysé.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Préchauffez le milieu de croissance dans une boîte de culture tissulaire individuelle avant d’ajouter</td></tr><tr><td>des cellules FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>Nous n’inactivons pas à la chaleur notre sérum</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Les cellules peuvent être lavées avec du PBS avant le traitement à la trypsine.</td></tr><tr><td>Système de membrane perméable</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>Boîte de 10 cm, taille des pores de 3 mm, membrane en polycarbonate</td></tr><tr><td>Boîte de 10 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Boîte de culture tissulaire</td></tr> de <tr><td>15 cm</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Boîte de culture tissulaire Plaque de culture tissulaire</td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Plaque de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Réactif de transfection à base de lipides</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Peut être remplacé par un autre réactif de transfection</td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>Pour la transfection</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td></tr><tr><td>Filtre pour bouteille</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>pores de 0,45 mm</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>d’acide oléique</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Prévenir le cycle de gel-dégel</td></tr><tr><td>Lécithine</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Lécithine d’œuf&nbsp ;</td></tr><tr><td>Taurocholate de sodium</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Produit abandonné ; numéro de catalogue alternatif : 50-121-7956</td></tr><tr><td>Comprimé cocktail inhibiteur de protéase (sans EDTA)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Utilisé principalement pour les échantillons nécessitant une analyse TEM</td></tr><tr><td>Tube ultracentrifuge en polycarbonate</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Le réutiliser plusieurs fois fera s’effondrer le tube</td></tr><tr><td>Couvercle pour tube ultracentrifuge</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>Un outil est nécessaire pour retirer le tube/couvercle du rotor</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Filtre à</td></tr><tr><td>seringue</td> jetable <td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Taille des pores = 0,2 mm ; nylon</td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>Pour préparer de l’acide phosphotungstique à 2 %, pH 6,0</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fine et pointes fortes</td></tr><tr><td>Formvar/grille carbone</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/grille carrée en film carbone 400 Cuivre</td></tr></tbody></table>

utilisation de cellules caco-2 à étudier lipid transport par l&#39;intestin

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Les études sur l’absorption des graisses alimentaires sont généralement réalisées à l’aide d’un modèle animal équipé d’une canule lymphatique. Bien que ce modèle animal soit largement accepté comme le modèle in vivo de l’absorption des graisses alimentaires, les techniques chirurgicales impliquées sont difficiles et coûteuses. La manipulation génétique du modèle animal est également coûteuse et prend du temps. Le modèle alternatif in vitro est sans doute plus abordable, permet de gagner du temps et est moins difficile. Il est important de noter que le modèle in vitro permet aux chercheurs d’examiner les entérocytes en tant que système isolé, réduisant ainsi la complexité inhérente au modèle de l’organisme entier. Cet article décrit comment les cellules de carcinome du côlon humain (Caco-2) peuvent servir de modèle in vitro pour étudier le transport des entérocytes des lipides, des médicaments liposolubles et des vitamines. Il explique le bon entretien des cellules Caco-2 et la préparation de leur mélange lipidique ; Et il aborde en outre l’option précieuse d’utiliser le système de membrane perméable. Étant donné que les cellules Caco-2 différenciées sont polarisées, le principal avantage de l’utilisation du système de membrane perméable est qu’il sépare le compartiment apical du compartiment basolatéral. Par conséquent, le mélange lipidique peut être ajouté dans le compartiment apical tandis que les lipoprotéines peuvent être collectées dans le compartiment basolatéral. De plus, l’efficacité du système d’expression du lentivirus dans la régulation positive de l’expression génique dans les cellules Caco-2 est discutée. Enfin, cet article décrit comment confirmer l’isolement réussi des lipoprotéines intestinales par microscopie électronique à transmission (MET).

Figure 1 affiche post-confluentes cellules Caco-2 normales de 13 jours. L&#39;apparition de structures en forme de dôme et des gouttelettes lipidiques intracellulaires sont caractéristiques de Caco-2 différenciées des cellules. Lorsque les cellules Caco-2 ne sont pas dispersés aussi pendant les semis, ils vont agglutiner et proliférer dans certaines zones du plat; et il y aura quelques zones dans le plat sans cellules. Tourbillonnement et en plaçant le plat sur une surface inclinée doit être évitée. Il ...

< classe p = 'jove_content'> cellules Caco-2 peuvent servir de modèle in vitro pour étudier le transport des lipides par les entérocytes et les médicaments/vitamines liposolubles. Le système membranaire perméable sépare le compartiment apical du compartiment basolatéral, tandis que le système d’expression du lentivirus offre une méthode efficace de surexpression génique. L’isolement des lipoprotéines est confirmé par TEM.

Utilisation de cellules Caco-2 à étudier Lipid Transport par l&#39;intestin

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier le transport de molécules liposolubles par l'intestin. Cela est réalisé en plaçant d'abord des cellules Caco-2 différenciées dans un insert à membrane perméable. Ensuite, les cellules Caco-2 sont incubées avec un mélange lipidique et la sécrétion de lipoprotéines est stimulée.Ensuite, les lipoprotéines sont isolées en utilisant une ultracentrifugation sur gradient de densité de chlorure de sodium. Enfin, les lipoprotéines isolées sont contrastées négativement à l'acide phosphotungstique. En définitive, une analyse de la taille des particules est utilisée pour montrer l'abondance relative des chylomicrons par rapport aux lipoprotéines de très basse densité.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le transport des lipides alimentaires par l'intestin, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la détermination de la biodisponibilité de médicaments lipophiles administrés par voie orale. Après avoir mis en œuvre la surexpression génique et le suivi conformément au protocole décrit, maintenir les deux cellules KCO présentant une surexpression du gène. À l’aide de cellules ayant atteint une confluence de 50 à 70 %, diviser les cellules au ratio de 1:6 en ajoutant trois millilitres de trypsine 0,05 %, 0,53 millimolaire de DTA, puis incuber à 37 degrés Celsius jusqu’au détachement des cellules ; pipeter doucement les cellules plusieurs fois pour éviter les agrégats.Ensuite, après avoir transféré 0,5 millilitre des cellules dans la chambre apicale ou supérieure d'une membrane perméable, insérez un contenant avec 10 millilitres de milieu de croissance préchauffé. Ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance tiède dans la chambre basolatérale inférieure. Agitez doucement les boîtes plusieurs fois en mouvement avant-arrière.Évitez de faire tourbillonner les boîtes, car cela pourrait entraîner une dispersion inégale des cellules. Placez les boîtes sur une surface plane dans une étuve à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Un jour plus tard, changez le milieu de croissance et continuez à renouveler le milieu conformément au protocole indiqué dans le texte.Préparez un mélange de lipides à 100 x en ajoutant 900 microlitres de PBS à 50 milligrammes d'acide oléique vortexé. Transférez vigoureusement la totalité du mélange d'acide oléique dans un tube contenant 40 milligrammes de Han et 48 milligrammes de tartrate de sodium. Solubilisez le mélange lipidique par vortexage énergique.Ajouter les 900 microlitres de mélange lipidique à 89,1 millilitres de milieu de croissance et mélanger la solution filtrée pour obtenir les concentrations finales dans le milieu indiquées ici. À l’aide de cellules Caco-2 post-confluentes de 13 jours cultivées sur des inserts à membrane perméable, ajouter 10 millilitres de milieu contenant les lipides dans la chambre apicale et 10 millilitres de milieu de croissance dans la chambre basolatérale.Incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius avant de recueillir le milieu contenant les lipoprotéines dans la chambre basolatérale. Pour isoler les lipoprotéines, éliminer les débris cellulaires du milieu contenant les lipoprotéines par centrifugation à 2000 ×g pendant cinq minutes. Verser le milieu dans un tube de 50 millilitres, puis ajouter 5,95 grammes de chlorure de sodium et, si l'analyse est effectuée par microscopie électronique en transmission ou MET, ajouter un comprimé d'inhibiteur de protéase.Utilisez de l'eau pour ajuster le volume à 23 millilitres et dissoudre complètement les solutés. Ensuite, versez délicatement la solution dans un tube de centrifugation ultracentrifuge en polycarbonate. Utilisez 0,5 millilitre d'eau pour recouvrir doucement la solution de densité de 1,2 gramme par millilitre.Ensuite, équilibrer le tube en poids. Charger les tubes dans un rotor T 8 65 et effectuer une ultracentrifugation à 429 460 × g et à 4 °C pendant 24 heures. Puis, en maintenant le tube aussi immobile que possible, isoler immédiatement les 0,5 millilitres supérieurs de la solution.Pour réaliser l'analyse en microscopie électronique en transmission (TEM), préparez cinq millilitres d'acide phosphotungstique à 2 % et ajustez le pH à 6,0. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre à seringue dont la taille des pores est de 0,2 micromètre. Déposez 20 microlitres de l’échantillon de lipoprotéine sur une boîte stérile.Ensuite, déposez 20 microlitres de l'acide phosphotungstique filtré à côté de l'échantillon sur la même lame, avec le côté mat tourné vers l'échantillon. Déposez délicatement une grille de microscopie électronique sur la goutte de lipoprotéine et incubez à température ambiante pendant une minute. Ensuite, tapez doucement sur le côté de la grille avec du papier filtre pour éliminer l'excès d'échantillon présent sur la grille.Ensuite, déposez délicatement la grille en laissant le même côté reposer sur la goutte d'acide phosphotungstique et incubez pendant une minute avant de tapoter doucement la grille sur du papier filtre pour éliminer l'excès de solution. Enfin, réalisez une microscopie électronique en transmission (MET) afin de capturer des images des lipoprotéines. On observe ici des cellules kco deux normales, 13 jours après confluence, présentant des structures en forme de dôme et des gouttelettes lipidiques intracellulaires caractéristiques des cellules caco deux différenciées.À ce stade, il faut ajouter délicatement du nouveau milieu, car les cellules sont plus sensibles au détachement. À l’aide de la méthode de centrifugation ultracentrifugation en gradient de densité de chlorure de sodium, les lipoprotéines sécrétées par les cellules Caco-2 ont été isolées et analysées par microscopie électronique en transmission (TEM). Certains chylomicrons, qui sont des lipoprotéines de diamètre supérieur à 80 nanomètres, sont représentés ici.Des VLDL plus petites sont également présentes. Un pourcentage élevé de particules de chylomicrons par rapport au nombre total de particules de lipoprotéines indique un transport lipidique efficace après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences pharmaceutiques pour explorer plus en profondeur la biodisponibilité des médicaments lipophiles administrés par voie orale.

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