Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

L’objectif global de cette procédure est d’assembler des cultures en sandwich afin d’étudier le comportement cellulaire dans un environnement 3D plus pertinent sur le plan physiologique. Ceci est accompli en préparant et en recouvrant d’abord les substrats ventral et dorsal avec des protéines telles que la fibronectine. Ensuite, les cellules sont placées de la même manière qu’une culture 2D standard.

Ensuite, le substrat dorsal est recouvert de sorte que les cellules sont stimulées ventralement et dorsalement. Enfin, des expériences telles qu’un test de cicatrisation des plaies peuvent être réalisées. En fin de compte, les cultures sandwich sont analysées par des procédures déjà développées pour les cultures 2D standard, telles que l’imagerie en direct, l’immunofluorescence ou l’extraction cellulaire.

Pour une analyse plus approfondie. Le principal avantage de cette technique culturale par rapport aux systèmes tridimensionnels existants est qu’elle a permis d’étudier différents paramètres dans les interactions entre les matériaux tels que la topographie, la chimie, la rigidité et les teneurs en protéines aux sites ventral et dorsal, offrant un haut degré de polyvalence. En plus des procédures expérimentales qui pourraient être entravées pour certains systèmes tridimensionnels tels que la lipine, l’immunofluorescence et les extractions cellulaires sont facilement effectuées Pour produire un film plat d’acide polylactique ou de PLLA par coulée de solvant travaillant dans une hotte, ajoutez deux grammes de PLLA à 100 millilitres de chloroforme et remuez à température ambiante pendant environ trois heures ou jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.

Placez les rondelles en acier inoxydable sur une boîte de Pétri en verre. Ajoutez ensuite 200 microlitres de la solution PLLA dans les rondelles. Utilisez du papier d’aluminium avec quelques trous pour couvrir le plat et laissez le PLLA s’évaporer lentement à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, chauffez les échantillons à 120 degrés Celsius pendant cinq minutes afin d’évaporer toute trace de solvant. Ensuite, après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante pendant environ 30 minutes, utilisez de l’eau de 18,2 méga ohms pour couvrir les échantillons dans le plat et incubez à température ambiante pendant huit minutes. Après l’incubation, utilisez une lame de rasoir pour décoller les rondelles de la boîte de Pétri.

Ensuite, utilisez une pince à épiler pour éliminer toutes les imperfections du bord des rondelles et laissez sécher les échantillons à l’air. Parce que le PLLA est dégradable par stockage d’hydrolyse, les échantillons sous vide se dessèchent jusqu’au jour des expériences. De plus, les fibres ELLA peuvent être produites selon le protocole textuel et être utilisées comme substrat dorsal sous une hotte de culture stérile.

Ajouter 20 microgrammes par millilitre de FI nin dans des docos PBS ou DPBS avec du calcium et du magnésium aux échantillons et incuber à température ambiante pendant une heure après l’enrobage protéique. Utilisez le DPBS pour laver les échantillons deux fois et stockez-les dans le DPBS avec du P, du calcium et du magnésium jusqu’au moment de les utiliser : les cellules de semence suivantes sur les lamelles de verre et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures pour permettre aux cellules d’adhérer au substrat ventral. Transférez ensuite les échantillons dans de nouveaux puits d’une plaque de 12 puits.

À l’aide d’une pince à épiler, superposez soigneusement le substrat dorsal sur les cellules. Ajoutez ensuite un millilitre de moyen. Le poids de la rondelle empêchera le substrat dorsal de flotter.

Ramenez les échantillons à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, en changeant le milieu deux fois par semaine pour étudier la migration cellulaire à l’intérieur de la culture sandwich. Après avoir recouvert les substrats ventral et dorsal de fibronectine, comme démontré précédemment, les cellules germes sur des lamelles de couverture en verre à haute densité, incubent les échantillons et permettent aux cellules d’atteindre la confluence. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette, grattez la monocouche cellulaire afin de créer deux populations cellulaires séparées par un espace.

Placez le substrat assis ventral dans un nouveau puits adapté à l’acquisition en accéléré et suffisamment grand pour que les substrats dorsaux puissent y rentrer. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, comme démontré précédemment, superposez le substrat dorsal sur les cellules et remplissez de milieu. Placez l’échantillon sous un microscope à accéléré et capturez des images de la fermeture de l’espace toutes les 20 minutes.

Utilisez un logiciel tel que mito BO de l’Image J pour analyser la fermeture de l’espace dans le sandwich. Comme la culture. Le sulfate dépend fortement du moment où les récepteurs dorsaux sont stimulés et des propriétés de l’interaction dorsale.

Semblable à d’autres systèmes 3D tels que les hydrogels, par exemple, comme on le voit ici, les fibres PLLA électro-filées dorsales dirigent l’alignement cellulaire lorsqu’elles sont enrobées de fibronectine, mais pas lorsqu’elles sont recouvertes d’une protéine non adhésive comme la BSA. De plus, des cultures en sandwich avec des cellules PLLA dorsales simples ont déclenché une augmentation du niveau de myogenèse en utilisant des cellules C deux C 12. Cela dépend également des stimuli biologiques dorsaux.

Étant donné que l’interaction avec différentes protéines dorsales entraîne des taux de différenciation distincts, comme le démontre cette vidéo, les fibroblastes migrant à l’intérieur du sandwich comme une culture dans un test de cicatrisation des plaies, adoptent une morphologie allongée et migrent sur des distances plus courtes par rapport aux cellules. Cultivé sur des substrats 2D similaires aux gels de fibronectine et de collagène 3D. La culture en sandwich augmente la réorganisation de l’ECM par les cellules par rapport aux conditions 2D.

Ce processus repose sur les stimuli mécaniques dorsaux et la stabilité du cytosquelette. Étant donné que l’utilisation d’inhibiteurs de contractilité tels que les BLE, les statines ont entravé le processus S D’accord, donc après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la façon d’assembler des cultures de type sandwich. Cette méthode peut concevoir un microenvironnement semblable à celui de la 3D pour la médecine de réaction et le cancer, y compris des applications dans des modèles de maladies, des études de développement et des tests de médicaments.