En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

L’objectif général de cette méthodologie est de montrer comment mesurer les propriétés logiques réelles dans les microdomaines des cellules d’écoulement hétérogènes et des biofilms statiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’ologie dans le domaine du biofilm, telles que la façon dont des composants métriques spécifiques, différentes espèces ou composés affectent la neurologie du biofilm et testent sa réponse à une force physique telle que shere. Il s’agit d’une technique non destructive à haute résolution spatiale, et elle peut être réalisée avec un équipement standard pour les laboratoires biologiques.

Après avoir préparé des cultures bactériennes et des fournitures pendant la nuit et un milieu pour la configuration des cellules d’écoulement, selon le protocole de texte, aliquote des microsphères fluorescentes dans de l’eau stérile dans des micro-tubes de centrifugation pour éliminer l’azoture de sodium, faites tourner les tubes pendant cinq minutes dans un environnement stérile tel qu’une hotte d’écoulement, retirez le supernat et utilisez un millilitre de milieu de croissance pour remettre les microsphères en suspension. Ajoutez ensuite des microsphères au reste du milieu de croissance pour la culture cellulaire en flux. Mettre en place une culture cellulaire en flux selon le protocole textuel pour une configuration de culture statique pour des biofilms cultivés dans des chambres de micro-puits Diluer les cultures de nuit 100 fois dans des tubes de micro-centrifugeuse en ajoutant 10 microlitres de culture de nuit à un millilitre de croissance.

Milieu contenant des microsphères. Ensuite, utilisez les cultures diluées pour remplir les chambres des micropuits et incubez à 37 degrés Celsius dans des conditions statiques. Les troisième et cinquième jours, coupez le débit de la pompe péristaltique et apportez la configuration de la cellule d’écoulement dans la salle de microscopie.

Fixez ensuite le tube près de l’entrée et de la sortie des chambres de la cellule d’écoulement pour éviter la dérive de l’écoulement. Placez la cellule d’écoulement sur la platine d’un microscope vertical et, à l’aide d’un objectif à huile 40x et d’une microscopie à fluorescence, enregistrez le mouvement de la microsphère intégrée dans le biofilm à divers endroits tels que des microcolonies et des couches plates indifférenciées pour des investigations temporelles et spatiales. Pour les événements se produisant dans une courte période, enregistrez des vidéos plus courtes avec une fréquence d’images plus rapide Pour des événements plus longs, capturez des vidéos plus longues avec une fréquence d’images plus lente.

Pour une dynamique plus lente, enregistrez les vidéos dans un format approprié qui peut être lu par Fiji image J, tel que CZI ou Tiff. Vérifiez que la dérive ne se produit pas. En faisant défiler une vidéo terminée et en confirmant que les particules ne se déplacent pas simultanément dans la même direction, mais que le mouvement est aléatoire.

Retirez la cellule d’écoulement de la platine du microscope et redémarrez la pompe péristaltique pour continuer à cultiver le biofilm. Pour obtenir les trajectoires de suivi des particules des vidéos enregistrées, ouvrez Fiji et chargez un fichier Dans le menu des plugins, sélectionnez suivi et trackmate. Vérifiez ou ajustez les paramètres de résolution et de fréquence d’images dans les paramètres d’étalonnage initiaux afin qu’ils correspondent aux paramètres vidéo Pour détecter les particules, sélectionnez Détecteur LOG et entrez le diamètre et la valeur de seuil des particules.

Par exemple, 1000. Vérifiez le bouton de prévisualisation et faites défiler la vidéo pour vérifier que les cercles violets suivent les particules tout au long de la vidéo. Augmentez la valeur de seuil.

Si le cercle violet apparaît dans l’espace vide, réduisez la valeur de seuil. Si vous n’avez pas détecté suffisamment de particules, cliquez sur le bouton suivant pour terminer la détection des particules. Si la détection initiale des particules a été satisfaisante et qu’il n’est pas nécessaire d’ajouter ou de supprimer des particules, cliquez sur le bouton suivant Pour les trois fenêtres suivantes, le seuillage initial, sélectionnez une vue et sélectionnez un filtre sans ajustement.

Ensuite, dans la barre d’options de la fenêtre de sélection d’une méthode de suivi, sélectionnez un suivi LAP simple. Comme les particules se déplacent rarement hors de la mise au point dans le biofilm et sont facilement suivies, utilisez les valeurs de distance maximale de liaison et de fermeture d’espace suggérées ou faibles et cliquez. Prochain. Vérifiez que le suivi des particules est satisfaisant en faisant défiler la vidéo pour voir que les particules suivent les traces dessinées par trackmate et qu’il n’y a pas de traces indésirables ou manquantes.

Différents filtres sont fournis pour exclure les particules en fonction de leurs résultats de suivi individuels. Si ce n’est pas nécessaire, allez dans la fenêtre finale, sélectionnez en action dans le menu déroulant, sélectionnez exporter les pistes vers un fichier XML et cliquez sur exécuter. Choisissez un dossier et enregistrez les pistes dans matlab.

Préparez l’importation des fichiers XML des trajectoires de particules en sélectionnant le chemin d’accès à l’ensemble de fichiers et ajoutez le dossier scripts disponible avec le package Fiji pour effectuer l’analyse de trajectoire de particules. Commencez par télécharger MSD analyzer. Extrayez le dossier at msd analyzer et déposez-le dans un dossier appartenant au chemin d’accès MATLAB.

Démarrez MATLAB et lancez l’analyseur en tapant ce qui suit : micromètres et secondes sont les unités d’espace et de temps physiques dans la vidéo. Ensuite, importez les trajectoires des particules en tapant ce qui suit où le clip Z supprime la dimension Z. Pour une vidéo 2D et une échelle, T met à l’échelle les unités de la dimension temporelle des images en secondes et ajoute les pistes pour tracer les trajectoires des particules.

Entrez ce qui suit, calculez le déplacement quadratique moyen ou MSDS des particules à l’aide des commandes indiquées ici. Pour tracer la fiche signalétique de chaque particule, utilisez la figure et le graphique à points MA msd. Combinez ensuite les trajectoires des particules d’autres vidéos de la même catégorie.

En important les trajectoires à l’aide de la commande importer la trajectoire, puis en traçant et en calculant les fiches signalétiques comme nous venons de le démontrer pour tracer la moyenne d’ensemble ou les courbes globales moyennes. Tapez ce qui suit. Changez ensuite les axes Y et X de l’échelle linéaire à l’échelle logarithmique.

Pour supprimer les régions de la courbe avec des temps de latence longs ou qui augmentent fortement à partir d’une erreur dynamique, utilisez l’outil pinceau pour sélectionner la fin de la courbe. Et dans le menu des outils, sélectionnez le brossage. Supprimez unbred après avoir installé easy FITT et redémarré MATLAB à l’aide du menu simple dans la fenêtre de la figure.

Selon le protocole texte, ajustez les courbes MSD à la loi de puissance en sélectionnant show ajuster la puissance A fois X à la puissance N, où N est l’exposant diffusif alpha estimé. Ensuite, pour calculer de nouvelles fiches signalétiques de particules à d’autres endroits ou à d’autres moments, tapez clear pour éliminer les trajectoires et les fiches signalétiques actuelles des particules. Après avoir calculé diverses courbes MSD pour les particules à divers endroits de différentes souches de biofilm et à différents points temporels, copiez et collez les courbes dans un graphique.

À des fins de comparaison, sélectionnez la courbe et accédez aux outils pour examiner les statistiques de données telles que la plage médiane. La DMS du cordon est proportionnelle à la conformité au fluage JFT du matériau dans lequel le cordon est encastré selon la relation indiquée dans cette formule où J est égal à la conformité au fluage. D est égal au diamètre de la particule, KB est égal à celui du batelier.

Un T majuscule constant est égal à la température et un T minuscule est égal au temps. Dans ces expériences, les propriétés viscoélastiques de différentes régions du biofilm des souches mutantes sauvages P arosa et delta PE A, y compris les vides, les plans et les microcolonies, ont été étudiées. La TMS des particules dans le vide a été utilisée comme contrôle et était comparable à la TMS des particules en milieu pur.

En revanche, les particules piégées dans le biofilm vibraient à des positions fixes et les valeurs MSD variaient de ces matériaux viscoélastiques A typiques à des gels fortement élastiques dans les biofilms formés par les souches de type sauvage et delta Pele le MSD des particules. Dans la journée, trois micro-colonies étaient indépendantes du temps pour le temps, des jambes de 0,1 seconde à 10 secondes indiquant que les micro-colonies étaient élastiques. Les conformités médianes au fluage calculées à partir des fiches signalétiques des particules correspondantes étaient de 4,3 fois 10 puissance moins deux pascals puissance moins un et de 3,6 fois 10 puissance moins deux pascals puissance moins un, respectivement.

Au cinquième jour, la compliance au fluage des microcolonies dans la souche de type sauvage a augmenté à 2,5 fois 10 à la souche négative, les pascals à la négative indiquant une réduction de la réticulation efficace au sein de la matrice Les biofilms formés par la souche mutante delta P-S-L-B-C-D étaient moins différenciés et retardés dans le développement avec des plans épais qui ont développé des micro-colonies après le troisième jour. D’après les valeurs MSD, les biofilms étaient beaucoup moins efficacement réticulés que les souches de Pelé de type sauvage et delta. Des statistiques suffisantes sont prises du micro-domaine lorsque l’analyse d’un plus grand nombre de vidéos n’ajoute pas de nouvelles informations à la courbe MSD.

Il est important d’effectuer la microbiologie en utilisant un large éventail de particules qui diffèrent par leur chimie de surface et leurs tailles. Des expériences supplémentaires peuvent être ajoutées à la procédure d’étude de la santé. Les forces physiques, telles que les impacts du traitement pur ou chimique, la radiologie La microbiologie extrait des informations structurelles difficiles à obtenir par d’autres méthodes à l’échelle micrométrique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre les particules, d’analyser leurs fiches signalétiques et d’obtenir des exposants diffusifs de biofilms. N’oubliez pas que travailler avec des bactéries pathogènes peut être dangereux. Tous les déchets doivent être traités en autoclave et éliminés correctement.