Name: Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez une méthode de culture 3D standardisée pour étudier l'action des hormones mammogènes sur la morphogenèse épithéliale mammaire humaine. Ce modèle physiologique reproduit les conditions in vivo et offre des perspectives pour les thérapies contre le cancer du sein.

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Nous apprécions grandement les contributions éditoriales par Cheryl Schaeberle. Cette recherche a été soutenue par des subventions Avon # 02-2009-093 et ​​02-2011-095 et NIEHS / NIH ES 08314 à AMS. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les positions officielles de l&#39;Institut national des sciences de la santé de l&#39;environnement ou de la National Institutes of Health.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Dissoudre le promégestone synthétique progestatif (R5020) et 17-β-estradiol (E2) dans l&#39;éthanol pour faire 10 -3 M solutions mères. Dissoudre la prolactine dans l&#39;eau déminéralisée distillée pour faire un / ml solution mère à 1 mg. Dissoudre l&#39;anti-oestrogène ICI 182,780 dans le DMSO pour faire un M solution mère à 10 -2. Stocker ces solutions à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> dextran de charbon (CD) dépouillé sérum et moyennes CDFBS: <ol><li> Inactiver à la chaleur de sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain d&#39;eau à 57 ° C pendant 30 min. Remarque: Utilisez uniquement la verrerie lavée à l&#39;acide pour le reste de ce protocole. </li><li> Calculer la quantité de charbon de bois nécessaire. Utilisation de 10% plus de volume que la quantité de sérum pour compenser le déplacement provoqué par le charbon, peser 5% en poids / volume de charbon actif en poudre. </li><li> Laver le charbon deux fois avec de l&#39;eau désionisée froide distillée en utilisant le même volume que la quantité de sérum. Pour chaque lavage centrifuge à 50 x g pendant 2 min pour sédimenter le charbon de bois. Retirer l&#39;eau entre les lavages. Ajouter 0,5% en poids / volume Dextran T-70 à la dernière charbon granulés. Re-suspendre avec distillée, eau déminéralisée et centrifuger à 100 g pendant 5 min. Aspirer l&#39;eau. </li><li> Ajouter le volume approprié de sérum au culot et remettre en suspension le culot de charbon dextran dans le sérum. Incuber, tout en roulant (6 RPM), à 37 ° C pendant 60 min. Centrifuger à 2000 g pendant 20 min. Si surnageant apparaît trouble, répéter centrifugation; Cependant, le sérum peut ne pas être tout à fait clair à ce moment, mais il sera effacé lors de la filtration. </li><li> Filtrer à travers un filtre de 0,80 microns, puis à nouveau à travers un filtre de 0,45 microns pour éliminer plus grand de particules. Enfin, le filtre-stériliser avec un filtre de 0,20 micron. Magasin CDFBS dans des tubes de verre ou T-25 flacons de culture filtré à -20 ºC. </li><li> Charcoal Dextran Stripped fœtal bovin contenant des médias (médias CDFBS): mélanger de 375 ml de phénol DMEM exempt de rouge et 125 ml de DMEM/ F-12. Retirer 37,5 ml et le remplacer par le même volume de sérum de veau fœtal charbon Dextran Stripped. Ajouter 10 6 U / ml de pénicilline et de la L-glutamine à une concentration finale de 2 mM. Le support obtenu est 75% de DMEM, 25% de DMEM / F-12, de 7,5% à charbon dextran dépouillée de FBS, 2 mM de L-glutamine, et 10 6 U / ml de pénicilline. </li></ol></li><li> Préparez 10X PBS, NaOH 1N et de l&#39;eau déminéralisée distillée. Préparer un volume suffisant de chaque selon le volume de la solution de collagène est nécessaire. Stériliser toutes les solutions de filtrage. Stocker le 10x PBS et de l&#39;eau déminéralisée distillée stérile à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 1 mois. Ne pas conserver la solution de NaOH 1N. </li><li> Préparer la solution de collagène à 1 mg / ml de concentration finale selon le protocole de &quot;procédure de gélification suppléant de collagène I, queue de rat&quot; fourni par le fabricant. Chaque gel est constitué de 1,5 ml d&#39;une solution de collagène. Par exemple, préparer 18,5 ml (0,5 ml pour tenir compte des pertes au cours de pipetage) d&#39;une solution de collagène pour préparer12 gels. Utiliser la solution de collagène immédiatement ou tenir sur de la glace jusqu&#39;à 2-3 heures. </li><li> Carmine Alum colorant: <ol><li> Mélanger 1 g Carmine et 2,5 g de sulfate d&#39;aluminium de potassium dans 500 ml d&#39;eau distillée. Faire bouillir tout en agitant pendant 20 min. Regardez attentivement pour éviter de déborder. Ajuster le volume final de retour à 500 ml d&#39;eau distillée supplémentaire. </li><li> Ajouter un cristal de thymol de l&#39;activité antimicrobienne et couvrir la bouteille avec du papier d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. Filtrer à travers un filtre en papier de qualité laboratoire avant chaque utilisation. Réutiliser la solution de carmin pour un maximum de trois mois. Magasin à la température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. </li></ol></li><li> solution de collagénase: dissoudre la collagénase dans du milieu DMEM / F12 à une concentration de 0,125% p / v. Ne rangez pas cette solution. </li></ol> 2. 3D culture de cellules T47D dans Queue Rat collagène de type 1 et Gels Traitement hormonal Remarque: garder pipettes sérologiques stériles et des embouts de pipette à 4 ° C. <ol><li> Prepare une suspension à cellule unique et d&#39;effectuer une numération cellulaire. des cultures de cellules de Split T47D avant qu&#39;ils atteignent 70% de confluence. Centrifuger le volume qui contient la quantité de cellules nécessaires. Considérer que l&#39;un de gel devrait contenir environ 75.000 T47D cellules. </li><li> En utilisant une pipette à froid, remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume approprié de collagène. Considérons que chaque gel est constitué de 1,5 ml de collagène. Mélanger les cellules et le collagène avec précaution pour éviter l&#39;introduction de bulles. </li><li> Pour éviter l&#39;effet de l&#39;électricité statique sur la distribution de cellules, brosser la frontières, haut et en bas de la plaque de 12 puits avec une brosse antistatique réducteur après déballer la plaque. Pour éviter l&#39;accumulation de charge statique lors du contact avec la surface de travail de la hotte, placer cette plaque sur le dessus d&#39;une autre plaque de 12 puits (plaque vierge) qui a également été brossé avec le brush.Gently statique de réduction, versez 1,5 ml du mélange dans chaque puits de la plaque de 12 puits. </li><li> Placer la plaque dans une étuve à 37 ° C pendant 30 min. Retirer ee plaque de l&#39;incubateur et le replacer dans la hotte. </li><li> En utilisant une pointe stérile p200, détacher soigneusement le gel dans un mouvement circulaire de la frontière du puits. Le gel doit également se détacher du fond du puits. </li><li> Diluer hormones dans les médias CDFBS à être ajoutés aux puits. R5020 et utiliser E2 à une concentration finale de 10 -10 M et de la prolactine à une 10 -7 M à une concentration finale. Comme contrôle, utiliser les médias CDFBS sans hormones ajoutées, mais qui contient encore le plus grand volume de DMSO égale aux stocks d&#39;hormones utilisées. Veiller à ce que chaque puits contient 1,5 ml de milieu. Placer les cultures 3D à l&#39;intérieur de 37 ° C, 5% CO 2, 100% Taux d&#39;humidité de la culture tissulaire de l&#39;incubateur. Maintenir les cultures pour 1 ou 2 semaines, en changeant les médias tous les 2 jours. </li></ol> 3. Traitement Gel pour toute Mounts <ol><li> Retirer les milieux de culture et d&#39;ajouter 1,5 ml de PBS à chaque puits. </li><li> Transférer le gel à une diapositive. Couper le gel en deux à l&#39;aide d&#39;une courbelame chirurgicale d. Continuer le traitement avec une moitié et sauver l&#39;autre moitié pour l&#39;analyse histologique. </li><li> Transférer le gel de la moitié de toute la montagne à une diapositive. Laissez gel sec pendant 5 min, puis transférer la diapositive à un bocal de Coplin contenant 10% de formol. Remarque: toutes les incubations doivent être effectués à la température ambiante. </li><li> Fixer des gels dans un bocal de Coplin sur un agitateur O / N. </li><li> Laver les lames deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. Transfert glisse à 70% EtOH; incuber pendant 1 heure sur un agitateur. diapositives de transfert aux Carmine Alum O / N. </li><li> Le lendemain, déshydrater diapositives sur un agitateur à 70% de EtOH, EtOH à 95% et 100% EtOH pendant 1 heure chacune d&#39;elles. Transfert glisse au xylène deux fois pendant 1 heure chacun et continuer à shaker. Utilisez milieu de montage à base de toluène de monter les gels et 1,5 mm Lamelles épaisses. </li><li> Examiner montures entières sous une lumière ordinaire (microscope ou stéréoscope). Pour une analyse plus détaillée de la forme et de la lumière en utilisant la microscopie confocale et de visualiser Carmine colorant avec HeNe 633 nm laser. </li></ol>4. Traitement Gel pour le traitement de l&#39;analyse histologique <ol><li> Transférer la moitié restante du gel dans un flacon en verre de 20 ml contenant 10% de formol et de fixer sur un agitateur O / N. </li><li> Lavez gels deux fois avec PBS pendant 10 min chacun sur shaker. La place des gels dans des cassettes de traitement pour inclusion dans la paraffine. </li><li> gels de transfert à 70% EtOH, incuber pendant 1 h et suivent avec 95% EtOH pendant 1 heure, changent à nouveau de 95% EtOH pendant 1 heure, 100% EtOH pendant 1 heure, et se transforment en frais EtOH à 100% pendant 1 heure. À ce stade, les gels peuvent être stockés dans EtOH à 100% O / N à la température ambiante ou incubées avec du xylène pendant 1 heure, puis à nouveau dans le xylène frais pendant 1 heure. </li><li> cassettes de transfert de paraffine pendant 1 heure à 60 ° C dans un incubateur à vide, répéter avec de la paraffine frais deux fois plus. </li><li> Remplir les moules en plastique avec de la paraffine propre. Ouvrez la cassette, enlever le gel et le placer dans le moule contenant la paraffine plastique. Remplir avec de la paraffine et ajoutez haut de cassette contenant l&#39;étiquette sur le dessus et laisser bloc cool. </li><li> Retirez le plastic moule et la section du bloc en utilisant un microtome. Obtenez 5 um sections d&#39;épaisseur pour coloration HE et immunocytochimie. </li></ol> 5. extraction de cellules à partir de cellules à partir de gels en utilisant un traitement collagénase <ol><li> Retirer le gel du puits et le transférer à une boîte de Pétri contenant du PBS. brièvement de gel rinçage. </li><li> Transférer le gel dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de 0,125% de collagénase. Introduire à la pipette de haut en bas 4-5 fois pour briser le gel en petits morceaux. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 25 min (jusqu&#39;à ce que le gel se soit dissous et les cellules sont en suspension) </li><li> Ajouter 2 ml de sérum supplémenté le milieu de culture. Recueillir les cellules par centrifugation (1000 x g, 5 min), surnageant rejet, remettre en suspension les cellules et à compter. </li></ol>

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<li>Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiestrogenic+effect+of+R5020%2C+a+synthetic+progestin+in+human+breast+cancer+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Endocrinol.Metab%22%5BJournal%5D)">Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture.</a> J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un modèle de culture 3D hormono-sensible pour tester l’action des hormones sur l’épithélium mammaire. La réponse aux hormones peut être évaluée aux niveaux 12 de la morphologie tissulaire, de la prolifération cellulaire et de l’expression des gènes. L’une des limites de cette technique est que la visualisation pendant la période de culture est limitée à la microscopie optique, car les cultures sont cultivées dans une plaque inférieure en plastique. Le système de culture 3D a pu être adapté a...

Contrairement cultures 2D standard, culture cellulaire 3D modèles de substitution permettent l&#39;étude du comportement des cellules épithéliales dans un contexte physiologiquement pertinente, l&#39;un ressemble à un tissu. cultures 3D de la glande mammaire ont permis d&#39;élucider de nombreux aspects du développement de la glande mammaire et la néoplasie. Cependant, la plupart des modèles de culture 3D actuellement ne conviennent pas pour étudier l&#39;action des hormones parce que les lignées de cellules épithéliales humaines utilisées pour la tâche manquent de l&#39;expression du récepteur d&#39;hormone 6,7,9. Nous décrivons ici un modèle de culture 3D de l&#39;épithélium du sein humain qui est approprié pour étudier l&#39;action de l&#39;hormone 12. Ce modèle utilise la ligne disponible dans le commerce hormono-sensible humain epithelial du sein cellulaire T47D 3,11,13, qui ont été à l&#39;origine dérivée d&#39;une effusion pleurale provenant d&#39;une patiente de 54 ans femelle avec un carcinome canalaire infiltrant du sein. Nous utilisons rat de type queue de collagène 1 comme matrice. Ce culte 3Dmodèle de ure est approprié pour l&#39;étude de l&#39;action des trois principales hormones mammotropic (estradiol, promégestone (un analogue de la progestérone), et de prolactine) sur les cellules épithéliales mammaires humaines. Hormone induit morphologie épithéliale peut être évaluée quantitativement au fil du temps par analyse morphométrique 12. Une densité de semis appropriée permet à ces cultures 3D pour être conservés pendant 2 semaines. A cette époque, le développement de structures est suffisant pour une évaluation quantitative robuste de l&#39;action des hormones sur la morphologie épithéliale. Les gels peuvent également être récoltées à des moments antérieurs pour la prolifération cellulaire et les analyses d&#39;expression génique. En outre, ce modèle est adapté à tester les effets d&#39;un traitement hormonal séquentiel; par exemple, après le traitement avec l&#39;oestradiol pendant la première semaine et son remplacement par un autre hormone / combinaison d&#39;hormones au cours de la semaine suivante. L&#39;effet des composés oestrogéniques et anti-œstrogènes, tels que ICI 182,780, peut également être Stumortes en utilisant ce modèle de culture de 12 3D.

<table><tbody><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 12 puits (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques en polystyrène de 15 ml Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td>Sigma</td><td>C-5510</td><td></td></tr><tr><td>Carmin Alum</td><td>Sigma</td><td>C1022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase, Type 3</td><td>Worthington</td><td>S0C11784</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Équipé d’un laser HeNe 633nm</td></tr><tr><td>Dextran T-70</td><td>Abersham/Pharmacia</td><td>17-0280-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, sans rouge de phénol.</td><td>Life Technologies</td><td>11339-021</td><td>Milieux sans rouge de phénol à usage hormonal</td></tr><tr><td>DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine, sans rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>11054-020</td><td>Milieux sans rouge de phénol à usage hormonal</td></tr><tr><td>17-&beta ;-Estradiol</td><td>EMD Millipore</td><td>3301</td><td>Dissous dans de l’éthanol</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Pour une utilisation avec des hormones, doit être dépourvu de charbon de bois.</td></tr><tr><td>Filtres (115 ml)</td><td>Nalgene</td><td>380-0080, 245-0045, 120-0020</td><td>0,88, 0,45, 0,20 micron, respectivement&nbsp ;</td></tr><tr><td>Formol, 10 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF93-20</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780 (fulvestrant)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4409-25MG</td><td>dissous dans</td></tr> un <tr><td>microtome DMSO&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>Supports d’enrobage tissulaire</td><td>McCormick Scientific</td><td>39502004</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Sigma</td><td>7794-10MU</td><td>Dissous dans 10 ml d’eau distillée déminéralisée</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Saline tamponnée pH 7,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Prolactine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4021-50UG</td><td>Dissous dans de l’eau distillée désionisée</td></tr><tr><td>Promegestone</td><td>Perkin Elmer</td><td>NLP004005MG</td><td>Dissous dans</td></tr> de <tr><td>l’éthanol Collagène de queue de rat&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>354236</td><td>Les lots peuvent contenir des concentrations variables, notez en conséquence</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Miltex</td><td>4311</td><td></td></tr><tr><td>Semi-closed Benchtop Tissue Processor</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Prepare 1N NaOH stock</td></tr><tr><td>StaticMaster Brosse antistatique&nbsp ;</td><td>Amstat</td><td>C3500</td><td></td></tr><tr><td>Stripette Pipettes sérologiques&nbsp ;</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Fioles T-25 Corning</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>430168</tr><tr><td>Cassettes de tissus</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-403E</td><td></td></tr><tr><td>Flacons Wheaton, verre, 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Xylène&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>95057-822</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle 3d culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Le processus de morphogenèse épithéliale mammaire est influencé par les hormones. L’étude de l’action hormonale sur l’épithélium mammaire à l’aide de cultures 2D se limite à la prolifération cellulaire et aux paramètres d’expression génique. Cependant, dans l’organisme, la morphogenèse mammaire se produit dans un environnement 3D. Les systèmes de culture 3D aident à combler le fossé entre la culture cellulaire monocouche (2D) et la complexité de l’organisme. Dans cet article, nous décrivons un modèle de culture 3D de l’épithélium du sein humain qui convient à l’étude de l’action hormonale. Il utilise la lignée de cellules épithéliales du sein humain sensible aux hormones, T47D, et le collagène de queue de rat de type 1 comme matrice. Ce modèle de culture 3D répond aux principales hormones mammotropes : l’œstradiol, les progestatifs et la prolactine. L’influence de ces hormones sur la morphogenèse épithéliale peut être observée après 1 ou 2 semaines de traitement selon le critère d’évaluation. Les cultures 3D peuvent être récoltées pour l’analyse de la morphogenèse épithéliale, de la prolifération cellulaire et de l’expression des gènes.

La figure 1 résume la procédure pour la préparation des cultures 3D hormono-sensibles. structures epitheliales sont observés dans les montures de gels entiers cultivés pendant 2 semaines en présence de E2 seul ou en combinaison avec d&#39;autres hormones. Des cellules ou des groupes de 2-3 cellules simples sont présents seulement lorsque aucun hormones sont ajoutées au milieu de culture (milieu CDFBS) (figure 2). Cette condition sert de contrôle négatif. Les...

Nous décrivons un modèle de culture 3D de l’épithélium du sein humain qui convient à l’étude de l’action hormonale.

Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Le but général de cette méthode de culture 3D physiologiquement pertinente est d'évaluer l'action des principaux hormones mammogènes sur la morphogenèse épithéliale mammaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'endocrinologie et de la biologie du gland mammaire, telles que la manière dont les œstrogènes, la progestérone et la prolactine influencent la morphogenèse épithéliale mammaire. Le principal avantage de cette méthode standardisée est que les cellules épithéliales mammaires sensibles aux hormones forment des structures tridimensionnelles en réponse aux hormones, de façon similaire à ce qui est observé in vivo.Les implications de cette technique s'étendent aux thérapies contre le cancer du sein, car il s'agit d'un système de culture physiologiquement pertinent pour l'épithélium mammaire humain complexe. Nous avons eu l'idée de cette méthode en remarquant l'absence de modèles in vitro standardisés pour étudier l'influence des hormones sur la morphogenèse du sein humain. Commencez par dénombrer le nombre de cellules dans une suspension monocellulaire de cellules T47D.La manière dont les cellules sont maintenues est essentielle pour pré

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Une méthode simple est décrite pour analyser les effets de fibroblastes de tissus sur les cellules épithéliales associées. La combinaison de cette méthode et la culture de tissus en trois dimensions peut faciliter l'analyse des cellules après l'isolement de la 3D. La technique est applicable à des cellules plus ou moins de potentiel malin, permettant l'étude systématique des effets de associé à une tumeur du stroma sur les cellules tumorales.

Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

Dans les procédés de culture standards cellules sont retirées de leur environnement physiologique et cultivées sur la surface en plastique d'un plat. Pour étudier le comportement de cellules primaires de moelle osseuse humaine, nous avons créé un système de culture en 3-D, où les cellules sont cultivées dans des conditions récapitulant le microenvironnement du tissu natif.

A Tissue Culture Modèle tridimensionnel pour étudier primaire moelle osseuse humaine et de ses affections malignes

Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l'architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d'autres tissus.

Trois Cultures dimensionnelles: un outil pour étudier l&#39;architecture normale Acinaire vs transformation maligne des cellules mammaires

Nous avons développé un nouveau modèle ex vivo pour étudier l'action des hormones dans le sein humain. Il est basé sur les microstructures de tissu isolé à partir d'échantillons de tissus mammaires chirurgicales qui conservent l'architecture des tissus, des interactions intercellulaires, et la signalisation paracrine.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

Nous décrivons des techniques pour l’induction de différenciation de deux lignes épithéliales de sein, HC11 et EpH4. Tandis que les deux exigent le sérum foetal de veau, l’insuline, et la prolactine pour produire des protéines de lait, les cellules d’EpH4 peuvent entièrement différencier dans les mammospheres dans la culture tridimensionnelle. Ces modèles complémentaires sont utiles pour les études de transduction de signal de différenciation et de néoplasie.

Différenciation des cellules Epithéliales De l’épithélial de souris HC11 et EpH4

La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Le présent protocole décrit la mise en place de cultures 3D « on top » d’une lignée cellulaire épithéliale mammaire non transformée, MCF10A, qui a été modifiée pour étudier la transformation induite par le facteur d’activation plaquettaire (PAF). L’immunofluorescence a été utilisée pour évaluer la transformation et est discutée en détail.

Transformation induite par un médiateur de phospholipides dans des cultures tridimensionnelles

Ce protocole traite d’une approche pour générer des organoïdes épithéliaux à partir de tissu mammaire primaire normal et tumoral par centrifugation différentielle. En outre, des instructions sont incluses pour la culture tridimensionnelle ainsi que l’imagerie immunofluorescente des organoïdes intégrés.

Génération et imagerie d’organoïdes épithéliaux de souris et humains à partir de tissus mammaires normaux et tumoraux sans passage

Ce protocole décrit une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains qui récapitulent des caractéristiques clés de la morphogenèse mammaire dans un système de culture tridimensionnel contrôlé.

Une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains tridimensionnels qui récapitulent la morphogenèse mammaire

Découvrez une méthode de culture 3D standardisée pour étudier l'action des hormones mammogènes sur la morphogenèse épithéliale mammaire humaine. Ce modèle physiologique reproduit les conditions in vivo et offre des perspectives pour les thérapies contre le cancer du sein.

Un modèle 3D Culture hormone-sensibles de la glande mammaire humaine épithélium

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