Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer l'augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

Les objectifs généraux des expériences suivantes sont de déterminer les effets du NTBC sur la production de P mein et la sensibilité au stress oxydatif, ainsi que sur les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques. Cela est réalisé en ajoutant du NTBC à des cultures bactériennes afin de déterminer la concentration qui réduit la production de p mélanine dans un deuxième temps. Des cultures bactériennes sont traitées avec du NTBC et des antibiotiques, ce qui permettra à l'utilisateur de déterminer si le traitement par le NTBC a un effet sur les CMI des antibiotiques.

Les cultures traitées au NTPC sont exposées au peroxyde d'hydrogène afin de déterminer leur sensibilité au stress oxydatif. Les résultats obtenus avec le NTPC montrent que le traitement de bactéries géniques entraîne une réduction de la production de pigments et une augmentation de la sensibilité au stress oxydatif, sans effet sur les CMI aux antibiotiques, selon les tests sur boîtes de culture par pointage et les dosages CMI en microplaques, respectivement. Le principal avantage de la technique de pointage pour le stress oxydatif par rapport aux méthodes existantes, telles que les dénombrements de cellules viables et les tests de diffusion sur disque, est qu'elle permet d'utiliser des concentrations plus faibles de peroxyde d'hydrogène, contrairement aux concentrations élevées nécessaires dans d'autres tests. En général, les personnes novices dans notre méthode de détermination des CMI aux antibiotiques éprouvent des difficultés, car un manque de précision dans la technique de pipetage introduit une variabilité entre les réplicats.

Cette variabilité peut rendre difficile la détermination précise de l'antibiotique. CMI Un jour avant le test de CMI. Préparer des cultures des souches à tester en LB avec et sans.

Deux deux nitro, quatre triéthyle benzoyl un trois cyclohexane dione, ou NTBC. Cette démonstration utilise un niveau représentatif de 300 micromolaire de NTBC. La méthode de titration permettant de déterminer la concentration appropriée de NTBC est décrite dans le texte du protocole : incuber les cultures toute la nuit à 37 degrés Celsius avec aération, le jour suivant.

Préparer des solutions mères de LB contenant du NTBC et de LB contenant du DMSO pour le test de CMI afin d'évaluer un antibiotique sur une souche, avec une concentration de 600 micromolaire de NTBC dans deux millilitres de LB, puis mélanger. Pour préparer la solution mère de NTBC. Le NTBC est ajouté à une concentration de 600 micromolaire car il sera dilué deux fois lorsque l'inoculum sera ajouté.

En ajoutant un volume équivalent de DMSO, véhicule, à deux millilitres de LB, ajustez la concentration finale à 300 micromolaire et mélangez pour préparer la solution mère sans NTBC. Ces deux solutions mères seront utilisées pour préparer les solutions stock d'antibiotiques ainsi que pour établir les séries de dilutions dans des plaques de 96 puits. Ensuite, préparez les solutions d'antibiotique dans les solutions mères de LB supplémenté en NTBC ou de LB supplémenté en DMSO.

Préparez la solution mère de gentamycine plus ou moins NTBC à 64 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de KANAMYCINE plus ou moins NTBC à 256 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de tobramycine plus ou moins NTB à huit microgrammes par millilitre.

Après avoir préparé les deux solutions d'antibiotiques, ajouter 100 microlitres de chaque solution d'antibiotique dans quatre puits d'une plaque 96 puits, sur la rangée A. Par exemple, la gentamicine doit être placée dans les puits A1 à A4, la kanamycine dans les puits A5 à A8, et la tobramycine dans les puits A9 à A12. Ajouter 50 microlitres de la solution mère LB plus NTBC ou LB plus DMSO dans les rangées B à H de la plaque 96 puits, en veillant à ce qu'une plaque contienne du LB plus NTBC et l'autre du LB plus DMSO. À l'aide d'une micropipette, effectuer des dilutions sérielles deux fois consécutives des antibiotiques en transférant 50 microlitres de la solution de la rangée A vers la rangée B. Mélanger la solution, changer les embouts de pipette, puis transférer 50 microlitres de la solution de la rangée B vers la rangée C. Répéter cette opération pour les rangées restantes jusqu'à la rangée G. Après dilution de la rangée G, retirer 50 microlitres de solution de cette rangée et les jeter.

Utilisez la rangée H comme témoin sans antibiotique pour la croissance bactérienne. Récupérez les cultures effectuées pendant la nuit après avoir lavé toutes les cultures afin d'éliminer le lanin présent dans le milieu, mesurez la DO 600 des cultures, puis diluez les cultures de nuit dans du lb à l’aide d’une micropipette multipuits.

Ajouter 50 microlitres de la culture bactérienne diluée dans les puits appropriés. Ajouter des bactéries dans trois puits pour chaque souche et chaque concentration d'antibiotique. Ajouter 50 microlitres de LB dans le quatrième puit afin de servir de témoin de contamination bactérienne.

Couvrez les plaques 96 puits avec du perfil et incubez-les environ 24 heures à 37 degrés Celsius le jour suivant. Examinez visuellement les plaques pour détecter la croissance bactérienne dans les puits. La CMI est la plus faible concentration d'antibiotique dans laquelle aucune croissance bactérienne n'est observée pour les trois réplicats de chaque souche.

Pour commencer cette procédure, préparer des cultures sur une nuit des souches à tester en LB avec et sans NTBC, comme indiqué précédemment, pour le jour suivant. Préparer des boîtes de gélose LB contenant du peroxyde d'hydrogène comme agent de stress oxydatif. Tout d'abord, faire fondre les flacons d'agar LB et refroidir le milieu à environ 50 degrés Celsius à température ambiante.

Ensuite, ajoutez directement du peroxyde d'hydrogène aux milieux refroidis aux concentrations souhaitées. Agitez doucement le flacon pour mélanger une gamme de concentrations de peroxyde d'hydrogène allant de zéro à un millimolaire, ce qui constitue un bon point de départ.

Verse immédiatement les boîtes et passe la surface à la flamme pour éliminer les bulles. Le rendement est de quatre boîtes par 100 millilitres d'agar LB. Marque les boîtes avec la concentration de peroxyde d'hydrogène.

Placer les boîtes découvertes dans une hotte biologique avec le ventilateur en marche pendant 30 minutes afin d'éliminer l'excès d'humidité des boîtes. Les boîtes doivent être utilisées le jour même. Elles sont préparées pendant que les boîtes sèchent, laver et mesurer.

L'OD 600 des cultures de nuit permet de normaliser l'OD 600 de toutes les cultures de nuit à la valeur la plus faible parmi l'ensemble des souches testées. Pour ce faire, déterminez le volume de culture nécessaire pour diluer la culture jusqu'à atteindre la plus faible OD 600 dans un volume total d'un millilitre. Par exemple, si une culture présente une OD 600 de 3 et que la valeur d'OD 600 la plus faible parmi l'ensemble des souches est de 2,5, effectuez le calcul suivant, ce qui donne 0,833 millilitre comme volume de culture nécessaire : placez 0,833 millilitre de culture dans un tube microfuge.

Ensuite, calculez la quantité de LB plus NTBC ou de LB plus DMSO nécessaire pour amener le volume de culture à un millilitre. Dans cet exemple, la quantité serait de 0,167 millilitre. Mélangez par vortexage afin de maintenir les cultures à une concentration constante de NTBC ou de DMSO. Effectuez une dilution sérielle par facteur dix des cultures de nuit normalisées dans du PBS plus NTBC ou du PBS plus DMSO. Préparez des solutions mères de PBS plus NTBC et de PBS plus DMSO, en adaptant le volume selon le nombre de souches testées. Pour un jeu de dilutions destiné à une souche, ajoutez 300 micromolaire de NTBC ou un volume équivalent de DMSO à du PBS, pour un volume total de 720 microlitres. Ajoutez 90 microlitres de PBS plus NTBC ou de PBS plus DMSO dans les tubes microfuges appropriés, étiquetés pour les dilutions sérielles allant de 10 à la puissance moins un à 10 à la puissance moins sept.

Ajouter 10 microlitres de culture au tube de dilution approprié 10 à la puissance moins un, mélanger par vortexage, puis transférer 10 microlitres de la dilution 10⁻¹ dans le tube de dilution 10⁻². Changer les embouts de pipette entre chaque dilution et répéter jusqu'à ce que toutes les dilutions soient effectuées. Déposer 5 microlitres des dilutions 10⁻³ à 10⁻⁷ sur des boîtes de milieu LV contenant du peroxyde d'hydrogène, en double.

Pour chaque souche, utiliser une pointe de pipette distincte. Si les gouttes sont déposées en partant de la dilution la plus élevée à la moins élevée, ne pas incliner ni renverser la boîte tant que le liquide n’a pas complètement pénétré dans le milieu. Incuber les boîtes à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures selon la souche.

Une fois que des colonies de taille suffisante sont apparues, photographiez les boîtes à l’aide d’une caméra CCD placée au-dessus d’un transilluminateur. Des titrations en NTBC ont été utilisées afin de déterminer si le NTBC pouvait réduire la production de mélanine p chez P. aerogenes, et d’identifier la concentration de NTBC qui élimine ou réduit la production de mélanine p pour son utilisation dans des tests supplémentaires, comme illustré ici. Le NTBC a réduit la production de mélanine PY de manière dépendante de la dose chez les producteurs de mélanine p, mais n’a eu aucun effet sur la production de pigment chez les souches qui ne produisent pas de mélanine p.

Ce tableau présente les résultats des tests de CMI pour différentes souches de p aerogen traitées avec et sans NTBC et divers antibiotiques. Les CMI ont été enregistrées comme la plus faible concentration d'antibiotique inhibant la croissance bactérienne. Le traitement par NDBC n'a eu aucun effet sur les CMI des antibiotiques pour les souches testées. Un test de plaque en point pour la réponse au stress oxydatif a été réalisé sur des souches productrices et non productrices de mélanine PIO traitées avec et sans NDBC.

La plaque contenant zéro millimolaire de peroxyde d'hydrogène a montré que toutes les souches avaient été correctement diluées et une sensibilité accrue au stress oxydatif a été observée lorsque les bactéries productrices de mélanine PIO ont été traitées avec des souches NTBC. Les souches qui ne produisent pas de mélanine PIO étaient plus sensibles au stress oxydatif que les souches produisant la mélanine p. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer les effets du traitement par le NTBC sur la production de mélanine PIO en testant la sensibilité au stress oxydatif et aux CMI d'antibiotiques.