Name: Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer laugmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez comment inhiber la production de pyomélanine bactérienne avec le NTBC et évaluer la sensibilité au stress oxydatif. Cette méthode réduit le pigment et augmente la vulnérabilité des bactéries.

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Les auteurs remercient Dara Frank et Carrie Harwood pour leur généreuse contribution de souches. La Milwaukee Research Foundation de l’Université du Wisconsin détient le brevet n° 8 354 451 ; avec des revendications portant essentiellement sur le traitement ou l’inhibition de la progression de l’infection d’un micro-organisme chez un patient par l’administration d’un composé inhibiteur de la 4-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase tel que la 2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Les inventeurs sont Graham Moran et Pang He. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health (R00-GM083147). La bibliothèque de mutants de transposons P. aeruginosa de l’Université de Washington est soutenue par le NIH P30 DK089507.

1. Préparation des milieux de culture, des antibiotiques, et 2- [2-nitro-4- (trifluorométhyl) benzoyl] -1,3-cyclohexanedione (NTBC) <ol><li> Ajouter du bouillon LB (1% de tryptone, 0,5% d&#39;extrait de levure, 0,25% de NaCl dans H 2 O) et aliquote dans des volumes appropriés. Stériliser par autoclave. Magasin à la température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ml de gélose LB (1% de tryptone, 0,5% d&#39;extrait de levure, 0,25% de NaCl, 1,5% de gélose dans H 2 O) dans des flacons de 250 ml. Stériliser par autoclave et conserver à la température ambiante. Assurez-vous que l&#39;agar-agar est fondu avant de verser dans des assiettes. REMARQUE: Les flacons contenant 100 ml de gélose LB donnera 4 assiettes. La quantité de gélose LB peut être modifiée pour correspondre au nombre de plaques nécessaires pour le dosage. </li><li> Assurez-PBS (137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) 16. Stériliser par autoclave ou par filtration et stocker à température ambiante. </li><li> Préparer les solutions d&#39;achat d&#39;actions aux antibiotiques pour la gentamicine, la kanamycine, und tobramycine. <ol><li> Préparer les concentrations de stocks d&#39;antibiotiques appropriés pour P. aeruginosa souches contenant 100 mg / ml de gentamicine, 30 mg / ml de kanamycine et 10 mg / ml de tobramycine. Dissoudre les antibiotiques dans l&#39;eau, stériliser par filtration (0,2 um), et conserver à 4 ° C. Modifier les antibiotiques et les concentrations en fonction de la bactérie étudiée. </li></ol></li><li> Préparer les solutions mères NTBC. Dissolvez 10 mg de NTBC dans 400 pi de DMSO. Cela donne une concentration de 75,9 mM NTBC. Magasin NTBC solutions stock à -20 ° C. Solutions décongeler à la température ambiante, au besoin. Remarque: Les différentes sources de NTBC ont des différences de solubilité. Déterminer le véhicule approprié pour dissoudre le NTBC basée sur les recommandations du fabricant et ajuster l&#39;étape 1.5 en conséquence. </li></ol> 2. NTBC titrages de souches bactériennes <ol><li> Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester. Ajouter 2 ml de LB tube à essai bouillon à 16 x 150 mms (un par souche) et ensemencer avec 1 colonie isolée de chaque souche. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec aération sur un rotateur de culture de tissu dans un incubateur à air. </li><li> Le lendemain, préparer titrages de NTBC dans un bouillon LB. Utilisez une gamme initiale de 0 à 900 uM NTBC depuis différentes souches ont des différences de sensibilité à NTBC. <ol><li> Ajouter 1 ml de bouillon LB à 4 à 5 tubes à essai (16 x 150 mm) par souche. </li><li> Ajouter le bouillon solution NTBC (75,9 mM) pour les tubes à essai (16 x 150 mm) dans une gamme de concentrations. Voir le tableau 1 pour les concentrations NTBC et les volumes d&#39;achat d&#39;actions correspondantes à ajouter à 1 ml de bouillon LB. </li></ol></li><li> Mesurer la DO 600 des cultures de la nuit. Laver les cultures avant de prendre OD 600 lectures pour éliminer pyomelanin présente dans les médias. <ol><li> Laver les cultures par centrifugation 1 ml de la culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 2 min. Retirer le surnageant et des cellules faiblement granulés avecune micropipette et remettre en suspension le culot cellulaire solide dans 1 ml LB. </li></ol></li><li> Ensemencer les tubes de titrage à DO 600 0,05. Calculez le montant de la culture lavé nécessaire pour inoculer les tubes. REMARQUE: Utilisez les cultures lavées pour inoculations depuis pyomelanin ne devraient pas être présents. </li><li> Incuber les tubes de titrage pour environ 24 heures à 37 ° C avec aération à l&#39;aide d&#39;un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air. </li><li> Photographier les tubes de titrage et de comparer la production de pigments à l&#39;intérieur et entre les souches afin de déterminer la quantité de NTBC à utiliser pour MIC et le stress oxydatif dosages. Utilisez OD 600 lectures pour déterminer le montant de pyomelanin dans la cellule libre surnageant de culture et pour déterminer la densité cellulaire. Remarque: Le ratio DO 600 de pyomelanin dans le surnageant de culture de cellules peut être calculée à quantifier les différences de production pyomelanin après le traitement avec NTBC. </li></ol> 3. antibiotiques INHIBI minimumConcentration Tory (MIC) Dosage des plaques à 96 puits <ol><li> Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester dans du LB avec et sans NTBC. NOTE: Ce protocole est décrit en utilisant le niveau représentatif de 300 um NTBC. Le niveau de NTBC approprié pour être utilisé dans l&#39;étape est déterminé 2.6. <ol><li> Ajouter 300 um NTBC à 2 ml LB. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml de LB pour la condition de ne NTBC. </li><li> Utiliser des cure-dents stériles, ensemencer des tubes avec une colonie isolée de bactéries. Il y aura une culture avec NTBC et une culture sans NTBC pour chaque souche. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec aération à l&#39;aide d&#39;un rotateur de culture tissulaire dans un incubateur à air. </li></ol></li><li> Le lendemain, faire LB + NTBC et des solutions de maître LB + DMSO pour la mise en place du test MIC. Ajouter NTBC à une concentration de 600 uM que ce sera diluée deux fois lorsque l&#39;inoculum est ajouté, donnant une concentration finale de 300 um. <ol><li> Pour tester un Antibiotique pour une souche, ajouter 600 um NTBC à 2 ml de LB et mélanger pour rendre la solution maître NTBC. Ajouter un volume équivalent de véhicule (DMSO) à 2 ml de LB et mélanger pour faire le pas de solution de maître NTBC. Utiliser ces solutions pour créer des solutions mères d&#39;antibiotiques, ainsi que pour mettre en place la série de dilutions dans des plaques à 96 puits. NOTE: Les formulations de solutions de maître seront obtenir une solution supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Les solutions de base peuvent être mises à l&#39;échelle supérieure ou inférieure selon les besoins en fonction du nombre des antibiotiques et des souches testées. </li></ol></li><li> Préparer les solutions d&#39;antibiotiques dans les solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO. NOTE: La concentration de l&#39;antibiotique dans ces solutions devrait être le double de la concentration souhaitée finale. Assez solution doit être fait pour transférer 100 pi de quatre puits dans une plaque de 96 puits. <ol><li> Préparer la gentamicine +/- solution stock NTBC à 64 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 0,288 ul d&#39;actions gentamicine (100 mg / ml) à 450ul LB + NTBC ou une solution de maître LB + DMSO. NOTE: La concentration maximale de gentamicine pendant P. aeruginosa est PAO1 32 ug / ml. </li><li> Faire de la kanamycine +/- solution stock NTBC à 256 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 3,84 pi de kanamycine de stock (30 mg / ml) à des solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO 450 pi. NOTE: La concentration maximale de kanamycine pour P. aeruginosa est PAO1 128 ug / ml. </li><li> Préparer tobramycine +/- solution stock NTBC à 8 pg / ml. Pour rendre cette solution, ajouter 0,36 pi de tobramycine de stock (10 mg / ml) à des solutions de maître LB + NTBC ou LB + DMSO 450 pi. NOTE: Pour P. PAO1 aeruginosa, la concentration maximale de tobramycine est de 4 ug / ml. REMARQUE: Les antibiotiques et les concentrations peuvent être ajustés pour les bactéries à tester. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ul de chaque solution antibiotique 2x à quatre puits dans une plaque à 96 puits. Placez ces solutions dans la ligne A. Pour example, la gentamicine doit être placé dans A1 à A4, kanamycine doit être placé dans A5 à A8, et la tobramycine doit être placé dans A9 travers A12. Voir Figure 1A pour un schéma d&#39;une plaque de 96 puits mis en place. NOTE: Plusieurs antibiotiques peuvent être testés dans une plaque, mais une seule souche doivent être testés par plaque pour éliminer le risque de contamination croisée à partir d&#39;autres souches. </li><li> Ajouter 50 pi de la solution de maître LB + NTBC ou LB + DMSO aux rangées B à H de la plaque de 96 puits. Veiller à ce que une plaque est LB + NTBC et une plaque est LB + DMSO. Voir Figure 1A. <ol><li> Utilisez LB + NTBC pour les antibiotiques dans LB + NTBC. Utilisation LB + DMSO pour les antibiotiques dans LB + DMSO. </li></ol></li><li> Aide d&#39;un micro effectuer deux dilutions en série pliage des antibiotiques en transférant 50 pi de la solution de la ligne A à la ligne B. Mélangez la solution, changer les embouts de pipette et transférer 50 pi de la solution de la ligne B à ramer C. Répétez l&#39;opération pour l&#39;remainirangées Ng. Après dilution rangée G, retirez 50 pi de la solution de cette ligne et de défausse. Utilisez la rangée H comme aucun contrôle antibiotique pour la croissance bactérienne. Voir Figure 1B. REMARQUE: Chaque puits dans les rangées A à G contient maintenant 50 pi d&#39;antibiotiques dans LB + NTBC ou LB + DMSO à 2X la concentration souhaitée finale. Rangée H contient NTBC LB + LB + DMSO ou sans antibiotiques. </li><li> Mesurer la DO 600 des cultures de la nuit. Lavez toutes les cultures avant de prendre OD 600 lectures pour éliminer pyomelanin présente dans les médias. <ol><li> Laver les cultures par centrifugation 1 ml de la culture dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 2 min. Retirer le surnageant avec une micropipette et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de LB. </li></ol></li><li> Diluer les cultures d&#39;une nuit à 2.75x10 5 UFC / ml en LB. REMARQUE: On suppose qu&#39;une unité OD 600 est l&#39;équivalent de 1x10 9 UFC / ml de P. aeruginosa. OD UFC / ml conversions peut être DDIFFÉRENTES dans d&#39;autres bactéries. </li><li> Ajouter 50 ul de la culture bactérienne diluée au puits approprié. REMARQUE: Les cultures cultivées dans NTBC doivent être ajoutés dans les puits contenant NTBC et cultures cultivées dans du DMSO doit être ajouté dans les puits contenant le DMSO. Voir Figure 1B. <ol><li> Ajouter bactéries trois puits pour chaque souche et la concentration antibiotique. Ajouter 50 pi de LB pour la quatrième et à agir en tant que témoin de la contamination bactérienne. Voir Figure 1B. </li><li> Utilisez une micropipette multi-canal pour inoculer les puits. Veiller à ce que la pipette conseils sont près du fond des puits lors de l&#39;ajout inoculum pour prévenir la contamination des puits voisins. REMARQUE: Ajout de culture bactérienne dans les puits va diluer les concentrations d&#39;antibiotiques et NTBC double. </li></ol></li><li> Couvrir les plaques à 96 puits avec du parafilm et incuber environ 24 heures à 37 ° C. Incuber les plaques à 96 puits de façon statique, dans un incubateur à air. </li><li> Examinerles plaques pour la croissance bactérienne dans les puits. La CIM est la concentration la plus faible de l&#39;antibiotique à laquelle aucune croissance bactérienne est observée pour les trois répétitions de chaque souche. <ol><li> Examiner la plaque de croissance ou de lire en utilisant un lecteur de plaque d&#39;ensemble DO 600. </li></ol></li></ol> 4. Coin plaque de dosage pour réponse au stress oxydatif <ol><li> Mettre en place des cultures de la nuit des souches à tester dans du LB avec et sans NTBC comme décrit dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Le jour suivant, la préparation des plaques de gélose LB contenant H 2 O 2 comme un facteur de stress oxydatif. Une gamme de H 2 O 2 concentrations de 0 à 1 mm est un bon point de départ. <ol><li> Faire fondre les flacons de gélose LB. Refroidir les médias à environ 50 ° C à la température ambiante. </li><li> Ajouter H 2 O 2 directement aux médias refroidis aux concentrations désirées. Flacons Agiter pour mélanger. Voir le tableau 2 pour les concentrations de H 2 O 2et les volumes de H 2 O 2 concentré à ajouter. Ces valeurs sont basées sur 100 ml de LB agar. </li><li> Verser plaques immédiatement après l&#39;addition de H 2 O 2 et de la flamme de la surface pour éliminer les bulles. Le rendement est de 4 plaques par 100 ml de gélose LB. Marquer les plaques avec la concentration de H 2 O 2. </li><li> Placez les plaques découverts dans une hotte à flux biologique avec le ventilateur en marche pendant 30 min pour éliminer l&#39;excès d&#39;humidité des plaques. REMARQUE: Utilisez les plaques de la même journée, ils sont préparés. Ne pas le faire peut conduire à des données incohérentes. NOTE: les facteurs de stress oxydatif tels que le paraquat peut être remplacé par H 2 O 2 dans cet essai. Les concentrations utilisées pour les facteurs de stress oxydatif d&#39;autres peuvent être différents de ceux utilisés pour H 2 O 2. </li></ol></li><li> Lavez et mesurer l&#39;OD 600 des cultures de la nuit tel que décrit dans l&#39;étape 3.7. </li><li> Normaliser l&#39;OD 600 de toute la nuit cultures à la plus faible valeur pour l&#39;ensemble des souches testées. P. aeruginosa présente généralement une DO600 d&#39;environ 2,5 lorsqu&#39;il est cultivé pendant la nuit dans LB + NTBC ou LB + DMSO. <ol><li> Déterminer le volume de culture nécessaire pour diluer la culture à la densité optique la plus basse 600 dans un volume total de 1 ml. Par exemple, si une culture a une DO 600 de 3 et le plus bas OD 600 pour l&#39;ensemble des souches est de 2,5, effectuer le calcul suivant: (2.5) (1 ml) = (3) (x). x = 0.833 ml. 0.833 ml de culture seront placés dans un tube de micro. </li><li> Calculer la quantité de LB + NTBC (300 uM) ou de LB + DMSO nécessaire pour porter le volume de culture de 1 ml. Pour l&#39;exemple à l&#39;étape 4.4.1, la quantité de LB + NTBC ou LB + DMSO ajouté à la culture serait 0,167 ml (1 ml de volume total - 0,833 ml de culture). Faire des solutions mères de LB + NTBC et LB + DMSO à utiliser pour ces dilutions basé sur le volume nécessaire pour diluer toutes les souches. </li><li> Mélanger la culture et LB + NTBC ou LB + DMSO au vortex. </li></ol></li><li> Afin de maintenir les cultures à une concentration constante de NTBC ou le DMSO, des dilutions en série de dix effectuer pliage des cultures d&#39;une nuit dans du PBS + normalisées NTBC ou PBS + DMSO. <ol><li> Faire des solutions d&#39;achat d&#39;actions de PBS + NTBC et PBS + DMSO. Pour un ensemble de dilutions pour une souche, mélanger 300 um NTBC ou un volume équivalent de DMSO avec du PBS pour obtenir un volume total de 720 ul. Échelle ces stocks haut ou le bas selon le nombre de souches sont testées. </li><li> Étiquette tubes de microcentrifugation à 10 -1 à -7 10 dilutions en série. Ajouter 90 pl de PBS ou du PBS + NTBC + DMSO dans les tubes appropriés. Utilisation du PBS + NTBC pour les souches cultivées dans du milieu LB + NTBC et en utilisant du PBS + DMSO pour les souches cultivées dans du milieu LB + DMSO. </li><li> Ajouter 10 ul de la culture à la 10 -1 tube de dilution appropriée. Mélanger par tourbillonnement et transférer 10 pi de la dilution 10 -1 à 10 -2 tube de dilution. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les dilutions ont été performée. Changer conseils pipette entre dilutions. </li></ol></li><li> Spot 5 pi de la 10 -3 à travers 10 -7 dilutions sur LB + H 2 O 2 plaques en double pour chaque souche. Utilisez une pipette si des points sont étalées de plus dilué à moins diluée (10 -7 à 10 -3). Ne pas basculer ou incliner la plaque jusqu&#39;à ce que le liquide a séché dans la plaque. </li><li> Incuber les plaques pendant 24-48 h à 37 ° C (incubateur à air), en fonction de la souche. REMARQUE: P. aeruginosa PAO1 aura de bonnes colonies de taille sur LB après 24 heures d&#39;incubation. Incuber les souches jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient colonies environ la même taille que PAO1. </li><li> Photographier les plaques à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD-dessus d&#39;une transluminator. Eventuellement, modifier les photos pour le contraste et la culture à la même taille. Comptez le nombre de colonies dans chaque endroit pour déterminer les changements dans la sensibilité au stress oxydatif. </li></ol>

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<li>Khajo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Melanized+Cryptococcus+neoformans+Lethal+Dose+Gamma+Irradiation+Involves+Changes+in+Melanin%27s+Chemical+Structure+and+Paramagnetism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism.</a> PLoS ONE. 6, e25092(2011).</li>
<li>Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from:
	 
 <a target="_blank" href="http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm">http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm</a> (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode de titrage du NTBC décrite dans ce protocole permettra à l’utilisateur de déterminer si le NTBC peut réduire ou éliminer la production de pyomélanine chez les bactéries, et de déterminer la concentration de NTBC requise. L’étape la plus critique de l’essai de titrage NTBC consiste à déterminer la plage de concentrations NTBC à utiliser dans l’essai. Les souches de P. aeruginosa ont des sensibilités différentes au NTBC, et les souches de laboratoire peuvent être plus sensibles au NTBC que les isolats c...

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif qui produit une variété de pigments, dont la pyomélanine, un pigment rouge-brun qui aide à fournir une protection contre le stress oxydatif1-4 et lie une variété de composés, y compris les antibiotiques aminoglycosides5-7. La production de pyomélanine est causée par un défaut de la voie de catabolisme de la tyrosine4,8, soit par des délétions ou des mutations du gène codant pour l’homogentisate 1,2-dioxygénase (HmgA)1,9, soit par des déséquilibres dans les différentes enzymes de la voie10. L’homogentisat s’accumule en raison de l’inactivation de HmgA, et est sécrété et oxydé pour former de la pyomélanine11. La production de pyomélanine peut être abolie ou réduite en fonction de la dose par un traitement avec l’herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)12, qui inhibe la 4-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (Hpd) dans la voie du catabolisme de la tyrosine13. Hpd est nécessaire à la formation de l’homogentisat, et donc de la pyomélanine11. 
Nous décrivons en détail trois techniques qui ont été importantes dans nos études du traitement NTBC des souches de P. aeruginosa productrices de pyomélanine. Ces techniques comprennent le titrage de NTBC pour déterminer les concentrations qui aboliront ou réduiront la production de pyomélanine dans les souches productrices de pyomélanine en laboratoire et cliniques, la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des antibiotiques lorsque les bactéries sont traitées avec le NTBC, et la sensibilité au stress oxydatif qui en résulte avec le traitement NTBC.
Le test de titrage que nous avons développé a deux objectifs. Tout d’abord, le test permettra à l’utilisateur de déterminer si le NTBC peut abolir ou réduire la production de pyomélanine dans la bactérie étudiée et à quelles concentrations. Cela permettra à l’utilisateur de déterminer la sensibilité au NTBC, car différentes souches de bactéries peuvent avoir des sensibilités différentes à ce composé, comme observé chez P. aeruginosa12. Deuxièmement, le test de titrage NTBC permettra à l’utilisateur de déterminer la concentration appropriée de NTBC à utiliser dans les tests ultérieurs, tels que les tests de réponse au stress oxydatif, si l’objectif est d’abolir ou de réduire la production de pyomélanine et de déterminer les effets de la réduction des pigments. 
Le dosage fonctionne parce qu’une différence visible dans la production de pyomélanine peut être observée dans les souches traitées avec NTBC et que les différences dans la production de pyomélanine sont dose-dépendantes12. De plus, cette technique peut être appliquée à l’étude d’autres composés susceptibles d’éliminer ou d’améliorer la production de pigments chez les bactéries.
Les CMI antibiotiques sont utilisés pour déterminer la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer les CMI, notamment les plaques de dilution de gélose et les dilutions de bouillon14. Les dilutions du bouillon peuvent être effectuées dans de petits tubes à essai ou dans une plaque de microtitration de 96 puits. La méthode de détermination de la CMI sur plaque de microtitration décrite dans le présent document permettra à l’utilisateur de tester une large gamme d’antibiotiques en utilisant un minimum de ressources. Le test offre une reproductibilité ainsi qu’une flexibilité dans le nombre d’antibiotiques et de souches testés par cette méthode. De plus, grâce à l’incorporation de NTBC dans le test, l’utilisateur peut déterminer si l’élimination ou la réduction de la production de pyomélanine modifie la sensibilité aux antibiotiques chez les bactéries qui produisent de la pyomélanine.
La réponse bactérienne au stress oxydatif peut être testée de plusieurs manières. Les méthodes les plus courantes décrites sont soit le comptage viable des bactéries soumises à un stress oxydatif pendant une période de temps1, soit les tests de diffusion sur disque de stress oxydatif15. Ces méthodes ont tendance à utiliser de fortes concentrations de facteurs de stress oxydatif pour examiner les effets du stress oxydatif chez les bactéries et les résultats peuvent être très variables entre les réplicats biologiques. Le dosage du comptage viable a également tendance à utiliser plus de plaques de gélose que les autres méthodes. Le dosage sur plaque ponctuelle que nous décrivons utilise de faibles concentrations deH2O2 et permet à l’utilisateur de tester la réponse au stress oxydatif de plusieurs souches à l’aide d’un minimum de plaques. Le test est également reproductible de manière cohérente entre les réplicats techniques et biologiques. Comme la pyomélanine est impliquée dans la résistance au stress oxydatif, l’incorporation de NTBC dans le test permet à l’utilisateur de déterminer les effets de l’élimination de la production de pyomélanine sur la résistance au stress oxydatif.

<table><tbody><tr><td>2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0269-50mg</td><td>Aussi appelé nitisinone.&nbsp ; Soluble dans le DMSO.</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 % en poids en H2O.&nbsp ; Stabilisé.</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gold Bio</td><td>G-400-100</td><td>soluble dans H2O.&nbsp ; Filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>soluble dans H2O.&nbsp ; Filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>soluble dans H2O.&nbsp ; Filtrer la stérilisation.</td></tr></tbody></table>

méthodes pour inhiber bactérienne pyomelanin production et de déterminer l&#39;augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

<classe p='jove_content'>La pyomélanine est un pigment extracellulaire rouge-brun produit par plusieurs espèces bactériennes et fongiques. Ce pigment est dérivé de la voie du catabolisme de la tyrosine et contribue à augmenter la résistance au stress oxydatif. La production de pyomélanine chez Pseudomonas aeruginosa est réduite de manière dose-dépendante par un traitement au 2-[2-nitro-4-(trifluorométhyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Nous décrivons une méthode de titrage utilisant plusieurs concentrations de NTBC pour déterminer la concentration de médicament qui réduira ou abolira la production de pyomélanine dans les bactéries. La méthode de titrage a un résultat facilement quantifiable, une réduction visible de la production de pigments avec l’augmentation des concentrations de médicaments. Nous décrivons également une méthode de plaque de microtitration pour doser la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’antibiotique chez les bactéries. Cette méthode utilise un minimum de ressources et peut facilement être mise à l’échelle pour tester plusieurs antibiotiques dans une seule plaque de microtitration pour une souche de bactérie. Le test MIC peut être adapté pour tester les effets des composés non antibiotiques sur la croissance bactérienne à des concentrations spécifiques. Enfin, nous décrivons une méthode pour tester la sensibilité bactérienne au stress oxydatif en incorporant du H2O2 dans des plaques de gélose et en repérant plusieurs dilutions de bactéries sur les plaques. La sensibilité au stress oxydatif est indiquée par des réductions du nombre et de la taille des colonies pour les différentes dilutions sur des plaques contenant du H2O2 par rapport à un témoin sans H2O2. Le dosage sur plaque ponctuelle de stress oxydatif utilise un minimum de ressources et de faibles concentrations deH2O2. Il est important de noter qu’il a également une bonne reproductibilité. Ce test sur plaque ponctuelle pourrait être adapté pour tester la sensibilité bactérienne à divers composés en incorporant les composés dans des plaques de gélose et en caractérisant la croissance bactérienne qui en résulte.

Titrages NTBC Les titrages NTBC ont été utilisés pour déterminer si NTBC était en mesure de réduire la production de pyomelanin dans P. aeruginosa, et également d&#39;identifier la concentration de NTBC qui élimine ou réduit pyomelanin production pour utilisation dans des essais supplémentaires. Il peut y avoir des variations dans les niveaux de pyomelanin produite dans différentes répétitions, mais les tendances générales restent constants. L&#39;essai de titrage NTBC pour...

<classe p = 'jove_content'> La production bactérienne de pyomélanine entraîne une résistance accrue au stress oxydatif et à la virulence. Nous rapportons les techniques qui peuvent être utilisées pour déterminer l’inhibition de la production de pyomélanine et doser l’augmentation de la sensibilité au stress oxydatif qui en résulte chez les bactéries, ainsi que pour déterminer la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques (CMI).

Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer l&#39;augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Les objectifs généraux des expériences suivantes sont de déterminer les effets du NTBC sur la production de P mein et la sensibilité au stress oxydatif, ainsi que sur les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antibiotiques. Cela est réalisé en ajoutant du NTBC à des cultures bactériennes afin de déterminer la concentration qui réduit la production de p mélanine dans un deuxième temps. Des cultures bactériennes sont traitées avec du NTBC et des antibiotiques, ce qui permettra à l'utilisateur de déterminer si le traitement par le NTBC a un effet sur les CMI des antibiotiques.Les cultures traitées au NTPC sont exposées au peroxyde d'hydrogène afin de déterminer leur sensibilité au stress oxydatif. Les résultats obtenus avec le NTPC montrent que le traitement de bactéries géniques entraîne une réduction de la production de pigments et une augmentation de la sensibilité au stress oxydatif, sans effet sur les CMI aux antibiotiques, selon les tests sur boîtes de culture par pointage et les dosages CMI en microplaques, respectivement. Le principal avantage de la technique de pointage pour le stress oxydatif par rapport aux méthodes existantes, telles que les dénombrements de cellules viables et les tests de diffusion sur disque, est qu'elle permet d'utiliser des concentrations plus faibles de peroxyde d'hydrogène, contrairement aux concentrations élevées nécessaires dans d'autres tests. En général, les personnes novices dans notre méthode de détermination des CMI aux antibiotiques éprouvent des difficultés, car un manque de précision dans la technique de pipetage introduit une variabilité entre les réplicats.Cette variabilité peut rendre difficile la détermination précise de l'antibiotique. CMI Un jour avant le test de CMI. Préparer des cultures des souches à tester en LB avec et sans.Deux deux nitro, quatre triéthyle benzoyl un trois cyclohexane dione, ou NTBC. Cette démonstration utilise un niveau représentatif de 300 micromolaire de NTBC. La méthode de titration permettant de déterminer la concentration appropriée de NTBC est décrite dans le texte du protocole : incuber les cultures toute la nuit à 37 degrés Celsius avec aération, le jour suivant.Préparer des solutions mères de LB contenant du NTBC et de LB contenant du DMSO pour le test de CMI afin d'évaluer un antibiotique sur une souche, avec une concentration de 600 micromolaire de NTBC dans deux millilitres de LB, puis mélanger. Pour préparer la solution mère de NTBC. Le NTBC est ajouté à une concentration de 600 micromolaire car il sera dilué deux fois lorsque l'inoculum sera ajouté.En ajoutant un volume équivalent de DMSO, véhicule, à deux millilitres de LB, ajustez la concentration finale à 300 micromolaire et mélangez pour préparer la solution mère sans NTBC. Ces deux solutions mères seront utilisées pour préparer les solutions stock d'antibiotiques ainsi que pour établir les séries de dilutions dans des plaques de 96 puits. Ensuite, préparez les solutions d'antibiotique dans les solutions mères de LB supplémenté en NTBC ou de LB supplémenté en DMSO.Préparez la solution mère de gentamycine plus ou moins NTBC à 64 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de KANAMYCINE plus ou moins NTBC à 256 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de tobramycine plus ou moins NTB à huit microgrammes par millilitre.Après avoir préparé les deux solutions d'antibiotiques, ajouter 100 microlitres de chaque solution d'antibiotique dans quatre puits d'une plaque 96 puits, sur la rangée A. Par exemple, la gentamicine doit être placée dans les puits A1 à A4, la kanamycine dans les puits A5 à A8, et la tobramycine dans les puits A9 à A12. Ajouter 50 microlitres de la solution mère LB plus NTBC ou LB plus DMSO dans les rangées B à H de la plaque 96 puits, en veillant à ce qu'une plaque contienne du LB plus NTBC et l'autre du LB plus DMSO. À l'aide d'une micropipette, effectuer des dilutions sérielles deux fois consécutives des antibiotiques en transférant 50 microlitres de la solution de la rangée A vers la rangée B. Mélanger la solution, changer les embouts de pipette, puis transférer 50 microlitres de la solution de la rangée B vers la rangée C. Répéter cette opération pour les rangées restantes jusqu'à la rangée G. Après dilution de la rangée G, retirer 50 microlitres de solution de cette rangée et les jeter.Utilisez la rangée H comme témoin sans antibiotique pour la croissance bactérienne. Récupérez les cultures effectuées pendant la nuit après avoir lavé toutes les cultures afin d'éliminer le lanin présent dans le milieu, mesurez la DO 600 des cultures, puis diluez les cultures de nuit dans du lb à l’aide d’une micropipette multipuits.Ajouter 50 microlitres de la culture bactérienne diluée dans les puits appropriés. Ajouter des bactéries dans trois puits pour chaque souche et chaque concentration d'antibiotique. Ajouter 50 microlitres de LB dans le quatrième puit afin de servir de témoin de contamination bactérienne.Couvrez les plaques 96 puits avec du perfil et incubez-les environ 24 heures à 37 degrés Celsius le jour suivant. Examinez visuellement les plaques pour détecter la croissance bactérienne dans les puits. La CMI est la plus faible concentration d'antibiotique dans laquelle aucune croissance bactérienne n'est observée pour les trois réplicats de chaque souche.Pour commencer cette procédure, préparer des cultures sur une nuit des souches à tester en LB avec et sans NTBC, comme indiqué précédemment, pour le jour suivant. Préparer des boîtes de gélose LB contenant du peroxyde d'hydrogène comme agent de stress oxydatif. Tout d'abord, faire fondre les flacons d'agar LB et refroidir le milieu à environ 50 degrés Celsius à température ambiante.Ensuite, ajoutez directement du peroxyde d'hydrogène aux milieux refroidis aux concentrations souhaitées. Agitez doucement le flacon pour mélanger une gamme de concentrations de peroxyde d'hydrogène allant de zéro à un millimolaire, ce qui constitue un bon point de départ.Verse immédiatement les boîtes et passe la surface à la flamme pour éliminer les bulles. Le rendement est de quatre boîtes par 100 millilitres d'agar LB. Marque les boîtes avec la concentration de peroxyde d'hydrogène.Placer les boîtes découvertes dans une hotte biologique avec le ventilateur en marche pendant 30 minutes afin d'éliminer l'excès d'humidité des boîtes. Les boîtes doivent être utilisées le jour même. Elles sont préparées pendant que les boîtes sèchent, laver et mesurer.L'OD 600 des cultures de nuit permet de normaliser l'OD 600 de toutes les cultures de nuit à la valeur la plus faible parmi l'ensemble des souches testées. Pour ce faire, déterminez le volume de culture nécessaire pour diluer la culture jusqu'à atteindre la plus faible OD 600 dans un volume total d'un millilitre. Par exemple, si une culture présente une OD 600 de 3 et que la valeur d'OD 600 la plus faible parmi l'ensemble des souches est de 2,5, effectuez le calcul suivant, ce qui donne 0,833 millilitre comme volume de culture nécessaire : placez 0,833 millilitre de culture dans un tube microfuge.Ensuite, calculez la quantité de LB plus NTBC ou de LB plus DMSO nécessaire pour amener le volume de culture à un millilitre. Dans cet exemple, la quantité serait de 0,167 millilitre. Mélangez par vortexage afin de maintenir les cultures à une concentration constante de NTBC ou de DMSO. Effectuez une dilution sérielle par facteur dix des cultures de nuit normalisées dans du PBS plus NTBC ou du PBS plus DMSO. Préparez des solutions mères de PBS plus NTBC et de PBS plus DMSO, en adaptant le volume selon le nombre de souches testées. Pour un jeu de dilutions destiné à une souche, ajoutez 300 micromolaire de NTBC ou un volume équivalent de DMSO à du PBS, pour un volume total de 720 microlitres. Ajoutez 90 microlitres de PBS plus NTBC ou de PBS plus DMSO dans les tubes microfuges appropriés, étiquetés pour les dilutions sérielles allant de 10 à la puissance moins un à 10 à la puissance moins sept.Ajouter 10 microlitres de culture au tube de dilution approprié 10 à la puissance moins un, mélanger par vortexage, puis transférer 10 microlitres de la dilution 10⁻¹ dans le tube de dilution 10⁻². Changer les embouts de pipette entre chaque dilution et répéter jusqu'à ce que toutes les dilutions soient effectuées. Déposer 5 microlitres des dilutions 10⁻³ à 10⁻⁷ sur des boîtes de milieu LV contenant du peroxyde d'hydrogène, en double. Pour chaque souche, utiliser une pointe de pipette distincte. Si les gouttes sont déposées en partant de la dilution la plus élevée à la moins élevée, ne pas incliner ni renverser la boîte tant que le liquide n’a pas complètement pénétré dans le milieu. Incuber les boîtes à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures selon la souche.Une fois que des colonies de taille suffisante sont apparues, photographiez les boîtes à l’aide d’une caméra CCD placée au-dessus d’un transilluminateur. Des titrations en NTBC ont été utilisées afin de déterminer si le NTBC pouvait réduire la production de mélanine p chez P. aerogenes, et d’identifier la concentration de NTBC qui élimine ou réduit la production de mélanine p pour son utilisation dans des tests supplémentaires, comme illustré ici. Le NTBC a réduit la production de mélanine PY de manière dépendante de la dose chez les producteurs de mélanine p, mais n’a eu aucun effet sur la production de pigment chez les souches qui ne produisent pas de mélanine p.Ce tableau présente les résultats des tests de CMI pour différentes souches de p aerogen traitées avec et sans NTBC et divers antibiotiques. Les CMI ont été enregistrées comme la plus faible concentration d'antibiotique inhibant la croissance bactérienne. Le traitement par NDBC n'a eu aucun effet sur les CMI des antibiotiques pour les souches testées. Un test de plaque en point pour la réponse au stress oxydatif a été réalisé sur des souches productrices et non productrices de mélanine PIO traitées avec et sans NDBC.La plaque contenant zéro millimolaire de peroxyde d'hydrogène a montré que toutes les souches avaient été correctement diluées et une sensibilité accrue au stress oxydatif a été observée lorsque les bactéries productrices de mélanine PIO ont été traitées avec des souches NTBC. Les souches qui ne produisent pas de mélanine PIO étaient plus sensibles au stress oxydatif que les souches produisant la mélanine p. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer les effets du traitement par le NTBC sur la production de mélanine PIO en testant la sensibilité au stress oxydatif et aux CMI d'antibiotiques.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Quantification de l’inactivation bactérienne induite par la lumière par génération d’espèces réactives de l’oxygène

Cette vidéo présente un test sur plaque ponctuelle conçu pour évaluer les réponses au stress oxydatif des souches bactériennes. Certaines souches produisent de la pyomélanine, un pigment antioxydant. À l’inverse, les souches traitées avec un agent d’essai, entraînant une réduction de la production de pyomélanine, présentent une sensibilité accrue au stress oxydatif, ce qui entraîne une diminution de la viabilité cellulaire par rapport aux souches productrices de pyomélanine.

Dosage sur plaque ponctuelle pour l’évaluation des réponses au stress oxydatif dans des souches bactériennes

Cette vidéo présente une méthode basée sur une plaque de microtitration pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) des antibiotiques testés contre les bactéries. Lors de l’ajout d’une suspension de l’agent pathogène bactérien Pseudomonas aeruginosa à une plaque de microtitration contenant des dilutions en série d’un antibiotique testé et un inhibiteur de la production de pyomélanine par la bactérie, la densité optique des puits est mesurée pour calculer la concentration...

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Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer laugmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes pour inhiber bactérienne Pyomelanin production et de déterminer l'augmentation correspondante de la sensibilité au stress oxydatif

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