Name: Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Découvrez la microdissection de cryptes coliques et de cellules épithéliales de surface chez la souris par cryosection. Cette méthode rapide et économique permet d'analyser l'expression génique et protéique par PCR en temps réel et Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Soutenu par les National Institutes of Health (DK55679, et DK59888 à A.N.). Subvention du centre de cancérologie complet du Winship Cancer Institute de l’Université Emory, P30CA138292 et la bourse de développement de carrière de la Fondation américaine de la Crohn et de la Colite à C.T.C. et la bourse de recherche à A.E.F.

Des expériences utilisés souris C57BL / 6 entre 10 et 12 semaines d&#39;âge. Toutes les procédures utilisant des animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soin et l&#39;utilisation Emory University animaux dans les institutions et ont été effectués selon les National Institutes of Health critères. 1. Configuration expérimentale <ol><li> Configuration du cryostat <ol><li> Equilibrer cryostat à -20 ° C, y compris la lame de microtome et mandrins (extrême prudence autour de la lame!). </li><li> Remplissez un cryomoule vide avec OCT (Optimal composé coupe de la température) et équilibrer à -20 ° C (~ 30 minutes). Retirer les PTOM congelé du moule et le fixer sur le mandrin avec OCT liquide. Placez le bloc / mandrin dans le bras microtome et permettre l&#39;OPO à définir pour 10 min. </li><li> Régler le cryostat à 10 um par section et de se raser le bloc octobre jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit plat. Sauvegardez le bras microtome loin de la lame de plusieurs centimètres. À ce stade, ne réglez pas la lame ou le mandrin pour le reste de l&#39;expermode de. </li></ol></li><li> Préparer les lames de rasoir: Préparer deux lames de rasoir par échantillon. Utilisation d&#39;un fichier de métal, terne le bord aiguisé de lames. Ensuite, retirez la bride en aluminium avec une pince. </li><li> Pré-refroidir un plat en pyrex ou toute autre surface plane sur glace sèche. </li><li> Préparer un plat de dissection avec 10-15 repères de la dissection. A 10 cm de boîte de culture tissulaire de 50% rempli de silicium est suffisante. Ajouter 5 ml de tampon de Hanks à la température ambiante. </li></ol> 2. Dissection du côlon distal Tissue <ol><li> La place des souris dans une chambre étanche et souris euthanasier par inhalation isoflurane et dislocation cervicale, puis pulvériser éthanol à 70% sur l&#39;abdomen et le thorax 12. </li><li> Faire une petite incision dans la peau de l&#39;abdomen avec des ciseaux et ensuite faire une incision pour exposer la cavité péritonéale. Des procédures similaires peuvent être trouvés ici décrit 12. </li><li> Couper le gros intestin à la marge de l&#39;anus et de démêler le mésentère jusqu&#39;à ce que le colon est libre. </li><li> Exciser un côlon distalsegment compris entre 0 et 6 cm de l&#39;anus. Ici, la profondeur de la crypte est ~ 150 um (voir la figure 1B). Couper ouvrir le côlon longitudinalement l&#39;aide de ciseaux et retirer le contenu fécaux. </li><li> Pin le tissu à plat de la dissection avec la surface de la muqueuse vers le haut. Étirer les tissus en utilisant des broches de dissection sur un plat de silicium dans un tampon Hanks et laisser reposer pendant 10 min à température ambiante (figure 1C). Cela supprime les plis du tissu et permet aux couches musculaires de se détendre. </li></ol> 3. Montez tissus sur le cryostat pour la coupe <ol><li> Faites glisser une lame de rasoir dans la section souhaitée de tissu, puis verser le tampon de Hanks. Ajouter une autre lame de rasoir pour le haut, faire un sandwich. Couper le segment de tissu et de retirer les broches. Transférez le sandwich lame de rasoir / tissu à la glace sèche. Laisser le tissu de geler (5-10 min, figure 1D). </li><li> Ramassez le rasoir / sandwich tissu et lui permettre de se réchauffer légèrement en plaçant un doigt sur le bl hautade (côté muqueuse vers le haut. Ceci oriente le tissu de sorte que les couches basales musculaires sont sectionnés premier.). Séparer le sandwich et couper sur les bords du segment de tissu. Couper un segment de tissu d&#39;environ, 0,5 cm x 1 cm. zones de bord ont tendance à se gondoler, ce qui provoque des coupes en série pour contenir de nombreuses couches de tissu. Notez que plus la coupe est meilleure que sous-coupe, de sorte pécher par excès de prudence. </li><li> Laisser le tissu à chauffer jusqu&#39;à ce que la glace sur le dessus du tissu commence à fondre. A ce point rapidement et presser délicatement le tissu dans le bloc PTOM du cryostat. </li><li> Retirez la lame en plaçant un doigt sur l&#39;échantillon. Le transfert de chaleur vous permettra de retirer la lame sans perturber le tissu. </li><li> Enduire le tissu avec PTOM et équilibrer pendant 5 min. Couper des sections à 10 um (figure 1E, F). Inspecter visuellement les sections jusqu&#39;à ce que les cryptes sont vus. sections de placer dans une tubes de 1,5 ml ou sur diapositives. </li><li> Pour l&#39;analyse de l&#39;ARNm ou de protéines, endroit til échantillons dans des tubes avec 5 crypte base, 5 transition, et 5 sections de surface par tube. Pour la collecte de l&#39;ARN ajouter 1 ml de réactif d&#39;isolement commercial et incuber à température ambiante pendant 10 min. Effectuer la purification de l&#39;ARN selon les instructions du fabricant. Utilisation 5-10 ug d&#39;ARN total pour la production d&#39;ADNc. </li><li> Pour la purification des protéines, ajouter 0,5 ml de RIPA froid tampon de lyse (plus les inhibiteurs de protéase) pour 5 sections. Soniquer trois fois à un cycle de 70%, sur de la glace. <ol><li> Ajouter échantillons à SDS PAGE tampon de chargement (tampon Laemmli) et incuber à 100 ° C pendant 10 min. Échantillons soumis à SDS-PAGE et de transfert, puis bloquent dans 5% de lait / PBS pendant 2 heures. Effectuer une analyse western blot suivie d&#39;une incubation avec des anticorps Klf4 (1: 500) O / N à 4 ° C. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).</li>
<li>Humphries, A., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+crypt+organization+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Colonic crypt organization and tumorigenesis.</a> Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).</li>
<li>Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+is+it+really+just+another+break+in+the+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall.</a> Gut. 56, 6-8 (2007).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Rand, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+dissociates+and+activates+heterodimeric+notch+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors.</a> Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).</li>
<li>Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+by+Transmission+of+Mechanical+Stress+through+Epithelial+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues.</a> Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).</li>
<li>Lechner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+pattern+of+laser+microdissected+colonic+crypts+of+adenomas+with+low+grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia.</a> Gut. 52, 1148-1153 (2003).</li>
<li>Reizel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+stem+cell+and+crypt+dynamics+exposed+by+cell+lineage+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction.</a> PLoS Genet. 7, e1002192(2011).</li>
<li>Kosinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+human+colon+tops+and+basal+crypts+and+BMP+antagonists+as+intestinal+stem+cell+niche+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).</li>
<li>Tamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pit+pattern+and+three-dimensional+configuration+of+isolated+crypts+from+the+patients+with+colorectal+neoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm.</a> J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+dendritic+cells+and+macrophages+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).</li>
<li>Neumann, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+commensal+bacteria+and+regional+Wnt+gene+expression+in+the+proximal+versus+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon.</a> Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).</li>
<li>Capaldo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokine-induced+tight+junction+remodeling+through+dynamic+self-assembly+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins.</a> Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).</li>
<li>Wells, J. M., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+an+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make an intestine.</a> Development. 141, 752-760 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Les mécanismes moléculaires impliqués dans le côlon prolifération des cellules épithéliales et la différenciation sont mal comprises. Cela comprend lacunes dans notre compréhension de l&#39;environnement de la signalisation cellulaire du compartiment des cellules souches à la base des cryptes épithéliales du côlon. Il ya également un intérêt croissant dans les processus qui sous-tendent la différenciation des entérocytes. Par exemple, une meilleure compréhension de la différenciation in vivo est requise comme une référence pour les études visant à produire in vitro des systèmes intestinaux primaires 16. La procédure ci-dessus contient plusieurs mesures qui nécessitent une attention particulière. Tout d&#39;abord, enlever les bords autour du segment de tissu congelé (tel que discuté à la section 3.2) est nécessaire que les bords de tissus papillotes pendant la dissection et la congélation. Si vous ne déplacez ces arêtes résultats est une population mixte de cellules de surface et de base crypte. Montage du tissu sur un pré-réfrigérés, EAO bloc nivelé est également essentiel. Tson protocole peut être adapté à d&#39;autres régions du côlon distal en modifiant le nombre de sections dans chaque pool. Par exemple, comme représenté sur la figure 1B, la longueur de la muqueuse crypte varie entre 150 à 300 um. Par conséquent, lorsque l&#39;on étudie la zone comprise entre 4 cm-6 cm de l&#39;anus, le nombre de sections doit être augmentée de 15 à 30. Il est important, ce protocole est pas suggéré pour le côlon proximal (7 cm 9 cm) en raison des plis ( plicae obliquae) qui étendent dans la lumière qui rend impossible de surface et de la crypte à base de cellules séparées par sectionnement série. Techniques de coupes sériées ont été utilisés pour étudier la crypte-base et la surface populations de cellules épithéliales chez l&#39;homme. Cependant, notre protocole ajoute des étapes supplémentaires qui sont nécessaires en raison de la petite taille du tissu murin. Nous proposons que le protocole ci-dessus permettra de l&#39;enquête de base et crypte-population de cellules épithéliales de surface dans les systèmes de souris génétiquement traitables. En effet, les sections regroupées Yield protéines de haute qualité et d&#39;analyse en aval appropriée de l&#39;ARN. Les applications futures pourraient inclure l&#39;étude des voies de signalisation cellulaire ou immunoprécipitation de la chromatine. Toutefois, il convient de noter que, comme plusieurs des méthodes décrites ci-dessus, les sections résultantes contiennent un mélange de cellules épithéliales lamina propria et interstitielles. En conclusion, le protocole décrit ici fournit un procédé de production rapide, haut pour l&#39;analyse de processus moléculaires dans des régions spatialement distinctes de la muqueuse du côlon murin.

L&#39;épithélium colique est un tissu très régénérative, avec des cellules souches résidentes reconstitution du tissu tous les quelques jours 1. Ce processus de régénération nécessite le maintien d&#39;un compartiment de cellules souches proliférative. Avec le temps, les cellules filles nouvellement produits perdent leur potentiel de prolifération et de la migration vers la surface luminale de l&#39;intestin. Coïncidant avec la migration, les cellules progénitrices se différencient en entérocytes de barrière formant matures ou cellules muqueuses caliciformes productrices. Le défaut de ce programme de différenciation est considérée comme compromise contribuer à barrière epitheliale comme cela est observé dans la maladie inflammatoire de l&#39;intestin et du côlon 2,3. Une étude détaillée des processus ci-dessus, il faudra des méthodes pour isoler les populations crypte-base et cellulaires de surface. Plusieurs méthodes existent, chacune avec des avantages uniques et des inconvénients. Les méthodes actuelles pour l&#39;isolement de cellules épithéliales intestinales comprennent chagents exaltants et dissociation mécanique, ce qui entraîne l&#39;isolement des cryptes entiers, des feuilles epitheliales ou des cellules individuelles en fonction des conditions expérimentales 4,5. Ce sont des méthodes à haut rendement, mais les changements dans la signalisation intracellulaire ont été rapportés dans ces conditions, qui peuvent ne pas représenter l&#39;environnement natif 6,7. microdissection laser permet la collecte de matériau distinct spatiale, mais réalise moléculaire faible rendement 8,9. Dans les tissus du côlon humain, les méthodes de cryosectioning horizontaux de série ont été mis au point 10. Cependant, tissus murins muqueuses sont prohibitifs petit pour l&#39;appropriation directe de cette technique. Chez les humains, les longueurs de la crypte intestinale (la distance entre la crypte-base et cellules de surface) dans le côlon varient entre ~ 100-1000 um 11. Chez les souris, les longueurs sont comprises entre crypte ~ 50 à 300 pm (voir la figure 1A). La petite taille des cryptes murins représente un défi pour l&#39;isolation de ces deux populations de cellules en utilisant des protocoles existants. Nous décrivons maintenant un faible coût, la méthode à haut rendement pour l&#39;isolement de crypte-base et la surface population de cellules épithéliales dans les tissus du côlon murin. Tissus récoltés de cette manière peut ensuite être analysé par un certain nombre d&#39;applications en aval, y compris les types immunofluorescence, une RT-PCR en temps réel (-Polymerase Chain Reaction) ou transfert de Western.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Nussloch Allemagne</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur PCR en temps réel MyiQ</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microscope confocal</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>cryo-moule</td><td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mm</td></tr><tr><td>Lame de microtome à profil élevé</td><td>Leica Biosystems, Nussloch allemagne</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM lames industrielles</td><td>American Safety Razor Blades</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard base en élastomère de silicium</td><td>Dow Corning, Midland MI</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de 27 1/2 g</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>305109</td><td>broches pour dissection</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps ZO-1</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps KLF4</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Secondaire Alexa conjugué</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 anti-lapin</td></tr><tr><td>Anticorps Secondaire HRP conjugué</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>lapin/souris&nbsp ;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs tampon salin équilibré</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampon</td><td></td><td></td> de lyse <td>50mM Tris-HCl pH 7,4 150mM NaCl 1 % NP40 0,25 % Na-désoxycholate</td></tr><tr><td>primer TBP</td> 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>primer TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>primer KLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>amorce KLF4</td> <td>5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning méthode de microdissection de murin côlon muqueuse

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

<classe p = 'jove_content'> Le tissu de la muqueuse colique constitue une barrière vitale contre les antigènes luminaux. Cette barrière est composée d’une monocouche de cellules épithéliales cylindriques simples. L’épithélium colique est retourné dynamiquement et des cellules épithéliales sont générées dans la cellule souche contenant les cryptes de Lieberkühn. Les cellules progénitrices produites dans les cryptes-bases migrent vers la surface luminale, subissant un processus de différenciation cellulaire avant d’être excrétées dans la lumière intestinale. Afin d’étudier ces processus au niveau moléculaire, nous avons développé une méthode simple pour la microdissection de deux régions spatialement distinctes de la muqueuse colique ; la zone cryptique proliférative et les cellules épithéliales de surface différenciées. Notre objectif est d’isoler des populations spécifiques de cellules épithéliales cryptiques et de surface à partir de la muqueuse colique de souris pour l’isolement de l’ARN et des protéines.

Coupes de tissus du côlon ont été traitées pour l&#39;évaluation histologique et la coloration H &amp; E 13. Une vue en coupe transversale traditionnelle de la muqueuse est vu sur la figure 2A. Zones basales contiennent l&#39;externe de la musculeuse, composée principalement de la musculeuse circulaires. En procédant vers la lumière, de la muqueuse musculaire est évident adjacente aux cellules epitheliales cryptiques-base et les cellules de transition sont au milieu du tissu, et enfin, des populations de cellules de surface font face à la lumière intestinale. La méthode décrite ici coupes sériées maintient une orientation telle que la musculeuse longitudinales et circulaires se rencontrent d&#39;abord (figure 2B), suivie de la muscularis mucosa (figure 2C). On note l&#39;apparition de cellules interstitielles non-musculaires en haut à gauche de l&#39;image. Pour l&#39;analyse en aval décrit ci-dessous, les sections de muscles sont écartés. Les sections suivantes contiennent des cellules épithéliales et tissu interstitiel (lamina propria), En commençant par les cellules crypte-base (Figure 2D). Noter l&#39;absence d&#39;une lumière centrale dans la plupart des cryptes, qui apparaissent plus foncées dues aux noyaux serrés. Ces couches contiennent du compartiment prolifératif. Les cellules transitoires apparaissent comme serrés glandes avec lumens centraux importants (figure 2E). Enfin, les populations de cellules de surface ont une structure irrégulière, avec des zones de la monocouche épithéliale vu de face (figure 2F). Des coupes en série comme décrit ci-dessus peuvent également être traitées à l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence et la microscopie confocale (comme décrit ici 14). Figure 2G montre cryptes isolées fixes et perméabilisées dans 100% de méthanol et ensuite colorées pour les noyaux (bleu) et la protéine de jonction cellule-cellule Zonula occludens 1 (ZO-1, vert). Dans l&#39;orientation de sectionnement traditionnelle, cellule crypte et la surface peut être consulté simultanément (Figure 2G </strong&gt;). On notera que les ZO-1 lignes de jonction de teinture de la lumière de la crypte du côlon. Ce revêtement Z0-1 de la lumière peut également être vu dans les échantillons de série en coupe de populations de cellules de transition, dans le centre des glandes circulaires (figure 2G). Enhanced ZO-1 tache est vu dans des populations cellulaires de surface (Figure 2I et J). Plusieurs facteurs de différenciation sont connues pour être exprimées d&#39;une manière spatio-temporelle le long de l&#39;axe crypte-à-surface. Cela comprend le facteur facteur de transcription Kruppel-like 4 (KLF4), qui est connu pour être enrichi dans des populations cellulaires de surface. En utilisant des méthodes traditionnelles de sectionnement, KLF4 se trouve dans les noyaux de lumière faisant face populations cellulaires de surface (Figure 2K). On a donc supposé que KLF4 ARNm serait exprimé de manière prédominante dans des populations cellulaires de surface. Pour tester cela, des coupes en série ont été collectés et regroupés dans des échantillons de surface, de transition, et la crypte-base. Subsequently, l&#39;ARN a été récolté en utilisant l&#39;extraction Trizol standard, avec une purification supplémentaire par colonne RNeasy et le traitement DNAse. L&#39;ARN a été recueilli à partir de 5 sections consécutives en gestion commune, qui a donné entre 5-10 ug d&#39;ARN total par échantillon. Ces échantillons ont ensuite été soumis à la PCR en temps réel semi-quantitative pour les deux KLF4 et un gène de référence, TATA liaison box protein 1 (TBP-1) (Figure 2L) 14. Comme représenté sur la figure 2L, après normalisation de la TBP-1, des cellules de surface se sont révélés exprimer jusqu&#39;à huit fois la KLF4 ARNm qui est exprimée dans les cellules cryptiques. De même, les niveaux de protéine Klf4 ont été trouvés à exposer régulation spatiale long de l&#39;axe crypte-surface. Des coupes sériées ont été réunies comme décrit ci-dessus, puis incubées dans du tampon de lyse pendant 20 min à 4 ° C. Cela a donné entre 200-250 pg de protéine par échantillon. Les échantillons ont ensuite été soumis analyse par SDS-PAGE (Figure 2 M) 15. Comme le montre la Figure 2 M, p KLF4rotein niveaux sont considérablement plus élevés dans les populations de cellules de surface. Les résultats ci-dessus démontrent la capacité de ce protocole pour isoler de grandes quantités de surface et les cellules épithéliales des cryptes de la muqueuse du côlon murin. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> Figure 1: (A) Schéma démontrant muqueuse du côlon murin et des couches de muscles externes. Notre méthode vise à recueillir des populations de cellules distinctes de cellules de surface et de la crypte-base par cryosectioning série (10 um chacun). Les couches musculaires externes sont éliminés. Hauteur (B) crypte varie sur la longueur du côlon (distance entre les couches à base de cryptes et de surface). Les points de données indiquent les mesures et les symboles de la crypte individuels indiquent répétitions biologiques (n = 4). (C) des segments de Colon recueillies, bissectées et épinglés sur un plat de silicium dissection. (D) Un tissu soigment environ 3 cm de l&#39;anus est pressé entre deux lames de rasoir et de la gelée sur glace sèche. (E) Le tissu est ensuite monté sur un bloc octobre pré-nivelé. (F) cryosections sont enlevés et inspecté visuellement. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> Figure 2:. Les données représentatives (A) des tissus du côlon colorées à l&#39;hématoxyline-éosine en coupe montrant la musculeuse circulaires (cm), la muqueuse de la musculeuse (mm), les cellules crypte-base, cellules transitoires, et les cellules de surface. (B - C) des couches musculaires du côlon. (D) des cellules Crypt-base. Noter l&#39;absence d&#39;une lumière centrale. (E) Les cellules transitionnelles. (F) cellules de surface. (G) Immunofluorescence des cryptes coliques isolés. ZO-1 (vert) et noyaux (bleu) sont observées en coupe. (SALUT) ZO-1 et coloration nucléaire dans les cellules de transition et de surface. (J) de la vue agrandie de ZO-1 coloration. (K) KLF4 (vert) est enrichi en des populations cellulaires de surface. (L) en temps réel PCR évaluation des niveaux d&#39;ARNm KLF4 entre les trois compartiments. (M) Western blot de l&#39;analyse des taux de protéines Klf4 dans ces populations de cellules.

Ici, nous décrivons une méthode simple pour isoler les cellules de surface épithéliale du côlon murin spatialement distinctes des cellules de base cryptiques sous-jacentes.

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

L'objectif général de cette procédure est de microdisséquer deux régions spatialement distinctes du côlon : la zone cryptique proliférative K et les cellules épithéliales superficielles différenciées. Cela est réalisé en premier lieu en retirant le côlon de la souris. La deuxième étape consiste à congeler le tissu entre deux plaques métalliques.Ensuite, le tissu est monté sur un bloc OCT préalablement nivelé. La dernière étape consiste à découper le tissu en sections de 10 micromètres d'épaisseur sur un cryostat. Enfin, une PCR en temps réel ou un immunoblotting est utilisé pour mettre en évidence les modifications de l'expression des gènes et des protéines.L'avantage de notre technique est qu'elle est rapide, peu coûteuse et donne des résultats élevés. Notre procédure est réalisée par Christian Garner Schmidt, un technicien de notre équipe. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel d'entretien et d'utilisation des animaux de l'Université Emory, et ont été effectuées conformément aux critères des Instituts nationaux de la santé.Après avoir installé le cryostat, comme d'habitude, équilibrez les lames et les porte-échantillons du cryostat à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, remplissez un moule cryogénique vide avec du composé optimal pour la température de coupe et équilibrez-le à moins 20 degrés Celsius. Cette étape prendra environ 30 minutes.Retirer l’OCT congelé du moule et le fixer sur le mandrin à l’aide d’OCT liquide. Placer le mandrin sur le bras du microtome et laisser durcir l’OCT pendant 10 minutes. Régler le cryostat sur 10 microns par coupe et aplanir le bloc d’OCT jusqu’à ce qu’il soit plat, puis éloigner le bras du microtome de plusieurs centimètres par rapport à la lame.Ensuite, préparez deux lames de rasoir par échantillon à l’aide d’une lime métallique, en émoussant le tranchant des lames. Puis retirez la bride en aluminium à l’aide de la pince. Préparez une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres, remplie à 50 % de silicone, et munie de 10 à 15 épingles de dissection.Ajoutez cinq millilitres de tampon de Hank à température ambiante dans la boîte après avoir euthanasié la souris selon les méthodes approuvées et excisé un segment du côlon distal compris entre zéro et six centimètres de l’anus. Utilisez des ciseaux pour couper. Ouvrez longitudinalement le côlon et retirez le contenu fécal.Épingler le tissu sur la boîte de dissection en silicone contenant le tampon de Hank, avec la surface muqueuse orientée vers le haut. Étirer le tissu à l’aide des épingles de dissection. Puis le laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante afin d’éliminer les plis du tissu et permettre la relaxation des couches musculaires.Une fois que le tissu a reposé, retirez tous les broches sauf celles des extrémités. Faites glisser une lame de rasoir sous la section de tissu souhaitée, puis versez le tampon hanks. Ajoutez une autre lame de rasoir par-dessus pour former un sandwich.Couper le segment de tissu et retirer les broches aux extrémités. Transférer le « sandwich » tissu-lame de rasoir vers la glace sèche. Laisser le tissu geler pendant cinq à dix minutes.Prendre le sandwich de tissu avec le rasoir et le laisser tiédir légèrement en posant un doigt sur la lame supérieure. Séparer le sandwich et découper autour des bords du segment de tissu. Découper un segment de tissu d’environ 0,5 centimètre sur un centimètre.Laisser le tissu se réchauffer jusqu'à ce que la glace en surface commence à fondre. À ce stade, appuyer rapidement et soigneusement le tissu dans le bloc OCT. Dans le cryostat, placer un doigt sur l'échantillon.Le transfert de chaleur permettra de retirer la lame sans perturber le tissu. Recouvrir le tissu de OCT et laisser équilibrer pendant cinq minutes. Ensuite, couper des sections de 10 micromètres.Placer les sections sur une lame et les examiner visuellement jusqu'à ce que les cryptes soient visibles. Mettre les sections dans des tubes de 1,5 millilitre ou sur des lames. Cette image montre un tissu colique coloré à l'hématine-éosine en coupe transversale classique, avec le muscle circulaire désigné par « cm ».La musculeuse de la muqueuse, indiquée par MM, permet de distinguer clairement les cellules de la base des cryptes, les cellules transitoires et les cellules superficielles. Cette image montre la musculeuse circulaire après des coupes sérielles. En progressant vers les cellules superficielles, la musculeuse de la muqueuse est visible.Cette image montre, à plus fort grossissement, les cellules de la base des cryptes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine. Remarquez l’absence d’un lumen central. Ici, des cellules de transition sont visibles et cette image illustre les cellules de surface.Les images suivantes montrent une coloration immunofluorescente de cryptes coliques isolées, mettant en évidence la protéine des jonctions intercellulaires. Soula occludin un ou ZO un apparaît en vert et les noyaux, qui apparaissent en bleu, sont observés en coupe transversale. Les cellules de transition et les cellules superficielles sont présentées ici après des coupes sérielles.Plusieurs facteurs de différenciation sont exprimés de manière spatiotemporelle le long de l'axe de la surface cryptique. Cela inclut le facteur de transcription cripple like factor four, montré en vert, qui est enrichi dans les populations cellulaires de surface lorsqu'on les observe en coupe transversale. Le sectionnement en série permet l'évaluation par PCR en temps réel des niveaux d'ARNm de KLF four entre les trois compartiments. Enfin, ce western blot démontre les niveaux de la protéine KLA four dans ces populations cellulaires.N'oubliez pas que le travail avec des lames de microtome peut être extrêmement dangereux ; soyez donc particulièrement prudent chaque fois que vous effectuez cette procédure.

cryosectioning-method-for-microdissection-of-murine-colonic-mucosa

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dans cette vidéo, nous montrons une technique pour isoler des cryptes entières de l’intestin grêle d’une souris. Les cryptes entières isolées peuvent être utilisées pour propager des organoïdes 3D à longue durée de vie et auto-renouvelés in vitro.

Isolement des cryptes intestinales : une méthode pour isoler des cryptes entières de l’intestin grêle d’un modèle murin

Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Le myofibroblastes est une cellule influent stromale du tractus gastro-intestinal qui régule les processus physiologiques importants dans les états normaux et pathologiques. Nous décrivons une technique qui permet l'isolement des myofibroblastes primaires à partir de la souris et le tissu du côlon humain, qui peut être utilisé pour l'expérimentation in vitro.

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

L’utilisation d’un dispositif simple pour couper et « rouler » des intestins de souris afin de préparer rapidement des préparations entières est décrite.

Un dispositif simple d&#39;élaborer rapidement entiers Monts de l&#39;intestin de souris

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Cryosectioning de contigües Les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

Le but du présent protocole est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité de ganglia entérique isolée du tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Ce protocole consiste à préparer les échantillons congelés flash de tissu intestinal humain, de cryosectioning, de coloration dans l’éthanol et de déshydratation, LCM et extraction de l’ARN.

Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.

À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques

Le but de ce protocole est d'isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l'aide de collagène. Ce protocole permet l'isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l'immunophénotypage robuste.

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

Ici, nous fournissons une description détaillée de la procédure pour induire des biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris et suivre la fermeture de blessure en temps réel. En outre, des méthodes pour la préparation des tissus pour des analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires du lit de blessure sont fournies.

Effectuer des biopsies de pincement guidées par colonoscopique chez la souris et évaluer les changements ultérieurs des tissus

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Découvrez la microdissection de cryptes coliques et de cellules épithéliales de surface chez la souris par cryosection. Cette méthode rapide et économique permet d'analyser l'expression génique et protéique par PCR en temps réel et Western blot.

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

Explorer plus de vidéos