Une technique Label-free pour l'imagerie spatio-temporelle de cellule unique sécrétions

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la sécrétion de protéines à partir de cellules individuelles avec une résolution temporelle et spatiale élevée. Ceci est réalisé en fabriquant lithographiement des nanocapteurs plasmoniques d’or sur des lamelles de verre pour l’imagerie sans marquage des sécrétions de cellules uniques. Dans un deuxième temps, la puce du capteur est nettoyée et recouverte de la monocouche auto-assemblée, puis fonctionnalisée avec des ligands qui ont une grande affinité pour les protéines de l’analyte sécrétées.

Ensuite, les cellules sont intégrées sur les puces de capteurs fonctionnalisées afin de mesurer leurs sécrétions dans l’espace et le temps. Les résultats montrent que les sécrétions protéiques des cellules individuelles peuvent être cartographiées à la fois spatialement et temporellement sans qu’il soit nécessaire de les marquer. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la communication intercellulaire, telles que la façon dont les voies de signalisation paracrine et autocrine régissent la motilité cellulaire.

Pour commencer cette procédure, déposez une couche mince de chrome de 10 nanomètres sur des lamelles de recouvrement préalablement nettoyées par évaporation par faisceau d’électrons afin d’éviter les effets de charge lors de la structuration et de l’imagerie des nanostructures. Suite à cette rotation, la première couche de résine bicouche composée de lactate d’éthyle, copolymère de méthacrylate de méthyle à 2000 tr/min pendant 45 secondes. Ensuite, faites cuire le substrat à 150 degrés Celsius après avoir laissé le substrat refroidir à température ambiante.

Faites tourner la deuxième couche de polyméthacrylate de méthyle à 3000 tr/min pendant 45 secondes et faites cuire le substrat à 150 degrés Celsius. La résistance bicouche utilise la lithographie par faisceau d’électrons ou EBL. Développez un alcool isopropylique ou IPA méthyl isobutylcétone, ou MIBK dans un rapport de deux pour un et rincez dans de l’IPA.

Retirez le chrome de la zone développée des nanostructures par gravure humide à l’aide de la gravure CR sept pendant 10 secondes à température ambiante, puis rincez dans de l’eau distillée désionisée Déposer une pellicule d’or de titane sur le substrat à l’aide de l’évaporateur à faisceau d’électrons après le dépôt d’or. Soulevez la bicouche de copolymère. Résistez en trempant le substrat dans de l’acétone pendant quatre heures.

Ensuite, inspectez le substrat à l’aide d’un microscope électronique à balayage pour confirmer la forme et la taille de la nanostructure. Les nanostructures résultantes sont généralement séparées par un pas de 300 nanomètres. Des réseaux de nanostructures de 20 par 20 sont espacés de 30 microns de centre à centre.

Laissant amplement d’espace pour l’imagerie cellulaire, une puce typique contiendra 300 réseaux. Retirez le chrome restant du substrat par le bord humide à l’aide d’une gravure CR sept pendant 60 secondes à température ambiante. Rincez ensuite le substrat à l’eau distillée déminéralisée.

Ensuite, inspectez un sous-ensemble de réseaux à l’aide du microscope à force atomique pour vérifier la taille et l’uniformité. Cette lamelle en verre à motifs peut être utilisée plusieurs fois tant que les procédures de nettoyage appropriées sont suivies pour le nettoyage et la régénération du plasma de surface localisé et des puces de résonance ou LSPR. Cendres plasma à une puissance de 40 watts dans un mélange de 300 milli à 5 % d’hydrogène et 95 % d’argon pendant 45 secondes.

Fonctionnaliser la surface d’or et les nano structures immédiatement après l’injection plasma. En immergeant la puce dans une solution d’éthanol thiol à deux composants composée d’un rapport de trois pour un de SPO et de SPC. Après avoir laissé la puce dans la solution de thiol pendant la nuit pour former une monocouche auto-assemblée, rincez-la à l’éthanol et séchez-la avec de l’azote gazeux, chargez la puce LSPR dans un support microfluidique sur mesure en plaçant la puce sur une pièce inférieure en aluminium.

Ensuite, prenez la puce en sandwich entre cette pièce inférieure et un joint en silicone et une pièce supérieure en plastique transparent à l’aide de quatre vis pour serrer l’ensemble. Pour une application typique de thiol à base de SPC, appliquez une couche de dépôt de 300 microlitres d’un mélange un à un d’EDC millimolaire et de NHS 33 millimolaires dans de l’eau distillée désionisée pour activer les groupes carboxyles du composant thiol SPC. Après avoir attendu 10 minutes, rincez manuellement la surface avec 10 millimolaires de PBS en suivant ce conjugué du groupe carboxyle activé avec le ligand d’intérêt en enduisant 300 microlitres de la solution de ligand.

Après avoir attendu une heure et rincé la surface avec un code de chute PBS de 10 millimolaires, 300 microlitres d’éthanolamine 0,1 molaire dans du PBS sur la puce pour minimiser la liaison non spécifique. Après 10 minutes d’attente, laver l’éthanolamine avec du PBS contenant 0,005 % entre 20 et 20 PBST. Ensuite, placez un morceau de quartz au-dessus de la puce pour réduire les fluctuations des données liées à un ménisque changeant.

Gardez la puce humide avec la mémoire tampon PBST 20 pendant le montage sur le microscope. Fixez le tube microfluidique à l’ensemble et au tampon d’écoulement jusqu’à ce qu’un état stable soit atteint. Placez ensuite fermement l’ensemble de puces LSPR dans le porte-échantillon de platine chauffé.

La configuration optique de cette méthode est illustrée ici. La lumière de la lampe halogène passe à travers un filtre passe-partout de 593 nanomètres pour éliminer les longueurs d’onde, qui ne contribuent pas à la réponse nanoplasmonique. La lumière est ensuite polarisée linéairement et l’échantillon est éclairé via un objectif à ouverture numérique de 40 x 1,4 pour l’excitation des nanostructures d’or plasmoniques.

La lumière diffusée est collectée par l’objectif et passée à travers un polariseur croisé pour réduire le signal de fond du substrat de verre. Un séparateur de faisceau 50-50 est inséré dans le trajet lumineux collecté pour une analyse spectroscopique et d’imagerie simultanée. Après avoir laissé l’ensemble et le microscope s’équilibrer pendant au moins deux heures, alignez la puce à l’aide du joystick de sorte que le réseau central soit aligné avec la fibre optique pour la spectroscopie.

Après avoir cultivé et granulé des cellules hybrides DOMA par centrifugation, récoltez-les, puis testez leur viabilité avant de les introduire dans les puces LSPR. Ensuite, introduisez manuellement 50 microlitres de la solution cellulaire dans les puces LSPR à l’aide d’une micro-pipette. Enfin, lavez les cellules restantes en solution avec un milieu frais sans sérum à l’aide d’un système de profusion microfluidique pour préparer les puces LSPR pour l’imagerie.

Une superposition d’une image d’imagerie LSPR, qui met en évidence les réseaux carrés, et d’une image éclairée en lumière transmise, qui met en évidence la cellule en bas à gauche, est présentée ici. Une cellule colorée avec la tige de colorant à membrane fluorescente Domine, DHPE présente des extensions semblables à des filopodes. Si de telles extensions devaient se chevaucher avec les puces, elles donneraient un faux positif pour les données de spectrométrie de sécrétion de protéines avant et après l’introduction d’une solution saturante d’anticorps antistamiques dans les puces fonctionnalisées cmic est affichée ici.

Cette méthode est utilisée pour calibrer les réseaux. L’étalonnage des réseaux permet de normaliser la réponse des capteurs et de déterminer l’occupation fractionnée en fonction du profil de biofonctionnalisation de chaque exécution. Un instrument SPR commercial est utilisé pour déterminer la constante de dissociation ainsi que pour étudier la résistance à la liaison non spécifique en utilisant le même protocole que celui décrit pour la puce LSPR.

Les valeurs normalisées de deux tableaux sont affichées ici. Un réseau se trouvait à moins de 10 micromètres de la cellule tandis que le contrôle était à 130 micromètres de la cellule. L’augmentation soudaine de la réponse normalisée de la matrice la plus proche de la cellule par rapport à la réponse plate de la matrice de contrôle est indicative d’une rafale localisée d’anticorps sécrétés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les sécrétions de protéines à partir de cellules individuelles avec une résolution spatiale et temporelle élevée.