Name: Early Viral entrée dosages pour lidentification et lévaluation des composés antiviraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation des composés antiviraux ciblant l'entrée virale précoce en utilisant des cellules HUH 7.5 et des tests de luciférase. Cette approche mécanistique permet d'identifier de nouveaux agents antiviraux efficaces.

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Cette étude est financée par l’hôpital universitaire médical de Taipei (102TMU-TMUH-19) et le ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Remarque: Veiller à ce que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et infection par le virus sont menées dans les hottes de biosécurité certifiés qui sont appropriés pour le niveau des échantillons de biosécurité être manipulé. Aux fins de la description des protocoles, la luciférase de Gaussia VHC à marquage rapporteur est utilisé comme un modèle de virus 32. Dans le contexte des résultats représentatifs, l&#39;acide des composés de chébulagique (CHLA) et punicalagin (PUG) sont utilisés comme antiviraux candidats qui ciblent les interactions avec les glycosaminoglycanes glycoprotéine virale de surface cellulaire lors de l&#39;entrée virale premières étapes 31. L&#39;héparine, qui est connu pour interférer avec l&#39;entrée de nombreux virus 30,31,33,34, est utilisé comme un traitement de contrôle positif dans ce contexte. Pour des informations de base sur des techniques de virologie, la propagation de virus, la détermination du titre du virus, et l&#39;expression de la dose infectieuse en unités formant des plages (PFU), concentrer les unités de formage (FFU), ou multiplicité d&#39;infection (MOI), le lecteur est re35 préféré pour référencer. Pour des exemples antérieurs et des conditions optimisées utilisés pour les virus indiqués dans les résultats représentatifs, le lecteur est renvoyé aux références 30-32,36-39 ainsi que les détails figurant au tableau 1, figure 1A et la figure 2A. 1. Culture cellulaire, Préparation composé et composé de cytotoxicité <ol><li> Cultiver la lignée cellulaire respectif pour le système d&#39;infection par le virus à analyser (tableau 1). Pour le HCV, cultiver les cellules Huh-7,5 dans du milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 U / ml de pénicilline G, 200 ug / ml de streptomycine et 0,5 pg / ml d&#39;amphotéricine B. </li><li> Préparation des composés d&#39;essai et les témoins en utilisant leurs solvants respectifs: par exemple, dissoudre ABSC et PUG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO); préparer l&#39;héparine dans l&#39;eau double distillée stérile. Pour tous les autres dilutions, utiliser des milieux de culture. Remarque: Le concent finaleration de DMSO dans les traitements composés de test est inférieure à 1% dans les expériences; 1% de DMSO est comprise comme traitement témoin négatif dans les tests de comparaison. </li><li> Déterminer la cytotoxicité des composés à tester (par exemple, ABSC et PUG) sur les cellules pour l&#39;infection virale en utilisant une viabilité cellulaire déterminer réactif tel que le XTT (2,3-bis [2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl] -5-phénylamino) carbonyl] -2H-tétrazolium hydroxyde): <ol><li> Pour le VHC, ensemencer 7,5 Huh-cellules dans une plaque de 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur O / N pour obtenir une monocouche. </li><li> Appliquer témoin de DMSO (1%) ou des concentrations croissantes de composés d&#39;essai ABSC et PUG (ex. 0, 10, 50, 100, et 500 pM) dans les puits de culture en triple exemplaire. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 72 heures, puis jeter le milieu dans la plaque et laver les cellules avec 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) deux fois. </li><li> Ajouter 100 pi de assaying de solution du kit test in vitro en toxicologie-XTT dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant encore 3 heures pour permettre la production XTT formazan. </li><li> Déterminer l&#39;absorbance avec un lecteur de microplaques à une longueur d&#39;onde de test de 492 nm et une longueur d&#39;onde de 690 nm de référence. </li><li> Calculer le pourcentage de survie des cellules en utilisant la formule suivante: viabilité cellulaire (%) = A / As x 100%, où «A» et «sous» se référer à l&#39;absorbance des composés d&#39;essai et le témoin de solvant (par exemple 1% de DMSO. ) traitements, respectivement. Déterminer la concentration de 50% de cytotoxicité cellulaire (CC 50) des composés d&#39;essai à partir d&#39;un logiciel d&#39;analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. </li></ol></li></ol> 2. Lecture de l&#39;infection virale Remarque: La lecture d&#39;une infection virale dépend du système de virus utilisé et peut impliquer des procédés tels que des dosages de plaques ou meaSuring signaux rapporteurs de virus rapporteurs marqués. Procédé pour détecter une infection par le VHC reporter sur la base de l&#39;activité rapporteur de la luciférase est décrite ci-dessous. <ol><li> Recueillir les surnageants des puits infectés et de clarifier à 17.000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Mélanger 20 ul de surnageant de test à 50 ul de substrat de la luciférase à partir de la trousse de dosage de la luciférase de Gaussia et de mesurer directement avec un luminomètre selon les instructions du fabricant. </li><li> Exprimer HCV infectieux tel que log 10 d&#39;unités lumineuses relatives (RLU) de détermination de l&#39;inhibition virale (%) et de calculer la concentration efficace 50% (EC50) des composés d&#39;essai contre une infection par le VHC en utilisant des algorithmes de logiciel GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. </li></ol> 3. Inactivation virale Assay Remarque: Des exemples de période d&#39;incubation et la dose virale de différents virus aRE admises à la figure 1A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. <ol><li> Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d&#39;obtenir une monocouche. </li><li> Incuber les composés ou des contrôles essai (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) avec les particules de VHC à 37 ° C (figure 1A, «à long terme» ) dans un rapport de 1: 1. Par exemple, pour un inoculum de virus de 100 pi contenant 1 x 10 4 FFU, ajouter 100 ul d&#39;une dilution de travail de 100 uM ABSC; on obtient de l&#39;ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM. </li><li> On dilue le mélange virus-drogue de concentration (sans effet) &quot;sous-thérapeutique&quot; des composés d&#39;essai. Par exemple, la concentration inefficace de l&#39;ABSC et PUG contre le VHC est à 1 uM 31; doncceci nécessite une dilution de 50 fois du mélange virus-médicament qui peut être accompli avec 9,8 ml de milieu basal (milieu de culture cellulaire avec 2% de FBS). Remarque: La dilution à la concentration de sous-thérapeutique empêche l&#39;interaction significative entre les composés d&#39;essai et la surface de la cellule hôte et permet l&#39;examen de l&#39;effet du traitement sur les virions exempts de cellules. Notez que cette dilution est dépendante de la dose-réponse antivirale des composés d&#39;essai contre l&#39;infection virale particulière, et il est déterminé avant de réaliser cet essai particulier 31. </li><li> A titre de comparaison, le virus mélanger avec les composés d&#39;essai et dilué immédiatement (pas de période d&#39;incubation) de concentration sub-thérapeutique avant l&#39;infection (Figure 1A, «à court terme»). </li><li> Ajouter 100 pi du mélange VHC-médicament dilué sur le Huh-7,5 monocouche de cellules (la quantité de virus est maintenant à 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0,01) et incuber pendant 3 heures à 37 ° C pour permettre viraleadsorption. </li><li> Suite à l&#39;infection, retirer le inoculum dilué et laver délicatement les puits avec 200 pi de PBS deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules. </li><li> Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures. </li><li> Analyser l&#39;infection résultant en testant le surnageant pour l&#39;activité luciférase comme décrit dans &#39;2. Lecture d&#39;une infection virale. </li></ol> 4. virale Attachment Assay Remarque: Les exemples de la période d&#39;incubation et la dose virale pour divers virus sont répertoriés dans la figure 2A, «attachement». Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. <ol><li> Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d&#39;obtenir une monocouche. </li><li> Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C for 1 h. </li><li> Co-traiter les cellules infectées par le VHC inoculum (MOI = 0,01) et les composés d&#39;essai ou de contrôle (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) à 4 ° C pour 3 h. Par exemple, pour un inoculum de virus de 90 ul contenant 1 x 10 2 FFU, ajouter 10 ul d&#39;une dilution de travail de 500 uM ABSC; on obtient de l&#39;ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM et une infection par le VHC à une MOI = 0,01 sur la monocouche cellulaire. Remarque: Il est important de réaliser l&#39;expérience à 4 ° C, car elle permet la liaison du virus mais empêche l&#39;entrée qui se produit le plus efficacement à 37 ° C. Effectuer l&#39;addition de composés de virus et de test sur de la glace et l&#39;incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour garantir que la température est maintenue à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et laver délicatement la monocouche cellulaire avec 200 pi de PBS glacé deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules &lt;./ li&gt; <li> Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures. </li><li> Analyser l&#39;infection résultant en testant le surnageant pour l&#39;activité luciférase comme décrit dans &#39;2. Lecture d&#39;une infection virale. </li></ol> 5. virale Entrée / Fusion Assay Remarque: Exemple de périodes d&#39;incubation et dose virale pour divers virus sont répertoriés dans &#39;Entrée / Fusion&#39; Figure 2A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. <ol><li> Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d&#39;obtenir une monocouche. </li><li> Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Infecter les cellules infectées par le VHC (MOI = 0,01) à 4 ° C pendant 3 heures. Par exemple, utiliser un inoculum viral 100 ul contenant 1 x 10 2 FFU. Remarque: Effectuez l&#39;Addition de l&#39;inoculum viral sur de la glace et l&#39;incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour maintenir la température à 4 ° C, ce qui permet l&#39;entrée virale, mais non obligatoire. </li><li> Retirer le surnageant et laver délicatement les monocouches de cellules avec 200 pi de PBS glacé deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules. </li><li> Traiter les puits avec les composés d&#39;essai ou de contrôle (concentrations finales sont les suivantes: 50 uM = ABSC; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) et incuber à 37 ° C pendant 3 heures. Par exemple, ajouter 10 ul d&#39;une dilution de travail 500 um CHLA à 90 pi de milieu, mélanger, et de traiter les puits; on obtient de l&#39;ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM. Remarque: Le passage de 4 ° C à 37 ° C facilite désormais l&#39;événement d&#39;entrée / fusion virale et permet donc l&#39;évaluation de l&#39;effet de composés de test sur cette étape particulière. </li><li> Aspirer le surnageant contenant le médicament et enlever non intérioriséles virus extracellulaires, soit par lavage avec 200 ul de tampon citrate (citrate de sodium 50 mM, chlorure de potassium 4, pH 3,0) ou du PBS. Appliquer 100 ul de milieu de base avant l&#39;incubation à 37 ° C pendant 72 h. </li><li> Analyser l&#39;infection résultant en testant le surnageant pour l&#39;activité luciférase comme décrit dans &#39;2. Lecture d&#39;une infection virale. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.

Dans ce rapport, les méthodes d’identification et d’évaluation des composés antiviraux fondées sur une approche mécaniste de dissection des événements d’entrée virale précoce ont été décrites. Plus précisément, les tests nous ont permis d’examiner l’effet des composés testés sur les particules virales libres, la fixation virale et l’entrée/fusion virale. Des étapes critiques ont été mises en œuvre pour évaluer distinctement l’effet du médicament sur le stade spécifique de l’entrée virale précoce. Par exemple, dans le « test d’inactivation virale », la dilution du mélange virus-médicament à une concentration sous-thérapeutique empêche une interaction significative entre le composé testé et la surface de la cellule hôte en « titrant » le médicament. Cela permet de s’assurer que l’effet inhibiteur observé sur l’infection ultérieure de la cellule hôte est dû à une interaction directe entre le composé testé et les virions acellulaires, plutôt qu’à un effet du composé testé sur la membrane de la cellule hôte ou les molécules associées à la membrane, y compris les récepteurs viraux30. De même, le décalage de température entre 4 °C (qui permet la liaison du virus mais pas l’entrée) et 37 °C (qui facilite l’entrée/fusion du virus) dans le « test d’attachement viral » et le « test d’entrée/fusion virale » est crucial pour déterminer l’effet du composé testé sur chacun de ces événements spécifiques. Ceci est possible en raison de la sensibilité à la température des virus enveloppés au cours de ces étapes de l’infection24-29. Il est donc important que les dosages soient effectués à la température indiquée pour garantir l’exactitude des résultats ; par exemple, en réalisant l’expérience sur de la glace pour la maintenir à 4 °C et en plaçant l’échantillon directement dans un incubateur à 37 °C pour le changement de température. De plus, l’utilisation de témoins négatifs (ex. solvant DMSO pour la préparation de médicaments) et positifs (ex. traitement à l’héparine) permet également d’établir davantage la précision des dosages. L’utilité et l’applicabilité de ces méthodes ont été démontrées dans de nombreuses études antivirales26,30,31,40,41. Il convient de noter que, bien que l’héparine soit incluse comme témoin pour les trois tests dans le contexte des résultats représentatifs, elle bloque généralement la liaison initiale au virus plutôt que l’étape de fusion/entrée qui s’ensuit (comme le montrent les données de la figure 2). D’autres mesures de contrôle pourraient également être utilisées, comme des anticorps neutralisants dirigés contre le virus (pour l’essai d’inactivation virale), des anticorps qui masquent les récepteurs de surface cellulaire du virus (pour l’essai d’attachement viral) et des inhibiteurs de fusion membranaire (pour l’essai de fusion virale ou d’entrée). 
Les tests décrits dans ce rapport, qui sont spécifiques aux premiers stades de l’infection virale, sont utiles en termes d’application en tant que tests secondaires pour caractériser le mécanisme d’action des médicaments candidats à partir de criblages primaires qui ciblent généralement l’infection virale plus largement. Alternativement, ils pourraient également être incorporés dans les cribles primaires si l’on recherche spécifiquement des inhibiteurs de l’entrée virale précoce, y compris les agents inactivateurs du virus, les antagonistes de l’attachement viral et les inhibiteurs de l’entrée/fusion virale. Dans ce cas, leur utilisation permet une analyse de criblage plus ciblée et plus précise pour l’identification de candidats antiviraux spécifiques au mécanisme, ce qui, à son tour, accélérerait le développement de médicaments en aval. 
L’utilisation d’essais cellulaires pour identifier les agents antiviraux offre plusieurs avantages importants par rapport aux essais biochimiques, notamment la révélation d’effets potentiels hors cible (tels que la cytotoxicité) et l’ajout d’une pertinence physiologique à la bioactivité des agents d’essai42. Ces questions sont des considérations importantes pour décider si un agent candidat est utile pour la poursuite dans les phases ultérieures du développement du médicament. De même, les tests spécifiques précoces à l’entrée virale décrits dans ce rapport permettent d’examiner l’effet du médicament sur l’étape distincte de l’entrée virale au niveau cellulaire, et plus particulièrement dans le contexte d’une infection virale authentique in vitro. Les résultats obtenus à partir de ces tests permettraient donc de mieux prédire l’efficacité antivirale des composés testés et d’identifier les effets hors cible potentiellement indésirables contre la cellule hôte. Une limitation potentielle est cependant qu’un essai in vitro basé sur des cellules peut ne pas refléter complètement l’étape d’entrée in vivo réelle dans le contexte d’une infection virale naturelle. Néanmoins, les tests présentés dans ce protocole servent de plate-forme analytique pour l’identification et l’évaluation basées sur le mécanisme de nouveaux agents antiviraux.
La mise au point de virus rapporteurs ou de systèmes de cellules rapporteures pour quantifier la quantité d’infection virale a grandement facilité le dépistage cellulaire et l’évaluation des composés antiviraux. On peut citer par exemple l’utilisation de virus recombinants porteurs d’un gène rapporteur ou au moyen de lignées cellulaires humaines recombinantes contenant un gène rapporteur piloté par le promoteur spécifique du virus31,43. Dans ce rapport, l’infection par le VHC marqué à la luciférase peut être facilement surveillée en quantifiant le signal rapporteur, facilitant ainsi l’analyse des données. En incorporant ces outils utiles basés sur des rapporteurs, les tests d’entrée virale précoce décrits ici peuvent essentiellement être adaptés au format à haut débit pour le criblage basé sur le mécanisme de banques de petites molécules.
En conclusion, un protocole a été décrit pour des tests disséquant l’entrée virale précoce comme moyen d’identifier et d’évaluer des composés antiviraux spécifiques au mécanisme. De tels tests seraient utiles pour découvrir de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale et aideraient à élargir la portée des agents antiviraux pour le développement en tant que traitements prophylactiques et/ou thérapeutiques.

Les infections virales constituent une menace constante pour la santé publique et une cause importante de maladies épidémiques, de morbidité et de décès dans le monde. Les modes spécifiques de lutte contre les infections virales comprennent la mise au point de vaccins et de traitements antiviraux. Bien que les efforts de vaccination aient permis d’immuniser contre plusieurs virus, de nombreux agents pathogènes viraux n’ont toujours pas de vaccin protecteur, notamment le virus de la dengue (DENV), le cytomégalovirus humain (HCMV), le virus de l’hépatite C (VHC), le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le virus respiratoire syncytial (VRS)1-5. Les antiviraux, quant à eux, jouent un rôle important dans la gestion de ces infections virales lorsque les vaccins prophylactiques ne sont pas disponibles. Cependant, à ce jour, il n’existe que peu de médicaments antiviraux homologués et rentables par rapport au nombre d’agents pathogènes viraux qui menacent la santé publique. Plus important encore, en raison de l’augmentation des voyages dans le monde et de l’urbanisation rapide, la situation est aggravée par les risques d’épidémies dues à des infections virales émergentes/réémergentes qui sont introduites dans des zones non indigènes6. Les récentes éclosions causées par le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), les virus de la grippe (H1N1, H5N1, H3N2 et H7N9), le DENV, le virus du Nil occidental (VNO), le virus de la rougeole (MV), le virus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) et le virus Ebola6-12 sont parmi les exemples qui témoignent de la nécessité de mettre au point des antiviraux lorsque la vaccination et/ou les traitements ne sont pas disponibles. De plus, il existe toujours un risque potentiel de générer des infections résistantes aux médicaments avec les antiviraux actuellement utilisés. Par conséquent, le développement et l’élargissement continus de la gamme d’antiviraux à ces infections virales émergentes ou réémergentes sont nécessaires pour fournir de meilleures stratégies de gestion et protéger la santé publique.
La plupart des thérapies antivirales consistent en des antiviraux à action directe (AAD) qui ciblent une protéine virale spécifique ou un cofacteur qui intervient dans des étapes importantes du cycle de vie viral. Par exemple, l’analogue nucléosidique acyclovir inhibe l’ADN polymérase de l’herpèsvirus, les inhibiteurs de la protéase bocéprévir et télaprévir antagonisent le VHC NS3, et l’oseltamivir et le zanamivir sont des inhibiteurs de la neuraminidase qui bloquent la libération de particules virales de la grippe à partir des cellules infectées13-15. Il existe cependant très peu d’inhibiteurs viraux homologués, notamment l’Enfuvirtide, qui cible la gp41 du VIH pour empêcher la fusion, et le Maraviroc, qui bloque le corécepteur du VIH CCR5, empêchant ainsi l’entrée virale16. L’exploration de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale pourrait aider à fournir des traitements supplémentaires à des fins prophylactiques ou thérapeutiques, par exemple en association avec d’autres antiviraux ayant un mécanisme d’action différent pour mieux gérer les infections virales17-19. 
L’identification des antiviraux peut impliquer la conception de médicaments guidée par la structure et une stratégie basée sur le criblage de médicaments candidats. Les méthodes d’évaluation de l’activité antivirale des agents d’essai comprennent les dosages biochimiques de l’activité enzymatique et l’évaluation par des systèmes cellulaires20-23. Dans les systèmes cellulaires, le cycle de vie viral peut être disséqué en stades distincts de l’infection, tels que les événements d’entrée (attachement, fusion, désenrobage), la phase de réplication (réplication du génome viral et traduction des protéines) et la sortie du virion (assemblage, maturation et libération). Étant donné que les tests peuvent être adaptés pour étudier chaque étape spécifique à l’aide de divers outils et méthodes, cette approche permet l’identification et l’examen d’antiviraux candidats potentiels dotés d’un mécanisme d’action spécifique ciblant les différentes étapes analysées. Par exemple, pour analyser l’effet du médicament spécifiquement sur les particules virales libres avant de se lier à la cellule hôte, un « test d’inactivation virale » peut être effectué. Dans ce test, le virus est laissé incuber avec le médicament testé, puis dilué pour titrer le médicament avant d’infecter une monocouche cellulaire. Des étapes supplémentaires telles que l’attachement viral et les étapes d’entrée/fusion peuvent également être analysées individuellement, en modifiant la température pendant l’infection. Pour de nombreux virus enveloppés, l’entrée/fusion virale au niveau de la membrane de la cellule hôte est grandement facilitée à 37 °C, mais elle est généralement exclue à 4 °C, ce qui n’affecte pas la liaisondu virus entre 24 et 29. Enfin, l’utilisation de virus rapporteurs ou de systèmes cellulaires pourrait faciliter ces études et permettre une analyse à haut débit.
Nous avons précédemment utilisé l’approche cellulaire et disséqué l’entrée précoce de divers virus enveloppés pour l’examen des composés antiviraux susceptibles d’antagoniser l’entrée virale30,31. Les différentes méthodes utilisées, y compris l’inactivation virale, l’attachement viral et les tests d’entrée/fusion virale, sont décrites.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage toxicologique in vitro,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr> <tr><td>à base de XTTPBS pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Kit de dosage de la Gaussia luciférase</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Promega</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium, dihydraté</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

early viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Les systèmes cellulaires sont utiles pour découvrir des agents antiviraux. La dissection du cycle de vie viral, en particulier les premiers stades d’entrée, permet une approche mécaniste pour identifier et évaluer les agents antiviraux qui ciblent des étapes spécifiques de l’entrée virale. Dans le présent rapport, les méthodes d’examen de l’inactivation virale, de l’attachement viral et de l’entrée/fusion virale en tant que tests antiviraux à ces fins sont décrites, à l’aide du virus de l’hépatite C comme modèle. Ces tests devraient être utiles pour découvrir de nouveaux antagonistes/inhibiteurs de l’entrée virale précoce et aider à élargir la portée des agents antiviraux candidats pour le développement de médicaments.

Dans la figure 1, le «test d&#39;inactivation virale» a été réalisée pour examiner si deux composés naturels CHLA et PUG spécifiques pourraient inactiver les virus enveloppés dans différents état ​​libre-cellulaire et prévenir l&#39;infection ultérieure. La réponse à la dose antivirale et la cytotoxicité de ces composés ont été déterminées avant l&#39;exécution de l&#39;étude mécaniste 31. Les virus ont été pré-traitées avec les composés d&#39;essai et ensuite les mélanges virus-médicament ont été dilués à des concentrations sous-thérapeutiques avant l&#39;inoculation sur la monocouche de cellule respectif pour chaque système de virus. Comme le montre la figure 1, les deux ABSC et PUG sont apparus pour interagir avec les virions exempts de cellules, ce qui entraîne des effets irréversibles qui protégeaient la monocouche de cellules à partir de l&#39;infection ultérieure. Les deux composés d&#39;essai réalisé un près de 100% d&#39;inhibition contre le HCMV, le VHC et DENV-2, alors qu&#39;un 60 - bloc 80% a été observée contre MV et RSV. Ces résultats SuggEst ce que l&#39;ABSC et PUG ont un impact direct sur ces particules virales libres en les neutralisant l&#39;inactivation et leur infectivité. Dans la figure 2, l&#39;attachement et d&#39;entrée / essais de fusion ont été réalisées pour étudier l&#39;effet de l&#39;ABSC et PUG contre ces événements virales précoces liées entrée-de HCMV, VHC, DENV-2, MV, et RSV. Les deux CHLA et PUG efficacement empêché liaison des virus étudiés sur la cellule hôte respective comme indiqué par l&#39;inhibition de l&#39;infection virale résultante (Figure 2, «attachement»: barres gris clair). L&#39;effet inhibiteur sur l&#39;attachement du virus par les deux composés était semblable contre HCMV (figure 2B), le VHC (figure 2C), DENV-2 (figure 2D), et RSV (Figure 2F), allant de 90 - 100%. D&#39;autre part, PUG semblait être plus efficace que l&#39;ABSC contre MV liaison (Figure 2E), le taux de la tw d&#39;inhibitioncomposés o variant entre 50 - 80%. L&#39;héparine de traitement de commande, qui est connu pour bloquer l&#39;entrée de nombreux virus, aussi inhibé la fixation de HCMV, DENV-2, RSV, annonce MV, mais est moins efficace contre le VHC. Le suivi &#39;essai entrée / fusion virale&#39; examiner si CHLA et PUG ont conservé leur activité au cours de la phase entrée du virus / fusion (Figure 2, &#39;Entrée / Fusion &quot;: barres gris foncé). Encore une fois, les deux ABSC et PUG ont été observés à altérer efficacement l&#39;étape d&#39;entrée / de fusion virale des virus examinés (Figure 2B - F), ce qui donne un 50 - effet protecteur de 90% sur la monocouche de cellule respectif. Héparine aussi puissamment inhibé entrée / fusion dans DENV-2 et les infections à VRS, mais était moins efficace contre le HCMV, le VHC et MV (&lt;40% d&#39;inhibition en moyenne). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Virus </td><td> Type de cellule </td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;td&gt; HEL </td></tr><tr><td> VHC </td><td> Huh-7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td> Vero </td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Hôte type de cellule à une infection virale du type de cellule utilisé pour chaque système d&#39;infection virale décrit dans les résultats représentatifs est indiquée. Des détails supplémentaires concernant les cellules peuvent être trouvés dans la référence 31. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;inactivation des infections virales par les composés de test CHLA et PUG Différents virus ont été traités avec les composés d&#39;essai pendant une longue période. (Incubé pendant 1,5 à 3 h avant le titrage; barres gris clair) ou une période courte (dilué immédiatement; gris foncé bars) à 37 ° C avant une dilution de concentration sub-thérapeutiquetion et l&#39;analyse ultérieure de l&#39;infection sur les cellules hôtes respectives. (A) Schéma de l&#39;expérience (montré sur la gauche) avec la concentration de virus final (PFU / puits ou MOI), à long terme période virus médicament incubation (i), et le temps d&#39;incubation subséquente (ii) indiqué pour chaque virus dans le tableau sur la droite. Les analyses de (B) de HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) de RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les résultats sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif DMSO pour infection par le virus ainsi que les données représentées sont les moyennes ± l&#39;erreur-type de la moyenne (SEM) à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;évaluation des activités antivirales de composés d&#39;essai ABSC et PUG contre l&#39;attachement du virus et l&#39;entrée / fusion. (A) Le mode opératoire expérimental, la concentration en virus (PFU / puits ou MOI), et le moment de l&#39;addition et le traitement avec les composés d&#39;essai (i, ii, iii) sont présentés pour chaque virus dans les schémas et les tableaux associés. Dans l&#39;analyse de fixation de virus (barres gris clair), des monocouches de différents types de cellules ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 heure, puis co-traités avec les virus respectifs et les composés d&#39;essai à 4 ° C (1,5 - 3 h, i) avant de rincer les inoculats et les composés d&#39;essai à une incubation ultérieure (37 ° C, ii) et de l&#39;examen de l&#39;infection par le virus. Dans l&#39;entrée du virus / analyse de fusion (barres gris foncé), des monocouches de cellules ensemencées ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 h et ensuite provoqués avec chacun des virus à 4 ° C pendant 1,5 - 3 h (i). Les cellules ont ensuitelavé et traité avec des composés d&#39;essai pendant une période d&#39;incubation supplémentaire (ii) au cours de laquelle la température a été décalé à 37 ° C pour faciliter l&#39;événement d&#39;entrée / fusion virale. A la fin de l&#39;incubation, les virus extracellulaires ont été retirés soit par un tampon citrate (pH 3,0) ou lavages au PBS et les cellules ont été encore incubées (iii) pour l&#39;analyse d&#39;une infection par virus. Résultats pour (B) HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les données sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif de DMSO infection par le virus et sont présentées comme moyenne ± SEM à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ici, nous présentons un protocole qui examine des étapes spécifiques de l’entrée virale afin d’identifier et d’évaluer de nouveaux agents antiviraux.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer l'effet antiviral de composés testés contre des étapes spécifiques de l'entrée virale précoce. Cela est réalisé en premier lieu en semant les cellules hôtes destinées à l'infection virale. La deuxième étape consiste à effectuer l'infection virale et les traitements par les composés testés à différents moments et à différentes températures.Ensuite, les inoculums traités au médicament sont éliminés par lavage et les cellules sont recouvertes de milieu basal. La dernière étape consiste à incuber les cellules. En fin de compte, l'infectiosité virale est analysée afin de déterminer l'influence des composés testés sur les premières étapes d'entrée virale de l'infection.Par exemple, un luminomètre est utilisé pour évaluer l'activité de la luciférase dans l'extrait cellulaire provenant d'une infection par un virus rapporteur. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut permettre une approche plus fondée sur les mécanismes pour identifier des agents antiviraux, en particulier ceux ciblant l'entrée virale. Pour commencer, préparez tout d'abord des solutions mères des composés à tester, l'acide trilogie ou CHLA et le collagène punique ou PUG, dans du DMSO, et dissolvez l'héparine, utilisée comme témoin positif, dans de l'eau doublement distillée stérile afin de préparer les cellules hôtes pour le culture d'analyse.Des cellules de carcinome hépatique humain, HUH 7.5, incubées toute la nuit dans du DMEM frais supplémenté en FBS et en antibiotiques. Veillez à respecter les procédures de niveau de biosécurité 2 tout au long de l'expérience afin d'évaluer la cytotoxicité des composés testés. Traitez les cellules avec des concentrations croissantes de CHLA ou de PUG, allant de zéro à 500 micromolaire, diluées dans un milieu basal, ou avec 1 % de DMSO comme témoin négatif, puis incubez les cellules pendant 72 heures à 37 degrés Celsius dans une étuve à culture cellulaire.Retirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de réactif de dosage XT T et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Puis utilisez un lecteur de microplaques pour déterminer l'absorbance à 492 nanomètres avec une longueur d'onde de référence à 690 nanomètres.Calculez le pourcentage de viabilité à l’aide d’une formule donnée à partir de ces valeurs. Déterminez les concentrations de cytotoxicité cellulaire 50 % pour chaque composé. Commencez l’essai d’inactivation virale.Première plaque, une fois 10 à la puissance quatre cellules par puits. Dans une plaque de 96 puits, incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit pour l'attachement en vue de l'infection. Préparer les particules de virus de l'hépatite C, ou VHC, marquées par un rapporteur luciférase Gaia, comme indiqué dans le protocole du texte.Dans un tube stérile, mélanger 100 microlitres de CHLA ou de PUG à 100 micromolaire avec 100 microlitres de 10 à la puissance 4 unités formant des foyers, ou FFU, du VHC pour un mélange témoin positif. VHC avec de l'héparine à une concentration finale de 1000 microgrammes par millilitre.Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après trois heures, diluer le mélange du composé viral 50 fois avec 9,8 millilitres de milieu basal à température ambiante. Préparer ensuite un nouveau mélange du composé viral, puis diluer immédiatement ce mélange dans du milieu basal pour l'échantillon d'incubation à zéro heure.Après avoir retiré le milieu d'incubation des cellules, ajoutez 100 microlitres de la solution diluée du médicament antiviral par puits, en triplicata. La solution contient maintenant 10 à la puissance 2 FFU par puits ; incubez à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures afin de permettre l'infection virale des cellules. Après l'incubation, retirez la suspension virale des puits et lavez délicatement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS.Incuber les cellules dans 100 microlitres de milieu basal pendant 72 heures afin de permettre la réplication virale et le relargage du rapporteur luciférase dans le surnageant. Ensuite, recueillir le surnageant des cultures et des microtubes, puis centrifuger à 17 000 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Pour éliminer les débris cellulaires, mélanger 20 microlitres de chaque surnageant avec 50 microlitres du réactif d'essai de luciférase gaussi et mesurer la luminescence provenant de l'activité du rapporteur luciférase à l'aide d'un luminomètre.Suivre les instructions du fabricant pour la plaque d'essai d'attachement viral : une fois dix puissance quatre cellules par puits. Dans une plaque de 96 puits, incuber toute la nuit pour permettre l'attachement cellulaire, puis le lendemain matin, refroidir d'abord la plaque de 96 puits contenant la monocouche cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.Préparez les composés d'essai et le mélange de virus sur de la glace. Par exemple, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1 %DMSO ou des solutions de contrôle positif HCV Héparine avec 10 à la puissance 2 FFU de virus. Pour chaque traitement, aspirez délicatement le milieu des puits de culture cellulaire.Ensuite, ajoutez immédiatement 100 microlitres du mélange de composé testant le virus dans des puits en triple, en prenant soin de ne pas augmenter la température. Incubez la plaque dans un réfrigérateur maintenu à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Les particules virales s'attacheront à la surface des cellules à quatre degrés Celsius, mais ne seront pas internalisées.Ensuite, aspirez les surnageants. Lavez doucement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS glacé, ajoutez 100 microlitres de milieu basal dans chaque puits, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 72 heures.Enfin, pour quantifier la libération du rapporteur luciférase à partir des cellules infectées. Recueillir le surnageant de chaque puits d'échantillon et réaliser le dosage de la luciférase de Gaussian pour évaluer la fusion et l'entrée virales. Prérefroidir la plaque de culture cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.Après l'incubation nocturne pour l'attachement des cellules, retirez le milieu existant des puits et infectez les cellules avec 10 à la puissance deux F-F-U-H-C-V sur de la glace. Incubez la plaque à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lavez délicatement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS glacé pour éliminer le virus non adherent.Ensuite, sur glace, traitez les cellules avec les composés testés dissous dans le milieu basal ou dans le milieu basal contenant 1 % de DMSO comme témoin, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Cette étape permet d'évaluer l'effet des composés testés sur l'entrée virale, qui se produit à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu et lavez deux fois les virus non internalisés avec 200 microlitres de tampon citrate ou de PBS.Ajouter 100 µL de milieu basal par puits et incuber à 37 °C pendant encore 72 heures. Recueillir le surnageant et effectuer le dosage de la luciférase Gaussian comme indiqué précédemment pour détecter le rapporteur luciférase libéré. Voici les effets des composés testés sur le VHC. Lors de l'activation, le virus a été incubé avec les composés testés pendant zéro ou trois heures avant l'infection.Le pourcentage d'inhibition de l'infection virale est représenté pour chaque traitement. Le DMSO, témoin négatif, ne montre aucune inhibition. Le CHLA présente une forte inhibition au moment du contact, après une incubation de zéro heure, ainsi qu'après une incubation plus longue de trois heures.Résultats supplémentaires avec un autre test. Le composé PUG est présenté ici, en adaptant ce dispositif expérimental général, CHLA et PUG sont montrés comme inhibant également l'infectiosité du cytomégalovirus humain ou HCMV dans des fibroblastes pulmonaires embryonnaires. L'effet de CHLA et de PUG sur l'attachement du VHC est présenté ici.Rappelons que les cellules ont été incubées avec le virus en présence ou en l'absence des composés test à quatre degrés Celsius, puis, après élimination des cellules ayant capté le virus, les cellules ont été incubées à 37 degrés Celsius pour permettre l'infection par le virus. Les barres ombrées illustrent l'effet du C-H-L-A-P-U-G ou de l'héparine sur l'entrée du VHC dans les cellules. Remarquez que, dans ce cas, l'attachement viral a d'abord été réalisé à quatre degrés Celsius.Ensuite, après élimination du virus non lié, les cellules ont été incubées avec les composés testés à 37 degrés Celsius pour l'entrée virale. De même, dans le cas du CMVH, l'infection de fibroblastes pulmonaires embryonnaires traités avec du CHLA ou du PUG montre une forte inhibition de l'attachement viral et de l'entrée virale. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer les étapes à la température indiquée, ce qui influencera la précision des résultats.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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