Early Viral entrée dosages pour l'identification et l'évaluation des composés antiviraux

L’objectif global de cette procédure est de déterminer l’effet antiviral des composés testés contre des étapes spécifiques de l’entrée virale précoce. Pour ce faire, il faut d’abord ensemencer les cellules hôtes de l’infection virale. La deuxième étape consiste à effectuer l’infection virale et les traitements composés d’essai à différents moments et températures.

Ensuite, les inoculums traités par le médicament sont éliminés et les cellules sont recouvertes d’un milieu basal. La dernière étape consiste à incuber les cellules. En fin de compte, l’infectiosité virale est analysée pour déterminer l’influence des composés testés sur les premières étapes d’entrée virale de l’infection virale.

Par exemple, un luminomètre est utilisé pour évaluer l’activité de la luciférase dans le snat cellulaire à partir d’une infection par un virus rapporteur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut permettre une approche plus basée sur les mécanismes dans l’identification des agents antiviraux, en particulier ceux ciblant l’entrée virale. Pour commencer, préparez d’abord des solutions mères des composés d’essai, de l’acide trilogie ou CHLA et du collagène PUNIC ou PUG dans de l’héparine dissoute DMSO pour un contrôle positif dans de l’eau stérile doublement distillée afin de préparer les cellules hôtes pour la culture d’essai.

Carcinome hépato humain, HUH 7,5 cellules pendant la nuit dans du DMAM frais complété par FBS et antibiotiques. N’oubliez pas de suivre les procédures de niveau de biosécurité deux tout au long de l’expérience pour tester la cytotoxicité des composés testés. Traitez les cellules avec des concentrations croissantes de CHLA ou de PUG de zéro à 500 micromolaires diluées dans un milieu basal, ou 1 % de DMSO comme contrôle négatif, puis incubez les cellules pendant 72 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire.

Retirez le milieu et lavez deux fois les cellules avec 200 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de réactif de dosage XT T et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, à l’aide d’un lecteur de microplaques, déterminez l’absorbance à 492 nanomètres avec une longueur d’onde de référence à 690 nanomètres.

Calculez le pourcentage de viabilité à l’aide d’une formule donnée à partir de ces valeurs. Déterminer les concentrations de cytotoxicité cellulaire de 50 % pour chaque composé. Pour commencer l’essai d’inactivation virale.

Première plaque, une fois 10 à la quatrième cellules par puits. Dans une plaque de 96 puits, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit pour la fixation à l’infection. Préparez le rapporteur Gaia luciférase marqué virus de l’hépatite C ou particules du VHC comme indiqué dans le protocole de texte.

Dans un tube stérile, mélangez 100 microlitres de 100 micromolaires, CHLA ou PUG avec 100 microlitres de 10 puissance quatre. Unités de formage de focalisation ou FFU de HCV pour un mélange de contrôle positif. VHC avec héparine à une concentration finale de 1000 microgrammes par millilitre.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après trois heures, diluez le mélange de composés viraux 50 fois avec 9,8 millilitres de milieu de base à température ambiante. Préparez ensuite un nouveau mélange de composés viraux et diluez immédiatement ce mélange dans un milieu de base pour l’échantillon d’incubation de l’heure zéro.

Après avoir retiré le milieu d’incubation des cellules, ajoutez 100 microlitres de la solution médicamenteuse virale diluée par puits en trois exemplaires. La solution contient maintenant 10 à 10 FFU par puits incuber une température de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures pour permettre l’infection virale des cellules. Après l’incubation, retirez la suspension virale des puits et lavez doucement les cellules avec 200 microlitres de PBS. Deux fois.

Incuber les cellules dans 100 microlitres de milieu basal pendant 72 heures pour la réplication virale et la libération de la luciférase rapporteure dans le surnageant. Ensuite, collectez le supernat des cultures et des microtubes et centrifugez-le à 17 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour éliminer les débris cellulaires, mélangez 20 microlitres de chaque supernat avec 50 microlitres de réactif de dosage de la luciférase gaussi, et mesurez la luminescence de l’activité du rapporteur de la luciférase dans un luminomètre.

Selon les instructions du fabricant pour la plaque de test de fixation virale, un fois 10 à la quatrième cellule par puits. Dans une plaque de 96 puits et incuber toute la nuit pour la fixation de la cellule le lendemain matin. Tout d’abord, refroidissez la plaque à 96 puits contenant la monocouche cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Préparez les composés d’essai et le mélange de virus sur de la glace. Par exemple, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1 % DMSO ou solutions d’héparine HCV témoin positif avec 10 au deuxième virus FFU. Pour chaque traitement, aspirez doucement le milieu des puits de culture cellulaire.

Ensuite, ajoutez immédiatement 100 microlitres de mélange de composés de test de virus dans des puits en trois exemplaires, en prenant soin de ne pas augmenter la température. Incuber la plaque dans un réfrigérateur maintenu à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Les particules virales se fixeront sur le service cellulaire à quatre degrés Celsius, mais ne seront pas internalisées.

Ensuite, aspirez les surnageants. Lavez doucement les cellules deux fois avec 200 microlitres de glacé. PBS ajoute 100 microlitres de milieu de base dans chaque puits, puis incube à 37 degrés Celsius pendant 72 heures.

Enfin, pour quantifier le rapporteur de la luciférase libérée des cellules infectées. Prélevez le supernat de chaque échantillon et effectuez le test de luciférase gaussienne pour mesurer la fusion virale et l’entrée. Pré-refroidissez la plaque de culture cellulaire à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation d’une nuit pour la fixation des cellules, retirez le milieu existant des puits et infectez les cellules avec 10 à la seconde F-F-U-H-C-V sur de la glace. Incuber l’assiette à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lavez doucement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS glacé pour éliminer le virus non adhérent

Ensuite, sur de la glace, traitez les cellules avec les composés d’essai dissous dans le milieu basal ou le milieu basal avec 1 % de DMSO comme témoin et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Cela permet d’évaluer les composés d’essai lors de l’entrée virale, qui se produit à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu et lavez deux fois les virus non internalisés avec 200 microlitres de tampon de citrate ou PBS.

Ajoutez 100 microlitres de milieu de base par puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant encore 72 heures. Prélever le supernat et effectuer le dosage de la luciférase gaussienne comme démontré précédemment pour détecter le rapporteur de luciférase libéré illustré Voici les effets des composés testés sur le VHC. Lors de l’activation, le virus a été incubé avec les composés d’essai pendant zéro ou trois heures avant l’infection.

Le pourcentage d’inhibition de l’infection virale est tracé pour chaque traitement. Le DMSO contrôlé négativement ne montre aucune inhibition. L’ALCH présente une inhibition élevée au contact, après une incubation de zéro heure, ainsi qu’après une incubation plus longue de trois heures.

Résultats supplémentaires avec un autre test. Il est démontré que le PUG composé est présenté ici, en adaptant ce plan d’expérience général, le CHLA et le PUG inhibent en outre l’infectiosité du cytomégalovirus humain ou HCMV dans les fibroblastes pulmonaires embryonnaires. L’effet de l’ABCH et du PUG sur l’attachement au VHC est illustré ici.

Rappelons que les cellules ont été incubées avec le virus en présence ou en l’absence des composés d’essai à quatre degrés Celsius, puis que les cellules virales non liées ont été incubées à 37 degrés Celsius pour être infectées par le virus. Les barres ombragées montrent l’effet du C-H-L-A-P-U-G ou de l’héparine sur l’entrée du VHC dans les cellules. Notons que dans ce cas, la fixation virale a d’abord été réalisée à quatre degrés Celsius.

Ensuite, après avoir retiré le virus non lié, les cellules ont été incubées avec des composés d’essai à 37 degrés Celsius pour l’entrée virale. De même, dans le cas du VHM, le traitement de l’infection des fibroblastes pulmonaires embryonnaires par CHLA ou PUG montre une forte inhibition de l’attachement viral et de l’entrée virale. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer les étapes à la température indiquée, ce qui influencera la précision des résultats.