Name: Décrypter et de limagerie et la pathogenèse de Cording Mycobacterium abscessus Dans embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez l'imagerie en fluorescence pour étudier la virulence de Mycobacterium abscessus et ses interactions avec le système immunitaire inné chez les embryons de poissons zèbres.

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Les auteurs sont reconnaissants à K. Kissa pour des discussions utiles et pour fournir lipo-clodronate et L. Ramakrishnan pour le don généreux de pTEC27 et pTEC15 qui permettent l&#39;expression de tdTomato et Wasabi, respectivement. Ce travail fait partie des projets de l&#39;Agence Nationale de la Recherche française (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 et DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) et septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7-PEOPLE-2011-ITN) en vertu de convention de subvention aucune. PITN-GA-2011-289209 pour le Marie-Curie de formation initiale Réseau FishForPharma. Nous tenons également à remercier l&#39;Association Gregory Lemarchal et Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) pour le financement CM Dupont.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le poisson zèbre a récemment émergé comme un excellent système de modèle vertébré pour étudier la dynamique de l&#39;infection bactérienne utilisant large champ et imagerie confocale en temps réel 36. La combinaison de suspensions mycobactériennes dispersées (protocole 2.2) ainsi que les méthodes de micro-injection (protocole 4) permet infections reproductibles systémiques, et le suivi ultérieur et la visualisation de la progression de l&#39;infection avec un accent particulier sur les interactions bactérienn...

Mycobacterium abscessus est un pathogène émergent qui provoque une large gamme de syndromes cliniques chez l&#39;homme. Ceux-ci comprennent les infections cutanées ainsi que des infections pulmonaires chroniques sévères, principalement rencontrées dans immunodéprimés et chez les patients atteints de fibrose kystique 1,2,3,4. M. abscessus est également considéré comme l&#39;un des principaux espèces de mycobactéries à croissance rapide responsables des infections nosocomiales et iatrogènes chez les humains. En outre, plusieurs rapports récents ont mis en évidence la possibilité que M. abscessus pourrait traverser la barrière hémato-encéphalique et induire des lésions importantes dans le système nerveux central (SNC) 5,6. En dépit d&#39;être un producteur rapide, M. expositions abscessus aussi plusieurs fonctionnalités pathogènes qui sont liés à ceux de Mycobacterium tuberculosis, y compris la capacité de garder le silence pendant des années au sein des structures granulomateuses et de générer des lésions dans les poumons caséeuses 7. Plus inquiétante est le faible sensibilité de M. abscessus aux antibiotiques, ce qui rend ces infections extrêmement difficile à traiter conduisant à un taux d&#39;échec thérapeutique significatif 8,9. La menace importante de cette espèce est principalement sa résistance intrinsèque à des antibiotiques, ce qui est une préoccupation majeure dans les établissements 10 de santé publique et d&#39;une contre-indication à la transplantation pulmonaire 11. M. de les écrans lisses (S) ou rugueuses morphotypes (R) de la colonie qui mènent à différents résultats cliniques. A la différence de la souche S, R bactéries ont tendance à croître de bout en bout, ce qui conduit à une corde ou un cordon structure semblable à 12,13. Plusieurs études indépendantes basées sur des modèles cellulaires ou animaux soit révélé le phénotype hyper-virulence de la R morphotype 14,15. Des études épidémiologiques, les cas les plus graves de M. infections pulmonaires abscessus semblent être associés avec des variantes R 16 qui sont la seule variantea vu persister pendant des années dans un hôte infecté 3. La différence de morphotype repose sur la présence (en S) ou perte (en R) de glycopeptidolipides de surface associée (GPL) 12. Toutefois, en raison des limites inhérentes aux modèles cellulaires / animales actuellement disponibles utilisés pour étudier M. infection abscessus, nos connaissances concernant les événements physiopathologiques des variantes de R ou S reste obscure. L&#39;infection des souris immuno-compétentes par voie intraveineuse ou en aérosol conduit à la colonisation transitoire, d&#39;empêcher l&#39;utilisation de souris pour étudier les infections persistantes et pour vivo tests de sensibilité dans la drogue 17. Par conséquent, le développement de modèles animaux qui se prêtent à la manipulation de la réponse de l&#39;hôte est un défi majeur. Dans ce contexte, les modèles non-mammifères d&#39;infection ont été récemment mis au point, y compris Drosophila melanogaster 18 qui offre plusieurs avantages tels que le coût, la rapidité et l&#39;acceptabilité éthique oVer le modèle de la souris. Le modèle de poisson zèbre (Danio rerio) de l&#39;infection a également été explorée de visualiser, par imagerie non invasive, la progression et la chronologie de M. abscessus infection chez un animal en direct 19. Surtout, une preuve de concept a également été établi pour démontrer son aptitude pour les évaluations antibiotiques in vivo contre M. abscessus 17,20. Le poisson zèbre ont été largement utilisés au cours des deux dernières décennies pour étudier les interactions entre les différents agents pathogènes et le système immunitaire de l&#39;hôte 21. Le succès croissant de ce modèle vertébré alternatif repose sur les opportunités majeurs et uniques qui ont motivé et validés son utilisation pour une meilleure compréhension de nombreuses infections virales et bactériennes 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Contrairement à la plupart des autres modèles animaux, embryons de poisson zèbre sont optiquement transparent, ce qui permet l&#39;imagerie de fluorescence non invasive 30. Cette has conduit à étudier M. abscessus infecté embryons de poisson zèbre avec des détails sans précédent, culminant avec la description de Cording extracellulaire, qui représentent un exemple de plasticité morphologique bactérienne. Cording représente un nouveau mécanisme de subversion du système immunitaire et un mécanisme essentiel dans la promotion pathogenèse de M. aiguë infection abscessus 19. Ce rapport décrit les nouveaux outils et les méthodes utilisant l&#39;embryon de poisson zèbre à déchiffrer les traits physiopathologiques de M. abscessus infection et d&#39;étudier les interactions intimes entre le bacille et le système immunitaire inné. Tout d&#39;abord, la micro-injection d&#39;un protocole détaillé qui comprend le traitement de l&#39;inoculum bactérien, la préparation de l&#39;embryon, et l&#39;infection en soi, est présentée. Méthodes spécifiquement adaptés pour évaluer M. virulence abscessus par la mesure de différents paramètres, tels que la survie de l&#39;hôte et de la charge bactérienne, sont présentés. Une attention particulière est donnée sur la façonà surveiller, à un niveau spatio-temporel, et le sort progression de l&#39;infection et la réponse immunitaire de l&#39;hôte à M. abscessus par microscopie vidéo. En outre, pour enquêter sur la contribution et le rôle des macrophages lors de M. abscessus infection, les méthodes pour générer des macrophages-appauvri embryons (en utilisant des approches soit génétiquement ou chimiquement base-) sont décrites. Enfin, les protocoles de visualiser les interactions spécifiques avec les macrophages ou les neutrophiles en utilisant soit des embryons fixes ou vivant sont documentés. Le but de ce rapport est de stimuler de nouvelles études pour jeter une lumière nouvelle sur M. les mécanismes de virulence abscessus et notamment le rôle de Cording dans la mise en place d&#39;un processus d&#39;infection aiguë et incontrôlée.

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD Biosciences</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>Catalase de foie de bovin</td>.<td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Delta Microscopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319244</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sels de mer instantanés de mer&nbsp ;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté&nbsp ;</td><td>Instrument Sutter Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1 mm D.E. X 0,78 mm D.I.</td></tr><tr><td>Dispositif d’extraction de micropipettes&nbsp ;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td></td><td>Extracteur de micropipette flamme/marron P-87</td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Tritech Research&nbsp ;</td><td></td><td>Micro-injecteur numérique, pince à épiler MINJ-D</td></tr><tr><td></td><td>Sciences Tools inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pointes de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de cording<em&gt; mycobacterium abscessus</em&gt; dans embryons de poissons zèbres

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) sont de plus en plus utilisés comme modèle d’infection pour étudier la fonction du système immunitaire inné des vertébrés dans les interactions hôte-pathogène. La facilité d’obtention d’un grand nombre d’embryons, leur accessibilité due au développement externe, leur transparence optique ainsi que la disponibilité d’une large panoplie d’outils génétiques/immunologiques et de collections de lignées rapporteures transgéniques, À cet égard, le présent manuscrit décrit l’utilisation du poisson-zèbre comme système modèle in vivo pour étudier la chronologie de l’infection à Mycobacterium abscessus. Cet agent pathogène humain peut exister sous forme lisse (S) ou rugueuse (R), selon la composition de la paroi cellulaire, et leur virulence respective peut être imagée et comparée chez les embryons et les larves de poisson-zèbre. La micro-injection de variants fluorescents S ou R directement dans la circulation sanguine via la veine caudale entraîne des infections chroniques ou aiguës/mortelles, respectivement. Ce système biologique permet la visualisation et l’analyse à haute résolution du rôle des cordons mycobactériens dans la promotion de la formation d’abcès. De plus, l’utilisation de bactéries fluorescentes ainsi que de lignées de poissons-zèbres transgéniques hébergeant des macrophages fluorescents offre une occasion unique d’imagerie multicolore des interactions hôte-pathogène. Cet article décrit des protocoles détaillés pour la préparation d’un inoculum homogène de M. abscessus et pour l’injection intraveineuse d’embryons de poisson-zèbre pour l’imagerie ultérieure par fluorescence de l’interaction avec les macrophages. Ces techniques ouvrent la voie à de futures recherches impliquant des mutants défectueux dans la formation de la moelle épinière et visent à comprendre comment cela affecte la pathogénicité de M. abscessus chez un vertébré entier.

Bien que différents sites anatomiques peuvent être injectés 32, les injections de veine caudale sont souvent utilisés pour générer une infection systémique pour les analyses ultérieures, y compris les expériences de survie, la détermination de la charge bactérienne, une activité de phagocytose ou la formation du cordon. Les injections dans les muscles de la queue sont utilisés pour évaluer le recrutement des macrophages au site d&#39;injection (figure 3A). Pour étudier et de comparer la virul...

Les embryons de poisson-zèbre optiquement transparents sont largement utilisés pour étudier et visualiser en temps réel les interactions entre les micro-organismes pathogènes et les cellules immunitaires innées. La micro-injection de Mycobacterium abscessus, combinée à l’imagerie par fluorescence, est utilisée pour examiner les caractéristiques pathogènes essentielles telles que la formation de la moelle épinière chez les embryons de poisson-zèbre.

Décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de Cording<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier et de comparer la virulence de souches de Mycobacterium abscessus et de décrire les interactions entre ces bactéries et le système immunitaire inné de l'hôte in vivo à l'aide d'embryons de poisson zèbre transparents. Cela est réalisé en préparant tout d'abord une inoculum bactérien homogène. Ensuite, les embryons sont injectés par voie intraveineuse avec les suspensions bactériennes à 30 heures post-fécondation.En outre, afin d'étudier plus précisément le rôle des macrophages dans le contrôle de l'infection, une procédure d'injection basée sur des lipocholates est utilisée pour générer des embryons dépourvus de macrophages. Enfin, les embryons infectés sont préparés et observés par microscopie à fluorescence et microscopie confocale afin de suivre l'évolution de l'infection. En définitive, les résultats obtenus permettent de visualiser les interactions spécifiques entre les cellules phagocytaires fluorescentes et M. abscessus, soit sous forme de bâtonnets isolés, soit sous forme de cordons serpentinés à l'intérieur d'un embryon transparent.Le principal avantage de l'utilisation du poisson zèbre par rapport à d'autres modèles anima

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