Décrypter et de l'imagerie et la pathogenèse de Cording Mycobacterium abscessus Dans embryons de poissons zèbres

L’objectif général de cette procédure est d’étudier et de comparer la virulence des souches de Mycobacterium abscessus et de décrire les interactions entre ces bactéries et le système immunitaire inné de l’hôte in vivo en utilisant des embryons de poisson-zèbre transparents. Pour ce faire, il faut d’abord préparer une membrane oculaire bactérienne homogène. Ensuite, les embryons sont injectés par voie intraveineuse avec les suspensions bactériennes 30 heures après la fécondation.

De plus, pour étudier plus précisément le rôle des macrophages dans le contrôle de l’infection, une procédure d’injection basée sur le lipo choate est utilisée pour générer des embryons appauvris en macrophages. Enfin, les embryons infectés sont préparés et imagés à l’aide de la fluorescence et de la microscopie confocale pour surveiller la progression de l’infection. En fin de compte, les résultats qui peuvent être obtenus montrent les interactions spécifiques entre les cellules phagocytaires fluorescentes et M abscessus, soit sous forme de basi individuels, soit sous forme de cordons serpentins à l’intérieur d’un embryon transparent.

Le principal avantage de l’utilisation du poisson zèbre par rapport à d’autres modèles animaux comme les souris est qu’il permet d’étudier spécifiquement le processus d’infection en temps réel et d’étudier une image des interactions spécifiques entre les abcès de microbactéries et les microphages ou les neutrophiles. Cette étape est un problème critique pour la pression d’injection ultérieure chez le poisson-zèbre. En raison de la forte propension de Mycobacterium abscessus rugueux à former de gros agrégats et à produire des codes, un traitement spécifique est donc nécessaire pour préparer un inoculaire homogène et quantitativement contrôlé avant la microinjection.

Pour préparer l’abcès inoculaire, la récolte inoculaire fait croître de manière exponentielle les cultures à partir de flacons de culture tissulaire de 150 centimètres carrés dans des tubes en plastique stériles de 50 millilitres et centrifuge à 4 000 fois G et à température ambiante pendant 15 minutes. Utilisez un millilitre de Middlebrook seven H nine, complété par l’enrichissement OADC, plus tween 80 ci-après appelé sept H neuf milieu pour remettre en suspension la pastille et Eloqua. 200 microlitres de suspensions bactériennes dans des tubes de 1,5 millilitre avec une aiguille de calibre 26 homogénéisent chaque quad ALI de suspension bactérienne 15 fois.

Ensuite, à l’aide d’un bain-marie, le sonicate sonicate, trois fois pendant 10 secondes, chacune avec des pauses de dix secondes. Entre les deux, ajoutez un millilitre de sept H neuf, moyen et brièvement vortex, puis centrifugez à 100 fois G pendant trois minutes. Prélevez soigneusement les mycobactéries contenant des surnageants pour éviter les amas et tirez les suspensions homogènes dans un tube en plastique stérile de 50 millilitres.

Centrifugez la suspension à 4 000 fois G pendant cinq minutes et utilisez 200 microlitres de sept milieux H neuf pour remettre la pastille en suspension et évaluer l’inoculum bactérien final. Selon le protocole de texte, la démonstration visuelle de cette méthode, elle est critique car les étapes sont difficiles à apprendre car la manipulation douce et précise de l’injection dans les embryons de poisson-zèbre au microscope ainsi que l’acquisition de la technique de micro-injection ont nécessité du temps pour effectuer la micro-injection de M abscessus à environ 24 heures. Après la fécondation ou HPF, utilisez une pince à épiler pour enrober les embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et les maintenir à 28,5 degrés Celsius.

Transférez 30 à 48 embryons HPF dans une chambre de positionnement en forme de V remplie de 25 millilitres d’eau de poisson contenant 270 milligrammes par litre de trica avec une pointe de micro-chargeur coupée. Disposez correctement les embryons dans les canaux pour faciliter la manipulation. Utilisez du PBST avec 0,05 % entre 80 pour diluer l’inoculum microbactérien jusqu’à l’UFC souhaitée à délivrer et incluez 10 % de rouge de phénol pour vérifier la bonne injection avec un embout de microchargeur.

Chargez une aiguille de micro-injection avec cinq à 10 microlitres d’inoculum bactérien. Connectez l’aiguille de micro-injection dans le support d’un micromanipulateur connecté à l’injecteur et utilisez une pince à épiler fine pour casser le haut de l’aiguille. Pour obtenir un diamètre d’ouverture de cinq à 10 micromètres.

Calibrez le volume d’injection en ajustant la pression et le temps de micro-injection. Ensuite, pour obtenir le volume d’injection requis, mesurez le diamètre d’une gouttelette expulsée dans le jaune d’un embryon à micro-injecter dans la veine du cajole. Positionnez l’embryon avec la face ventrale face face à l’aiguille et placez la pointe de l’aiguille près de l’ouverture urogénitale.

Et enfoncez doucement la pointe de l’aiguille dans l’embryon jusqu’à ce qu’elle perce juste la région de la veine du carpolot. Ensuite, délivrez le volume souhaité de suspension bactérienne, généralement un à trois nanolitres contenant environ 100 UFC par nanolitre. Incuber et surveiller les embryons selon le protocole textuel pour effectuer la lipo Choate, la déplétion des macrophages et des embryons à 24 HP. Destin, les embryons, et les transférer dans un bol d’injection rempli d’eau de poisson avec trica.

Ensuite, orientez-les dorsale vers le bas. Après avoir vortex la solution de clodronate encapsulée dans des liposomes, chargez l’aiguille microcapillaire et calibrez le volume d’injection. Percez la région de la veine du cajola comme démontré précédemment, et injectez deux à trois litres de solution.

Répétez l’injection trois fois. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius et utiliser la microscopie à fluorescence pour contrôler l’appauvrissement des macrophages avant l’infection. Comme démontré précédemment dans cette vidéo, il faut énumérer les unités formant des colonies ou UFC au moment souhaité.

Prélevez cinq embryons par infection et transférez chaque embryon dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Cryo-anesthésie les embryons par incubation sur glace pendant 10 minutes après euthanasie des embryons avec 300 à 500 milligrammes par litre. Trica. Utilisez de l’eau stérile pour laver les embryons deux fois dans un nouveau tube.

Ensuite, après avoir retiré de l’eau à 2 % Triton X 100 dans un XPBS à chaque embryon, utilisez une aiguille de calibre 26 pour homogénéiser le tissu pour une lyse complète. Après avoir centrifugé la suspension, utilisez un X-P-B-S-T pour remettre le granulé en suspension. Puis dilution en série sur plaque de l’homogène sur Middlebrook sept H 10 OADC.

Complété par B-B-L-M-G-I-T Panta incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant quatre jours avant de compter les colonies pour l’imagerie en direct de l’infection à M abscessus, montez des embryons anesthésiés à 1 % de point de fusion bas dans une boîte de Pétri à fond de verre de 35 millimètres pour un microscope inversé ou une lame de dépression à cavité unique pour la microscopie confocale verticale. Orientez l’embryon à la position souhaitée et couvrez les aros solidifiés avec de l’eau de poisson contenant des trica pour une imagerie fixe de l’infection à M abscessus. Après avoir euthanasié les embryons, transférez-les dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre et fixez les embryons dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % dans un X-P-B-S-T pendant deux heures.

A température ambiante, retirer le paraforme aldéhyde en lavant les embryons deux fois avec un X-P-B-S-T pendant 10 minutes pour préserver l’intégrité des tissus et la fluorescence successivement. Incuber les embryons dans des concentrations croissantes de solution de glycérol pendant 10 minutes par condition. Déposer l’embryon incrusté dans 50 % de glycérol dans une chambre d’observation.

Enfin, utilisez un microscope à fluorescence avec un objectif 10 x ou un microscope confocal à fluorescence avec des objectifs 40 x ou 63 x pour l’acquisition séquentielle de fluorescence et l’imagerie en transmission de l’embryon. Pour étudier et comparer la virulence des variants rugueux et lisses de M abscessus, des bactéries fluorescentes ont été injectées par voie intraveineuse dans 30 embryons maîtrisant le HPFC. Contrairement à la variante lisse, la variante rugueuse induit une infection plus robuste et mortelle avec le développement d’abcès dans le système nerveux central.

Les différences de virulence ont été quantifiées soit en énumérant les UFC, soit en déterminant le nombre de pixels fluorescents qui sont corrélés. Comme le montre cette figure, la cinétique de formation du cordon peut être surveillée et imagée par vidéomicroscopie de manière non invasive, démontrant la propension de la variante rugueuse à se répliquer extracellulairement, comme le montre ici. L’infection d’embryons appauvris en macrophages par l’abcès rugueux de M entraîne une augmentation massive des charges bactériennes et de la production de moelle épinière, ainsi qu’une mort larvaire rapide.

Cela indique clairement que les macrophages sont nécessaires pour contrôler l’infection à M abscessus afin d’observer en temps réel les interactions entre les macrophages et M abscessus. La lignée transgénique de cerise EG one M qui produit des macrophages fluorescents rouges peut être utilisée. Les infections induisent un recrutement marqué de macrophages avec une phagocytose efficace des bactéries individuelles, tandis que les cordons mycobactériens représentent une stratégie évoluée par les abcès pour éviter d’être phagocytés après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à l’exploration du rôle important du codage en tant que nouveau mécanisme d’évasion immunitaire. Grâce à la taupe d’infection du poisson-zèbre, il devient désormais possible d’observer et de décrire la contribution in vivo des codes dans la pathogenèse des abcès de mycobacterium.