Préparation de mitochondriales fractions enrichies pour métabolique Analyse en

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des fractions mitochondriales enrichies contenant suffisamment de métabolites mitochondriaux pour des études métabolomiques utilisant drosophila melanogaster. Cette étape est réalisée en élevant d'abord un nombre suffisant de mouches afin de produire assez de métabolites pour les fractions enrichies en mitochondries. Dans un deuxième temps, les mouches sont homogénéisées à l'aide d'un homogénéisateur en verre à piston en téflon, ce qui permet de rompre la membrane cellulaire sans endommager l'intégrité mitochondriale.

Ensuite, les homogénats sont soumis à une centrifugation différentielle afin d'obtenir des échantillons enrichis en mitochondries. Les résultats montrent que des modifications métaboliques mitochondriales marquées ont été détectées à l'aide de ce protocole, modifications qui n'avaient pas été observées lors d'analyses métabolomiques basées uniquement sur des fractions enrichies en mitochondries ou des extraits d'animaux entiers. Le principal avantage de cette procédure par rapport à une analyse métabolomique réalisée sur des mouches entières est que l'isolement des mitochondries avant l'analyse métabolomique permet une sensibilité accrue et une détection améliorée des variations des métabolites mitochondriaux.

Pour commencer l'expérience, chauffez les ingrédients de la nourriture pour mouches sur une plaque chauffante à 90 degrés Celsius. Remuez le mélange régulièrement jusqu'à ce qu'il devienne homogène et légèrement dense. Retirez la nourriture de la source de chaleur et remuez-la occasionnellement lorsque la température descend à 80 degrés Celsius, puis ajoutez du TE decept méthyl 4-hydroxybenzoate à 0,2 % dissous dans de l'éthanol à 95 %. Ensuite, divisez la nourriture en deux volumes égaux.

Veillez à ce que la température de la nourriture ait diminué jusqu'à 50 degrés Celsius, puis ajoutez en remuant 1,1 millilitre de rapamycine à 50 millimolaire dissoute dans l'éthanol dans un premier volume et 1,1 millilitre d'éthanol non traité dans un second volume. Pour collecter les adultes, utilisez un régulateur à un seul étage afin d'acheminer du dioxyde de carbone pur à partir d'une bouteille haute pression. Avec un débit continu de cinq PS, j'évite l'électricité statique en utilisant un tube en plastique pour acheminer le dioxyde de carbone vers un ballon filtrant de 500 millilitres équipé d'un tuyau permettant de faire barboter le dioxyde de carbone à travers l'eau.

Pour ce faire, utilisez un bouchon en caoutchouc à un trou pour sceller le flacon. Reliez un tube en plastique à l'orifice latéral du flacon et à un tampon de dioxyde de carbone afin de contrôler la densité larvaire pendant le développement. Placez 25 couples de parents dans un flacon de culture et laissez-les pondre des œufs pendant 48 heures.

Ensuite, retirez les parents pour réguler la densité des œufs et répétez ces étapes en utilisant la descendance F1 émergente afin d'obtenir deux générations de ce contrôle de densité. Après deux générations en conditions de densité contrôlée, séparez les mouches par sexe, en les plaçant sur le coussin pendant pas plus de 10 à 15 minutes. Laissez les mouches se remettre de l'anesthésie pendant 24 heures avant de les placer dans les conditions expérimentales.

Attribuez 300 mouches par échantillon afin de produire suffisamment de métabolites pour les fractions enrichies en mitochondries. Transférez 150 mouches dans une cage maison d’un litre. Ensuite, transférez les 150 mouches restantes dans une cage séparée d’un litre et n’entassez pas les cages avec plus de 150 mouches.

Utilisez six échantillons répliqués par condition expérimentale et placez les cages à 25 degrés Celsius dans un cycle lumineux de 12 heures d’obscurité pour terminer l’élevage des drosophiles. Fournissez aux mouches de la nourriture fraîche tous les deux ou trois jours dans un flacon contenant cinq millilitres de nourriture afin de maintenir la qualité de la nourriture pendant une durée totale de 10 jours. Commencez l’isolement en versant les mouches d’une cage dans un homogénéisateur en verre et téflon rempli d’un millilitre de tampon d’isolement glacé.

Ensuite, placez un peu de mortier sur de la glace pour maintenir les mitochondries intactes et homogénéisez les mouches en effectuant 15 allers-retours. En prenant soin de ne pas tourner le pilon, transférez l'homogénénat dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez le tube à 300 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un tube différent et centrifugez le surnageant à 6 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d'enrichir les mitochondries.

Après la centrifugation, éliminer le surnageant contenant la fraction cytosolique. Resuspendre le culot dans 300 microlitres de tampon de lavage en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Répéter doucement les étapes précédentes pour la deuxième cage gyroscopique.

Ensuite, combiner les culots re-suspendus des deux cages dans un tube de microcentrifugeuse cryogénique et centrifuger les culots combinés à 6 000 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Jeter le surnageant et congeler rapidement le culot dans de l'azote liquide. Enfin, conserver les fractions enrichies en mitochondries à −80 °C.

Cette immunotransfert de type western montre un enrichissement de la protéine membranaire mitochondriale de transport poin, qui sert d'indicateur de la séparation efficace des mitochondries dans les fractions mitochondriales. La protéine poin est indétectable dans les fractions cytosoliques, tandis que la protéine tubuline, une protéine cytosolique des microtubules, n'est pas détectée dans la fraction mitochondriale, ce qui démontre une contamination minimale par des protéines cytosoliques. Les analyses des composantes principales, ou ACP, ont été réalisées à partir des valeurs obtenues par spectrométrie de masse, normalisées selon la concentration en protéines déterminée par la méthode de Bradford, transformées en logarithme et amputées des valeurs minimales observées pour chaque composé.

Les graphiques ACP ont été générés à l'aide du métabolite complet. Les profils provenant de souches natives et altérées de mouches permettent de comparer les différents métabolites de l'ADN mitochondrial obtenus avec un extrait standard de la mouche entière à un graphique ACP des métabolites présents dans des extraits enrichis en mitochondries. Les profils métaboliques de la mouche entière se séparent le long de l'axe PC2 et reflètent les effets principaux du traitement par la rapamycine. Il existe uniquement de légères différences entre les génotypes alternatifs de l'ADNmt.

En revanche, les profils de métabolites provenant des extraits enrichis en mitochondries montrent une séparation entre le génotype natif d'ADNmt sur aliment normal et les trois autres échantillons, l'ADNmt natif sous rapamycine, et l'ADNmt alternatif sur aliment normal ou sous rapamycine. Cela implique que l'effet de l'ADNmt alternatif modifie les profils de métabolites d'une manière analogue aux effets du traitement à la rapamycine. Lors de la réalisation de ce protocole, il est important, il est recommandé de réaliser toutes les manipulations le même jour, afin de réduire la variabilité entre les réplicats.

Je recommanderai d'élaborer un plan à l'avance, d'étiqueter les vials et de tenir un suivi des enregistrements d'attente entre les réplicats afin d'améliorer la qualité de notre préparation des échantillons.