Name: Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez la microscopie BiFC-PALM pour visualiser les interactions protéiques à l'échelle nanométrique dans les cellules U2OS. Cette technique sensible permet d'étudier les voies de signalisation oncogéniques.

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Les auteurs remercient les Drs Steven Chu et Joe W. Gray pour leurs discussions utiles, Henry Marr pour son travail initial sur le projet BiFC-PALM, et Alexis Shoemaker pour son assistance technique. Ce travail est soutenu par des fonds de démarrage versés à X.N. par OHSU. La recherche dans le laboratoire Nan a également été soutenue par le NIH 5U54CA143836-05, la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer, le M. J. Murdock Charitable Trust et la société FEI.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

BiFC est une technique couramment utilisée pour détecter et visualiser les cellules dans les IPP, alors que PALM est une technique de microscopie récent seule molécule à hyper-résolution nanométrique qui permet l&#39;imagerie d&#39;échantillons biologiques intacts. La combinaison de BiFC avec PALM atteint imagerie sélective des IPP dans une cellule avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule. BiFC-PALM étend l&#39;utilité de ces deux techniques, et comme l&#39;a démontré dans ce travail, est...

Interactions protéine-protéine (IPP) sont fondamentales pour la biologie 1 et sont strictement réglementés par des mécanismes spatio-temporelles dans de nombreuses échelles de temps et de longueur. Des études sur la signalisation sur la membrane cellulaire cellule, par exemple, ont mis en évidence des compartiments spatiales dynamiques, à l&#39;échelle nanométrique qui facilitent IPP processus cellulaires spécifiques et 2. Par conséquent, la capacité de sonder IPP dans les systèmes biologiques avec des résolutions suffisantes spatiales et temporelles, haute spécificité et une sensibilité élevée est essentielle pour parvenir à une compréhension des mécanismes de la biologie. Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) est l&#39;un des rares outils existants pour visualiser IPP dans une cellule avec une résolution subcellulaire et la compatibilité des cellules vivantes 3 ​​- 5. La technique est relativement simple et implique le fractionnement d&#39;une protéine de fluorescence en deux fragments non fluorescents; lorsque génétiquement marqués à deux protéines interagissant etamené à proximité, les fragments peuvent reconstituer pour former une protéine fluorescente complet, ce qui donne le signal fluorescent. Lorsqu&#39;il est correctement conçu, sondes BiFC ne devraient pas reconstituer spontanément en l&#39;absence des IPP. En tant que tel, le signal de fluorescence dans un essai BiFC ne se posera que dans la présence d&#39;IPP, ce qui permet la visualisation directe des IPP avec une spécificité élevée. Les avantages supplémentaires de l&#39;utilisation de la fluorescence que la lecture sont une haute sensibilité, une résolution subcellulaire, et la compatibilité avec un débit élevé et contenu dosages élevés de dépistage, entre autres. Pour ces avantages, un certain nombre de sondes BiFC basés sur différentes protéines fluorescentes parent ont été développés. Comme dans toutes les autres techniques de détection basées sur la microscopie optique classique, cependant, la résolution spatiale est limitée à BiFC ~ 250 nm par la diffraction de la lumière. Cela en fait un défi pour étudier la régulation des IPP à l&#39;échelle nanométrique, qui, comme évoqué plus haut et illustré par des radeaux lipidiques 6 unee nanoclusters Ras 7, est une échelle de longueur essentielle à la compréhension de nombreux processus cellulaires tels que la signalisation. BiFC a été combinée avec Microscopie Palm (PALM) 8,9 à surmonter cette limite de résolution spatiale pour former une image 10 IPP. PALM est une technique de microscopie à hyper-résolution récente qui contourne la limite de diffraction dans l&#39;imagerie de fluorescence par l&#39;activation et la localisation stochastique subdiffractive de molécules fluorescentes simples. Dans chaque cycle d&#39;activation, une molécule fluorescente émet de quelques centaines à quelques milliers de photons et donnent lieu à une seule image molécule sur le détecteur. Bien que cette image est limité par diffraction (~ 250 nm de large), son centre de gravité peut être déterminée avec une précision beaucoup plus élevée, typiquement de l&#39;ordre de 10 à 50 nm en fonction du nombre de photons détectés. En activant et la localisation de chaque molécule fluorescente dans l&#39;échantillon, une image haute résolution peut être reconstruit. Performed sur les cellules vivantes, seule molécule de suivi (SMT) PALM permet en outre l&#39;acquisition de milliers de trajectoires de diffusion de la protéine d&#39;une cellule unique 11. Surtout, PALM utilise des sondes fluorescentes spécialisées telles que les protéines fluorescentes photoactivables (PA-MF) pour obtenir l&#39;activation stochastique. Depuis deux BiFC et des protéines fluorescentes utilisation PALM, ils ont été combinés en fractionnant PAmCherry1, un PA-FP couramment utilisé pour PALM, en deux fragments entre les acides aminés 159 et 160. Le système basé sur PAmCherry1 BiFC partagé affiche faible signal de fond à partir de la reconstitution spontanée des deux fragments. Lorsque génétiquement marqués à une paire de protéines en interaction, les deux fragments (RN = 1 à 159 résidus de distillation; RC = Met + résidus 160-236) reconstitué de manière efficace pour former des protéines complètes PAmCherry1 même à 37 ° C et sans incubation à des températures plus basses, ce qui est pas le cas pour d&#39;autres paires BiFC 12 comme le parent mCherry 13. Furthermore, la protéine de PAmCherry1 reconstitué conservé les propriétés photophysiques du PAmCherry1 mère, comme rapport de contraste élevé, rendement photonique moyen et photoactivation rapide, entre autres, qui sont essentiels pour la précision de localisation de la molécule unique et PALM imagerie à haute résolution. Dans ce protocole, l&#39;utilisation de BiFC-PALM pour imager interactions Ras-Raf dans des cellules en utilisant U2OS scission PAmCherry1 (figure 1A) est décrite. La première étape consiste à concevoir des constructions pour l&#39;expression de protéines de fusion entre des fragments PAmCherry1 (c.-à-RN et RC) et les protéines d&#39;intérêt. En théorie, pour chaque paire de protéines candidates (A et B), il y a huit paires de protéines de fusion à tester: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; et A-RC / B-RN. Ce processus peut souvent être simplifié en prenant en compte les propriétés structurales ou biochimiques des protéines candidates. Dans le cas de Ras, la protéine estmodifiée après traduction à la boîte CAAX C-terminal (C = Cys; A = aliphatique; X = y en a), après quoi le motif de AAX est clivé. Par conséquent, RN ou RC ne peuvent être fusionnés à l&#39;extrémité N-terminale de Ras; ce qui réduit le nombre de paires de protéines de fusion à quatre (figure 1B). Pour Raf, le domaine Ras-contraignant (RBD; résidus 51-131) sont utilisées et peuvent être étiquetés à chaque extrémité. Ces quatre configurations de fusion ont été générés: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; et RC-KRAS / Raf RBD-RN. En outre, l&#39;agent de liaison entre les fragments et les protéines d&#39;intérêt devra prendre en compte. Un lieur flexible d&#39;environ dix acides aminés est souvent utilisé car il offre une liberté suffisante pour la complémentation de se produire. Une telle liaison est (GGGGS) x2, mais il ya beaucoup d&#39;autres qui ont été appliquées avec succès, y compris des séquences aléatoires générées à partir d&#39;un site de clonage multiple (MCS) 14. La longueur des segments de liaison peut avoir besoin d&#39;être optimisé depending sur la taille des protéines d&#39;intérêt et leurs orientations lors de l&#39;interaction. Les fragments de PAmCherry1 sont contenues dans une petite épine dorsale de clonage avec accompagnement PMM (voir liste des matières). Les gènes d&#39;intérêt peut être inséré via les sites de restriction ou avec un procédé de ligature indépendante. Après vérification de la séquence et le clonage, la cassette d&#39;expression est transféré dans un vecteur d&#39;expression en utilisant une réaction de recombinase, un procédé de clonage avec une grande fidélité et une grande efficacité. Ensuite, les constructions d&#39;expression résultants sont transfectés dans la lignée cellulaire cible ou, si une lignée cellulaire stable est souhaitée, conditionné dans des lentivirus pour infecter la lignée cellulaire cible. Transfection transitoire permet de valider rapidement les configurations BiFC, mais les problèmes potentiels doit être noté. Transfection en utilisant des produits chimiques souvent souligne les cellules, entraînant une forte auto-fluorescence; tandis que l&#39;utilisation totale de la fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopy peut atténuer ce signal de fond en limitant le volume de l&#39;éclairage, la FRBR idéal lorsque les IPP ont lieu sur la membrane cellulaire. En outre, des transfections transitoires conduisent souvent à des niveaux élevés d&#39;expression de protéines, dépassant de loin celles des protéines endogènes, qui peuvent causer des artefacts à détecter les IPP. Par conséquent, il est recommandé que les lignées cellulaires stables sont établies après une configuration BiFC appropriée a été déterminée par l&#39;essai initial. Des lignées cellulaires stables ont également le potentiel pour l&#39;expression accordable par induction 15 doxycycline. Après l&#39;infection, les cellules sont sélectionnées avec des antibiotiques, typiquement la puromycine et à la néomycine, une pour chaque construction. Les étapes suivantes de préparation de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de l&#39;image, et l&#39;analyse des données vont être décrits en détail dans les protocoles. Avec cette approche, la formation de grappes à l&#39;échelle nanométrique en images BiFC-paume de Ras-Raf RBD sont régulièrement observé (figure 2A &lt;/ strong&gt;). Constamment, les trajectoires SMT-paume de Ras-Raf RBD montrent une distribution hétérogène dans les Etats de diffusion (figure 2B-D). Ces résultats suggèrent que les complexes de Ras-Raf existent dans de multiples états sur la membrane cellulaire, probablement en tant que monomères et des grappes, avec des conséquences biologiques potentiels. Ce travail démontre la puissance de BiFC-PALM en imagerie sélective des IPP dans les cellules avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule, ce qui serait difficile à obtenir avec BiFC conventionnelle, la fluorescence co-localisation, ou le transfert d&#39;énergie de résonance de fluorescence (FRET). Lors de la conception des expériences BiFC et interpréter les résultats, il est important de garder à l&#39;esprit que le processus est irréversible BiFC dans la plupart des cas, y compris PAmCherry1 scission. Une fois que les deux fragments se combinent et forment une protéine de PAmCherry1 complet, la liaison entre les deux fragments, et donc l&#39;IPP devient permanente. Ceci limite l&#39;utilisation de BiFC et BiFC-PALM pour la surveillance de la dynamique des IPP (c.-à-cinétique de liaison et pas la dynamique de diffusion du complexe protéique fois qu&#39;il est formé) et parfois pourrait même conduire à une mauvaise localisation des complexes de PPI. Un autre facteur à considérer lors de la conception des expériences BiFC-Palm est le retard dans la maturation chromophore qui est inhérente à des protéines fluorescentes. Une fois que deux protéines interagissent et les fragments de PF se réunissent, ils replient généralement de l&#39;ordre de secondes (à mi-temps de 60 sec pour EYFP 3). Toutefois, après maturation chromophore fluorescent et se développent sur le signal de l&#39;ordre de minutes. Alors que la fluorescence peut être détectable dans les 10 min après reconstitution du split-Vénus, une variante rapide pliage YFP, la mi-temps pour la maturation en général est souvent autour de 60 min 16. Split-PAmCherry1 a été observé que des taux similaires. Par conséquent, BiFC et BiFC-PALM sont des choix actuellement pauvres pour le suivi cinétique de PPI en temps réel; autre methodes, comme FRET et une dimérisation récemment développé la protéine fluorescente dépendante 17, peut être plus adapté à cet effet.

<table><tbody><tr><td>Cadre de microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X Objectif TIRF à immersion dans l’huile avec 1,49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm miroir</td> <td>dichroïqueSemrock</td><td>&nbsp ; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 561 nm</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm Filtre coupe-bande</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Température et CO2 étage contrôlé</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/</td></tr> <tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Réactif de transfection</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1.5 Cellules</td></tr><tr><td>U2OS Cellules</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avec rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>L-15 de Leibovit, sans rouge de phénol</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Sérum réduit medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Tamponné Saline</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Seringue filtre</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur lentiviral</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur rétroviral</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>culture 10 cm parabole</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>plaque de culture 6 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycin</td></tr><tr><td>Doxycyline</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Base</td> <td>TrisFisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm particules d’or</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midiprep</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges de 0,6 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à fond rond en polypropylène de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à fond rond en polypropylène de 14 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tube PCR</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Cellules compétentes</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoactivés localisation microscopie avec bimoléculaire complémentation de fluorescence (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Les interactions protéine-protéine (IPP) sont des événements moléculaires clés pour la biologie. Cependant, il reste difficile de visualiser les IPP avec une résolution et une sensibilité suffisantes dans les cellules, car la résolution de la microscopie optique conventionnelle est limitée par la diffraction à ~250 nm. En combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM), les IPP peuvent être visualisés dans des cellules avec une sensibilité à une molécule unique et une résolution spatiale nanométrique. BiFC est une technique couramment utilisée pour visualiser les IPP avec contraste de fluorescence, qui implique la division d’une protéine fluorescente en deux fragments non fluorescents. PALM est une technique récente de microscopie à superrésolution pour l’imagerie d’échantillons biologiques à l’échelle nanométrique et à l’échelle d’une molécule unique, qui utilise des sondes fluorescentes phototransformables telles que les protéines fluorescentes photoactivables (PA-FP). BiFC-PALM a été démontré en divisant PAmCherry1, un PA-FP compatible avec PALM, pour sa nature monomère, sa bonne luminosité de molécule unique, son rapport de contraste élevé et son utilité pour les mesures de stœchiométrie. Lorsqu’il est divisé entre les acides aminés 159 et 160, PAmCherry1 peut être transformé en une sonde BiFC qui se reconstitue efficacement à 37 °C avec une spécificité élevée aux IPP et une faible reconstitution non spécifique. L’interaction Ras-Raf est utilisée comme exemple pour montrer comment BiFC-PALM aide à sonder les interactions à l’échelle nanométrique et avec une résolution de molécule unique. Leur diffusion peut également être suivie dans des cellules vivantes à l’aide du suivi de molécule unique (smt-) PALM. Dans ce protocole, les facteurs à prendre en compte lors de la conception des protéines de fusion pour BiFC-PALM sont discutés, la préparation des échantillons, l’acquisition d’images et les étapes d’analyse des données sont expliquées, et quelques résultats exemplaires sont présentés. Offrant une résolution spatiale, une spécificité et une sensibilité élevées, BiFC-PALM est un outil utile pour étudier les IPP dans des échantillons biologiques intacts.

L&#39;exemple BiFC-PALM est montré KRAS mutant G12D interagir avec les Ras domaine de liaison (RBD) du CRAF (figure 1A). Comme on le verra, le RN ou fragments sont marqués RC à l&#39;extrémité C-terminale de Ras, car il perturberait la localisation membranaire et donc l&#39;activité biologique de Ras. Cela réduit les combinaisons possibles de huit à quatre (figure 1B). Chacune de ces quatre combinaisons a été introduit dans des cellules en utilisant U2OS infection lentivirale. Les cellu...

Les interactions protéine-protéine sont visualisées dans les cellules avec une résolution spatiale nanométrique en combinant la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) avec la microscopie de localisation photoactivée (PALM). L’utilisation de BiFC-PALM pour l’imagerie des interactions Ras-Raf dans les cellules U2OS permet de visualiser le regroupement à l’échelle nanométrique et la diffusion de complexes Ras-Raf individuels.

Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

L'objectif général de cette technique de microscopie est de visualiser les protéines et leurs interactions à l'échelle de la molécule unique et du nanomètre. Cette méthode peut donc nous aider à répondre à certaines questions fondamentales en biologie, telles que les interactions moléculaires impliquées dans les processus de signalisation oncogénique. Le principal avantage de cette technique réside dans sa sensibilité, sa spécificité et sa capacité à offrir une résolution à l'échelle de la molécule unique et du nanomètre.Le Dr. Tahan, chercheur associé senior dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Après clonage des fragments RAs et RAF R-B-D-P-A-M Cherry un, emballage dans des particules virales et infection des cellules U2 OS selon le protocole décrit, préparez un échantillon pour la microscopie en plaçant environ 5,5 × 10⁴ cellules exprimant de façon stable par puits dans une lame à fond de verre à huit puits, avec 350 µL de DMEM sans rouge de phénol. Utilisez du paraformaldéhyde frais avec du glutaraldéhyde pour fixer les cellules, puis, après remplacement du fixateur par du PBS ou un tampon d’imagerie, vortexez des particules d’or de 100 nanomètres et ajoutez 35 µL par puits afin de suivre la dérive de la platine pendant l’imagerie.Approchez-vous du microscope et allumez les lasers de 405 et 561 nanomètres en gardant les obturateurs fermés pour l'instant ; assurez-vous que le miroir dichroïque de 561 nanomètres et le filtre réjecteur sont en place. Ouvrez le logiciel d'acquisition d'images. Activez la caméra E-M-C-C-D et laissez-la refroidir, puis réglez le temps d'exposition sur 100 millisecondes et le gain E-M-C-C-D à une valeur appropriée.Ajouter de l'huile à immersion à l'objectif et fixer l'échantillon sur la platine du microscope. Ensuite, à l'aide du champ clair ou du laser de 561 nanomètres, mettre l'échantillon au point pour l'imagerie des RA et d'autres protéines membranaires. Utiliser un objectif APO chromat turf 60 x avec une ouverture numérique de 1,49 et configurer le microscope en mode turf.Réglez le laser d'excitation de manière à ce qu'il soit décentré lorsqu'il atteint l'ouverture arrière de l'objectif en turf, ce qui provoquera une déviation du laser lorsqu'il atteindra le tampon de la lame. Continuez à ajuster la position d'incidence du laser jusqu'à ce que l'angle critique soit atteint et que le laser soit réfléchi en retour. Recherchez une cellule à imager présentant plusieurs particules d'or visibles.Ensuite, définir une région d’intérêt englobant la cellule ou une partie de celle-ci ainsi que les particules d’or, au cas où une activation suffisante se produirait déjà en raison de niveaux d’expression élevés. Commencer l’acquisition avec le laser de 405 nanomètres éteint et le laser de 561 allumé. Sinon, allumer le laser de 405 nanomètres au réglage de puissance minimal usine et l’augmenter progressivement jusqu’à ce qu’il y ait une dizaine de molécules par image, environ, de sorte que les molécules individuelles soient bien séparées.Pendant que l'acquisition de données se poursuit, augmentez progressivement la puissance du laser de 405 nanomètres afin de maintenir la densité des spots à peu près constante. Continuez l'acquisition d'images jusqu'à ce qu'une puissance élevée de 4 0 5 ne déclenche plus aucune activation.Les événements d'activation se terminent par le traitement des images. Téléchargez le logiciel de traitement d'image. Ouvrez MATLAB et chargez le logiciel de lecture WFI.Visualisez la séquence d'images brute et déterminez la région d'intérêt (ROI) en sélectionnant la zone de la pile à traiter en cliquant sur le bouton gauche et en traînant un cadre autour de la zone souhaitée. Si la région d'intérêt n'a pas été réduite lors de l'acquisition, sélectionnez une zone plus petite afin de réduire le temps de calcul ; pour désélectionner une zone et traiter l'ensemble du cadre, cliquez avec le bouton droit n'importe où dans l'image. Ensuite, définissez un ensemble de marqueurs fiduciaires, tels que des nanoparticules d'or absorbées sur la lame, bien isolées, uniformes en forme et présentes dans le champ de vision tout au long de la pile d'images. Commencez par sélectionner une nanoparticule d'or candidate en cliquant sur son image avec le bouton gauche et en traînant un petit cadre autour d'elle.Sous le suivi de particules, cliquez sur le bouton de trajectoire. Un graphique apparaîtra, montrant la position de la particule d'or sélectionnée à travers la pile d'images, illustrant l'ampleur de la dérive. Répétez ce processus pour suivre autant de particules d'or que possible et déterminez les particules qui suivent un trajet commun. Idéalement.La dérive globale est d'au plus 0,1 pixel, une à la fois. Sélectionnez les particules d'or qui ont été suivies ensemble et sous le suivi des particules. Cliquez sur le bouton ajouter un marqueur.Une croix verte apparaîtra, indiquant que la particule a été ajoutée en tant que marqueur et sera utilisée pour corriger la dérive. Ajustez la plage de lissage sigma et le seuil selon les besoins en modifiant légèrement la valeur. Cliquez sur le bouton « trouver la particule » pour tester les paramètres et inspecter visuellement les particules traitées : les molécules PAM cherry, par exemple, qui sont relativement rondes et brillantes seront encadrées, tandis que les autres seront exclues.Pour commencer le traitement des images, cliquez sur le bouton créer le fichier cord et enregistrez le fichier sous un nom souhaité afin de post-traiter les images et restituer l'image de la paume. Lancez le package palm dans MATLAB et chargez le fichier dot core qui vient d'être créé. Une image rendue grossièrement apparaîtra dans la fenêtre d'image à côté des boutons de contrôle.Triez les coordonnées individuelles en utilisant les valeurs typiques suivantes. Pour PAM Cherry un, le nombre d'images combinées est égal à huit. La distance de combinaison en nanomètres est égale à 100, la RMS minimale est égale à quatre.La qualité minimale d'ajustement est égale à 0,25 et l'excentricité maximale est égale à 1,4. Cliquez sur le bouton de tri pour générer un nouvel ensemble de coordonnées sélectionnées, prêtes à produire des images haute résolution. Saisissez des valeurs pour un rendu correct de l'image finale, comme la taille brute des pixels déterminée précédemment, ou la taille souhaitée des éléments dans l'image rendue, qui est généralement fixée à une valeur légèrement supérieure à la moyenne des localisations et à la taille des pixels, par exemple 10 nanomètres.Pour l'image rendue, cliquez sur le bouton de rendu pour générer l'image de la paume. Utilisez ensuite les icônes d'agrandissement plus et moins dans la barre d'outils de la fenêtre de la figure pour zoomer avant et arrière afin de suivre des molécules uniques dans des cellules vivantes. Traitez la surface de culture tissulaire et ensemencez les cellules comme décrit précédemment dans cette vidéo.Une fois les cellules traversées et tous les traitements et incubations nécessaires à l'expérience effectués, placez la boîte de culture sur un incubateur intégré au porte-objet. Laissez la boîte se stabiliser sur le porte-objet pendant quelques minutes, jusqu'à ce que la température et la concentration en CO₂ soient stables à cette étape. Bloquez les lasers.Si le contrôle du CO₂ n'est pas disponible, passez à un milieu indépendant du CO₂ juste avant l'acquisition d'images, comme le milieu de Leibovitz L-15, afin de réduire la fluorescence de fond. Ensuite, acquérez les images comme indiqué précédemment, en réglant un temps d'exposition approprié pour garantir un bon rapport signal sur bruit sans perdre en résolution temporelle. Le BFC palm représenté dans cette figure correspond au mutant KRAS G12D interagissant avec le domaine de liaison à RAS (RBD) de CRAF. Chacune des quatre combinaisons illustrées ici a été introduite dans des cellules U2OS par infection lentivirale. Deux des configurations ont produit de forts signaux positifs de BFC, identifiés par l'augmentation soudaine de la fluorescence lorsque le laser de 405 nanomètres a été activé, en raison de l'activation photo-induite du BFC reconstitué PAM Cherry un, comme démontré ici en utilisant les mêmes paramètres expérimentaux que pour le PAM Cherry un d'origine.Un signal BFC intense a été généré après infection avec RN R et RAF RBD RC. Ici, RN et RC désignent respectivement les fragments terminal n et terminal C de PAM Cherry un, lorsque l'on zoome sur des molécules individuelles, et leur distribution spatiale à l'échelle nanométrique peut être clairement observée dans cette expérience où le suivi individuel de molécules uniques par PALM a été réalisé afin d'obtenir les trajectoires de diffusion de chaque RA. Complexes RAF RBD sous éclairement continu avec des lasers de 561 nanomètres et 405 nanomètres. Molécules individuelles de PAM cherry un marquées.Allumez et restez actifs pendant quelques images avant d'entrer dans des états sombres où ils se sont révélés soit immobiles, soit mobiles. Ce tracé d'enregistrements pour plusieurs molécules illustre clairement les deux types de trajectoires. On peut déduire la même distribution hétérogène d'états de diffusion à partir de l'histogramme des déplacements moléculaires entre des images successives Mass mastered.Cette technique peut être réalisée en une à trois semaines, selon que les constructions sont exprimées de façon transitoire, transfectées ou de façon stable, si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préparer des témoins, tels que des mutants de Putins dépourvus d'interaction après cette procédure. D'autres méthodes, comme une analyse par regroupement, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment les interactions protéiques sont-elles organisées spatialement dans la cellule ?Pour le suivi cellulaire en laboratoire, en tant que base d'évaluation, un suivi de particules uniques peut être effectué afin de déterminer les états de diffusion et les probabilités de transition après son développement. Cette technique est utilisée dans notre laboratoire dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer les interactions induites par l'acide rétinoïque ainsi que l'homo- et l'oligomérisation des récepteurs de la famille Her dans les cellules tumorales humaines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de concevoir et de mettre en œuvre une approche de type « biopsy palm s » pour étudier une interaction protéique d'intérêt.N'oubliez pas que le travail avec des antiviraux et des cellules tumorales peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que les protocoles standard de sécurité biologique doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Bioingénierie

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Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Cette vidéo décrit BiFC-PALM ― une combinaison de microscopie de localisation photoactivée et de complémentation de fluorescence bimoléculaire ― pour évaluer les interactions protéine-protéine. BiFC implique la fusion de deux fragments de protéines fluorescentes avec deux protéines d’intérêt en interaction. Lorsque les deux protéines interagissent, les fragments sont rapprochés, ce qui permet aux deux parties de se réunir et de reconstituer une protéine fluorescente fonctionnelle. La...

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Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

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