Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

L’objectif global de cette technique de microscopie est de visualiser les interactions protéine, protéine à l’échelle de la molécule unique et du nanomètre. Cette méthode peut donc nous aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine de la biologie, telles que les interactions moléculaires dans les processus de signalisation oncogéniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est sensible, spécifique et qu’elle offre des résolutions de molécules uniques et nanométriques.

Après avoir cloné des fragments de RA et RAF R-B-D-P-A-M Cherry one s’empaquetant en particules virales et infectant les cellules U2 OS selon le protocole de texte. Pour préparer un échantillon pour l’imagerie, plaque d’environ 5,5 fois 10 à la quatrième cellules d’expression stable par puits d’une chambre à fond de verre à huit puits, glissez dans 350 microlitres de DMEM sans rouge de phénol. Utilisez du paraldéhyde frais avec du glutaraldéhyde pour fixer les cellules et après avoir remplacé le fixateur par du PBS ou un tampon d’imagerie, vortex de particules d’or de 100 nanomètres et ajoutez 35 microlitres par puits pour suivre la dérive de l’étage pendant l’imagerie.

Approchez-vous du microscope et allumez les lasers de 405 et 561 nanomètres en gardant les obturateurs fermés à ce stade, assurez-vous que le miroir dichroïque de 561 nanomètres et le filtre coupe-bande sont en place. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Allumez l’appareil photo E-M-C-C-D et laissez-le refroidir et réglez le temps d’exposition sur 100 millisecondes et le gain E-M-C-C-D sur une valeur appropriée.

Ajoutez de l’huile d’immersion dans l’objectif et fixez l’échantillon sur l’âge de la platine du microscope. Ensuite, avec le laser à fond clair ou à fond clair de 561 nanomètres, faites la mise au point de l’échantillon pour l’imagerie des AR et d’autres protéines membranaires. Utilisez un objectif de gazon chromat 60 x APO avec une ouverture numérique de 1,49 et mettez le microscope en configuration gazon.

Ajustez le laser d’excitation de manière à ce qu’il soit décentré lors de l’impact sur l’ouverture arrière de l’objectif de gazon, ce qui provoquera la déviation du laser lorsqu’il atteindra le tampon de glissement de couverture dans le visage. Continuez à ajuster la position d’incident du laser jusqu’à ce que l’angle critique soit atteint et que le laser soit réfléchi. Recherchez une cellule à imager avec plusieurs particules d’or en vue.

Définissez ensuite une région d’intérêt qui entoure la cellule ou une région de celle-ci et les particules d’or au cas où une activation suffisante se produirait déjà en raison de niveaux d’expression élevés. Commencez l’acquisition avec le laser de 405 nanomètres éteint et le laser 561 allumé. Sinon, allumez le laser de 405 nanomètres à la puissance d’usine la plus basse et augmentez-le progressivement jusqu’à ce qu’il y ait des dizaines de molécules par image ou que les molécules individuelles soient bien séparées.

Au fur et à mesure que l’acquisition de données se poursuit, augmentez progressivement la puissance laser de 405 nanomètres pour maintenir la densité du spot à peu près constante. Poursuivez l’acquisition d’images jusqu’à ce que la valeur soit élevée 4 0 5. Le pouvoir n’initie plus.

Les événements d’activation se terminent pour traiter les images. Téléchargez le logiciel de traitement d’image. Ouvrez MATLAB et chargez le logiciel de lecture WFI.

Affichez la séquence d’images brutes et déterminez la région d’intérêt ou le retour d’intérêt, sélectionnez la zone de la pile à traiter en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en faisant glisser une boîte autour de la zone souhaitée. Si la région d’intérêt n’a pas été réduite lors de l’acquisition, sélectionnez une zone plus petite pour réduire le temps de calcul pour désélectionner une zone et traiter l’ensemble de l’image avec le bouton droit de la souris Cliquez n’importe où dans l’image à côté de pour définir un ensemble de marqueurs fiduciaires tels que les nanoparticules d’or absorbées sur le lamelle qui sont bien isolées, uniformes et de forme et présentes dans le champ de vision tout au long de la pile d’images. Commencez par sélectionner une particule d’or candidate en faisant un clic gauche sur son image et en faisant glisser une petite boîte autour d’elle.

Sous Suivi des particules, cliquez sur le bouton Suivre. Un graphique s’affiche pour montrer la position de la particule d’or sélectionnée sur la pile d’images illustrant l’étendue de la dérive. Répétez ce processus pour suivre autant de particules d’or que possible et déterminer les particules qui suivent ensemble. Idéalement.

La dérive globale est de l’ordre de 0,1 pixel au maximum, un à la fois. Sélectionnez les particules d’or qui ont suivi ensemble et sous Suivi des particules. Cliquez sur le bouton Ajouter un marqueur.

Une croix verte apparaîtra signifiant que la particule a été ajoutée comme marqueur et sera utilisée pour corriger la dérive. Ajustez la plage sigma, la plage de lissage et le seuil si nécessaire en modifiant légèrement la valeur. Cliquez sur le bouton Trouver une particule pour tester les paramètres et inspecter visuellement les particules de processus telles que la cerise PAM : les molécules qui sont relativement rondes et brillantes seront mises en boîte et celles qui ne le sont pas seront laissées de côté.

Pour commencer le traitement des images, cliquez sur le bouton Créer un fichier de cordon et enregistrez le fichier sous le nom de votre choix pour post-traiter les images et afficher l’image de la paume. Lancez le package palm dans MATLAB, chargez le fichier dot core qui vient d’être créé. Une image rendue bien sûr apparaîtra dans la boîte d’image à côté des boutons de contrôle.

Triez les coordonnées individuelles à l’aide des valeurs typiques suivantes. Pour PAM Cherry un, la combinaison du cadre équivaut à huit. En combinant la distance en nanomètres, on obtient 100 RMS minimum, on obtient quatre.

La qualité minimale de l’ajustement est égale à 0,25 et l’excentricité maximale est égale à 1,4. Cliquez sur le bouton de tri pour générer un nouvel ensemble de coordonnées sélectionnées prêtes à être rendues en haute résolution. Entrez des valeurs pour un rendu correct de l’image finale, telles que la taille de pixel brute telle que précédemment déterminée la taille de caractéristique souhaitée dans l’image rendue, qui est normalement définie à une valeur légèrement supérieure à la localisation moyenne et à la taille de pixel telle que 10 nanomètres.

Pour l’image rendue, cliquez sur le bouton de rendu pour générer l’image de la paume. Utilisez ensuite les icônes de loupe plus et moins dans la barre d’outils de la fenêtre de la figure pour effectuer un zoom avant et arrière afin de suivre des molécules uniques dans des cellules vivantes. Traitez la surface de culture tissulaire et plaquez les cellules comme décrit précédemment dans cette vidéo.

Assurez-vous que le verre de protection a l’épaisseur appropriée pour la microscopie installée après avoir transecté les cellules et effectué tous les traitements et incubations nécessaires à l’expérience, placez la boîte de culture sur un incubateur sur scène. Laissez le plat reposer sur la scène pendant quelques minutes jusqu’à ce que la température et la concentration de CO2 se stabilisent à cette étape. Bloquez les lasers.

Si le contrôle du CO2 n’est pas disponible, passez à un milieu indépendant du CO2 juste avant que l’imagerie, comme le L 15 de Leibovitz pour réduire la fluorescence de fond, acquière enfin les images comme démontré précédemment, en réglant un temps d’exposition approprié pour assurer un bon rapport signal/bruit sans perdre la résolution temporelle. La paume BFC dans cette figure est le mutant KRAS G 12 D interagissant avec le domaine de liaison des RA ou RBD de CRAF. Chacune des quatre combinaisons montrées ici a été introduite dans des cellules U2 OS à l’aide de cellules d’infection lentivirale, deux des configurations ayant de forts signaux BFC positifs, comme identifié par l’augmentation abrupte de la fluorescence lorsque le laser de 405 nanomètres a été allumé en raison de la photo-activation de la reconstitution BFC de PAM Cherry one, comme démontré ici en utilisant les mêmes paramètres expérimentaux qu’avec le PAM Cherry parent.

Un fort signal BFC a été généré après l’infection par RN R et RAF RBD RC. Ici, RN et RC désignent respectivement les fragments terminaux n et C de PAM Cherry one lorsqu’ils sont zoomés sur des molécules individuelles et leur distribution spatiale à l’échelle nanométrique peut être clairement observée dans cette expérience où le suivi d’une seule molécule de palm a été effectué pour acquérir des trajectoires de diffusion de RA individuels. Complexes RBD de la RAF sous éclairage continu avec des lasers de 561 nanomètres et 405 nanomètres. Individuel PA m cerise une molécule st.

Allumez et tenez quelques images avant d’entrer dans des états sombres où elles se sont avérées soit immobiles, soit mobiles. Ce graphique d’enregistrements de plusieurs molécules illustre clairement les deux types de trajectoires. La même distribution hétérogène des états de diffusion peut être déduite de l’histogramme du déplacement des molécules entre les trames successives que la masse maîtrise.

Cette technique peut être réalisée en une à trois semaines, selon que les constructions sont transcendantes, transfectées ou opprimées de manière stable si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des contrôles tels que les Poutines mutants qui manquent d’interaction après cette procédure. D’autres méthodes, comme une analyse de cluster, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : comment les interactions protéiques sont-elles organisées spatialement dans la cellule ?

Pour le suivi des cellules de laboratoire, une base d’évaluation, un suivi de particules uniques peut être effectué pour déterminer les états de diffusion et les probabilités de transition après son développement. Cette technique est utilisée dans notre laboratoire dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer les interactions pulsionnelles de la PR ainsi que l’homo et la isation de ses récepteurs familiaux dans les cellules tumorales humaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et de mettre en œuvre une biopsie des paumes pour étudier une interaction protéique d’intérêt.

N’oubliez pas que travailler avec un antivirus et les cellules tumorales peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que les protocoles de sécurité biologique standard doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.