Utilisation de l'analyse confocale

L'objectif général de cette méthodologie est de visualiser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par un fluorophore dans un épithélium intact en utilisant une expression chez xip pos lavis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'établissement de gradients morphogénétiques, reconnus comme essentiels dans la spécification des lignées cellulaires durant le développement embryonnaire précoce. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une méthode simple pour visualiser la distribution des ligands dans un épithélium intact.

Une partie essentielle du protocole consiste à produire des ligands biologiquement actifs qui sont normalement traités et sécrétés, et capables d'induire une réponse dans les cellules receptrices, malgré l'attachement d'une étiquette fluorescente. La microscopie confocale constitue un moyen idéal pour étudier la localisation de protéines marquées fluorescentes au sein de tissus tridimensionnels ; l'utilisation de lasers et de détecteurs indépendants permet une analyse précise dans ces types de tissus complexes et facilite la collecte de données robustes. Après avoir produit l'ARNm codant pour les ligands marqués fluorescentes et obtenu des embryons XUS lavis selon le protocole écrit, injecter l'ARNm conjointement avec un traceur de lignage, tel que la RFP membranaire, dans une cellule unique au stade 16 à 32 cellules. Si désiré, un modulateur peut être co-injecté avec le ligand fluorescent et le marqueur de lignage afin d'analyser ses effets.

Parfois, il peut être utile d'injecter également une cellule voisine. Ici, une seconde cellule est injectée à proximité de la cellule précédemment injectée. Une cellule reçoit des ARNm codant pour le ligand marqué avec GFP et un traceur de lignée tel que la RFP membranaire, tandis que l'autre cellule reçoit des ARNm codant pour le modulateur et un traceur de lignée différent, tel que la céruléine membranaire. Transférez les embryons dans un incubateur réglé à 12,5 degrés Celsius et faites-les croître jusqu'au nouveau stade coop. Au stade Faber huit, le jour suivant, lorsque les embryons ont atteint le stade huit, remplissez des boîtes de Pétri recouvertes de 1 % d'aros avec du NAM deux et transférez les embryons à l’aide d’une pipette en verre coupée, en utilisant des aiguilles au tungstène.

Dissez l'expant circulaire à partir du pôle animal des embryons injectés et des embryons témoins, en prenant soin de ne pas inclure de mésoderme ; transférez l'expant animal dans des boîtes de Pétri de 55 millimètres, recouvertes de 1 % d'aros, et cultivez les embryons pendant quatre heures. Laissez maturer les protéines fluorescentes afin de produire un relief. Pour les lames, appliquez deux couches de ruban isolant en PVC sur les lames de microscope en les aplatissant complètement.

Découpez un rectangle de 14 par 10 millimètres dans le ruban adhésif pour monter les calottes animales. Ensuite, pipetez deux gouttes séparées de NM deux dans la lame creuse. Puis, à l’aide d’une pipette P 20 coupée, transférez jusqu’à 15 explants animaux sur chaque lame et, à l’aide de pinces, orientez les explants X de manière à ce que la face apicale soit dirigée vers le haut.

À l’aide d’un stylet en diamant, tracer un sillon sur un couvre-objet en verre et le casser pour obtenir un plus petit couvre-objet. Pour adapter le couvre-objet à la lame creuse, abaisser délicatement un couvre-objet en verre sur la lame creuse à l’aide d’une aiguille courbée de calibre 19, en comprimant la couche apicale des cellules du blastopore animal.

Utilisez du vernis à ongles pour sceller la lame à l’obscurité pendant 20 minutes et effectuez l’imagerie dans un délai de quatre à six heures. Pour garantir des calottes animales en bon état, les calottes animales doivent être correctement orientées dans les lames et les lamelles personnalisées, puis recouvertes délicatement. Déposez-les sur les lames en manipulant avec précaution.

Il est essentiel de ne pas utiliser trop de vernis à ongles pour sceller les lames, car cela provoquerait des plis dans le ruban et romprait ultérieurement l'étanchéité de la lame. Une fois maîtrisée, la technique nécessite d'injecter environ 25 embryons afin d'obtenir 20 bonnes calottes animales par condition d'intérêt. Celles-ci peuvent ensuite être analysées par microscopie confocale le lendemain.

Pour effectuer l'imagerie, utilisez un objectif de faible grossissement afin de localiser X explan. Puis passez à un objectif 63 x 1,4 à immersion dans l'huile pour une imagerie à plus haute résolution. Activez les lasers requis, notamment le 405 pour MIAN, le 488 pour GFP et le 561.

Pour le MRFP, optimisez les puissances laser de manière à détecter toutes les fluorochromes. Utilisez le réseau de 32 détecteurs tout en minimisant la tension et le gain nécessaires, puis sélectionnez le mode Lambda et activez les lasers à 405 nanomètres, 488 et 561 nanomètres. Pour obtenir un champ de vision plus large, zoomez sur l’image à 0,6 x.

Ensuite, régler la taille du cadre à la dimension d'image souhaitée. Cela fournit une résolution suffisante pour la moyenne des images, que l'on fixe entre quatre et huit afin d'augmenter le rapport signal sur bruit et d'optimiser le diaphragme pour ce jeu de données. Une unité de surface, selon le laser de 561 nanomètres, a été utilisée avec les longueurs d'onde 405, 488 et 561.

Les miroirs dichroïques collectent la lumière émise par la membrane Saru, la GFP et la membrane RFP. Dans cette expérience, la lumière a été collectée environ tous les 10 nanomètres, de 415 à 720 nanomètres. Réalisez l’analyse d’image selon le protocole décrit ici : il s’agit de la répartition de la sonic hedgehog marquée par la GFP dans un blastocyste d’animal X sous des conditions de contrôle ; la sonic hedgehog-GFP est sécrétée et diffuse en dehors de la région exprimant les ARNm injectés.

Cependant, en présence du modulateur, SULF un, Sonic Hedgehog GFP est plus restreint dans sa distribution. Et dans cet échantillon, seuls quelques foyers de Sonic Hedgehog GFP sont visibles à courte distance du clone de cellules qui le produit. Cette figure montre la caractérisation de deux ligands marqués par fluorescence injectés dans des cellules comme indiqué ici ; les deux, wind huit A et win 11 B-H-A-E-G-F-P, s'accumulent sur la membrane de cellules du blastopore animal, avec une accumulation plus efficace de wind huit A-H-A-E-G-F-P que de wind 11 B. Cette figure montre la distribution de wind huit A-H-A-E-G-F-P exprimé dans un clone de cellules marqué par la céruléine liée à la membrane.

On observe que le ligand marqué de manière fluorescente diffuse à partir des cellules sources vers les cellules environnantes de l'épithélium. Un logiciel d'analyse d'image est utilisé pour extraire des données sur la distribution des ligands wind marqués de manière fluorescente dans plusieurs échantillons expérimentaux, comme illustré ici. La distance par rapport au clone exprimant mem Saru et le niveau de fluorescence GFP sont mesurés afin de déterminer la portée de la diffusion du ligand wind et la forme du gradient.

Après avoir mesuré la distribution d'un ligand, la réponse d'une voie de signalisation peut également être évaluée en combinant ce protocole à un autre test permettant de surveiller la réponse des cellules receptrices. De cette manière, vous pouvez tenter de déterminer la plage seuil d'un morphogène.