Name: Utilisation de lanalyse confocale Xenopus laevis Chargé denquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez l'analyse confocale chez Xenopus laevis pour étudier la sécrétion et la diffusion de ligands fluorescents dans l'épithélium intact. Cette méthode permet d'explorer les modulateurs des gradients de morphogènes Wnt et Shh.

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Ce travail a été financé par un BBSRC accorder aux MdPE (BB / H010297 / 1), un quota de stagiaire de BBSRC SAR, et une bourse d&#39;études de la MRC au format SWF.

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<li>Muller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diffusivity+of+Nodal+and+Lefty+underlies+a+reaction-diffusion+patterning+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system.</a> Science. 336, 721-724 (2012).</li>
<li>Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+morphogen+gradient+forms+by+a+source-sink+mechanism+with+freely+diffusing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules.</a> Nature. 461, 533-536 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Une partie essentielle de ce protocole est de générer des ligands biologiquement actifs qui sont normalement traitées, sécrétés, et capables de déclencher une réponse dans la cellule réceptrice, en dépit d&#39;un fragment fluorescent attachée. Il est essentiel d&#39;établir que le produit du gène étiquetées par fluorescence est biologiquement active avec un essai approprié. Pour Shh-GFP, la capacité d&#39;activer l&#39;expression de PTC1 16 a été confirmée. Wnt8a a une capacité remarquablement puissa...

Au cours du développement embryonnaire précoce, les cellules sont progressivement engagés à suivre lignées spécifiques de différenciation: cela signifie un groupe de totipotentes (ou pluripotentes) cellules deviennent progressivement limité à établir des populations de cellules progénitrices déterminées pour donner naissance à un type de cellule. Signalisation cellule-cellule est au cœur de la régulation de la spécification de la lignée cours du développement embryonnaire. La manipulation de ces signaux sera nécessaire pour diriger les cellules souches vers destins particuliers pour soutenir nouveaux traitements médicaux. Un nombre relativement faible de voies de signalisation sont réitéré au cours du développement, y compris les voies répondant à la superfamille TGF (nodals et BMP) 1-2, FGF 3, Wnts 4, 5 et hérissons. Ces protéines sécrétées lient des récepteurs présents sur la membrane de la cellule pour activer la transduction du signal en modifiant ainsi l&#39;expression du gène et / ou le comportement des cellules. La réglementation stricte du signe de la celluleAlling est essentiel pour la spécification de la lignée cellulaire et le développement normal. Alors que la diaphonie entre ces voies est importante pour déterminer le destin des cellules, un seul ligand peut se solliciter des réponses distinctes à différentes concentrations. Gradients de morphogènes ont été décrits il ya plus de 100 ans comme une théorie pour expliquer comment les différents types de cellules peuvent dériver d&#39;un domaine de 6 cellules. Signalisation des molécules produites par un groupe de cellules peut se diffuser sur une certaine plage, la diminution de la concentration avec une plus grande distance de la source. Les cellules exposées au signal répondront à la concentration locale à leur position dans le domaine des cellules, avec des cellules à des positions distinctes répondant différemment à différents niveaux du signal. Preuve de l&#39;existence de morphogènes proviennent d&#39;études sur l&#39;embryon précoce Drosophila 7 et le disque de l&#39;aile 8, ainsi que la branche des vertébrés 9 et 10 tube neural. Les méthodes sont nécessaires pour envestigate comment gradients morphogène sont établis et d&#39;identifier d&#39;autres molécules importantes dans la régulation de ces gradients. Élégantes immunohistochimie en utilisant des expériences de visualiser in vivo des protéines endogènes dans le contexte de différents contextes génétiques ont été utilisées pour étudier les gradients de morphogènes 11-12. Toutefois, les bons anticorps et des mutants spécifiques ne sont pas toujours disponibles, de sorte que nous décrivons ici un protocole utilisant la surexpression de ligands fluorescents dans Xenopus, de fournir une alternative, méthode simple pour disséquer la façon dont les produits de gènes exogènes peuvent influencer la distribution de ligands à travers un champ de cellules. Xenopus laevis fournit un excellent système pour entreprendre ces types d&#39;expériences que leurs embryons se développent à l&#39;extérieur afin qu&#39;ils soient accessibles dès les premiers stades. Leur grande taille (1-1.5mm de diamètre) simplifie la micro-injection et la manipulation chirurgicale et par étapes, la blastula cellules sont faciles à l&#39;image car ils sont encore relativement grande (environ 2081; m de diamètre). Études de surexpression dans Xenopus sont simples à faire: ARNm injectés dans l&#39;embryon précoce peuvent être ciblés vers des cellules particulières et est efficacement traduits. Les constructions Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescence marqués ont été générés en utilisant pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 et eGFP. Le peptide HA est important de comprendre, non seulement pour fournir une étiquette supplémentaire moléculaire, mais aussi parce que l&#39;on pense à agir comme une entretoise qui sépare les protéines Wnt et eGFP permettant à la fois des produits de gènes de fonctionner. Le produit d&#39;assemblage utilisé pour la visualisation de Shh a été précédemment utilisée pour générer une souris transgénique exprimant une protéine de fusion eGFP Shh-15; cela a été aimablement fourni par Andy McMahon. Fait important, l&#39;étiquette de GFP pour toutes les constructions est clonée en 3 &#39;de la séquence de signal de telle sorte qu&#39;il est retenu après le traitement. Il est également essentiel de veiller à ce que la protéine finale comprend des séquences nécessaires à la modification, par exemple supplén des lipides comme est le cas pour Shh et Wnt ligands ADNc ont été sous-cloné dans le vecteur d&#39;expression pCS2 + qui est optimisé pour la prodution de l&#39;ARNm synthétique; il comprend un promoteur SP6 et le signal de polyadénylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors). Le travail décrit ici fournit un protocole simple pour comparer la sécrétion et la diffusion de fluorescence étiqueté Wnt et Shh marqués ligands. En injectant des quantités définies de l&#39;ARNm synthétique, le protocole fait le tour des problèmes associés à l&#39;expression variable à partir de différents vecteurs utilisant différents promoteurs. Ces méthodes ont été récemment appliqué pour étudier les effets du sulfate d&#39;héparane endosulfatase Sulf1 sur Shh-eGFP et Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP la sécrétion et la diffusion chez Xenopus 16-17.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB 1200</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Ambion</td><td>From Megascript SP6 Kit AM 1330</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>VWR International</td><td>RC-091</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de calcium</td><td>Sigma</td><td>C13961</td><td></td></tr><tr><td>Capuchon analogue (m7G(5'))Applied</td> <td>Biosystems</td><td>AM 8050</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>C 2432</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-cystéine monohydraté</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427-013</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR International</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma</td><td>F 4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiji image J software</td><td></td><td></td><td>Téléchargement gratuit http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Melford</td><td>G 0124</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles en verre, n°1.5&nbsp ;</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille en verre</td><td>Narishige</td><td>Narishige PC -10</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles en verre</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrophine chronique humaine (HCG)</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/7500/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de lithium (LiCl)</td><td>Sigma</td><td>L-7026</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 et Logiciel Zen (2008-2010)</td><td>Logiciel Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>http://uk.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Eau de qualité moléculaire&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 2819-10</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles&nbsp ;</td><td>Boots</td>, <td>code-barres 3600530 373048</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Lab.tech International</td><td>ND-1000 / ND8000</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (55 mm)</td><td>VWR International</td><td>391-0865</td><td></td></tr><tr><td>Phénol-chloroforme</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>http://www.photoshop.com/products</td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité et tampons&nbsp ;</td><td>Biolabs</td><td>M0530S&nbsp ; Tampon - M0531S</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Ruban isolant PVC</td><td>Onecall</td><td>SH5006MPK</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>S28704</td><td></td></tr><tr><td>Tampons d’enzymes de restriction</td><td>Roche</td><td>SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse sans RNAse</td><td>Promega</td><td>ME10A</td><td></td></tr><tr><td>Lames à simple tranchant à dos en acier</td><td>Personna</td><td>66-0403-0000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>SP6 kit de transcription</td><td>Ambion</td><td>AM1330</td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHE 2505</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles en tungstène faites</td><td></td><td></td><td>maison</td></tr><tr><td>Zen lite software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Téléchargement gratuit http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html</td></tr></tbody></table>

utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; xenopus laevis</em&gt; chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de wnt et shh morphogène dégradés

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Ce protocole décrit un procédé pour visualiser des ligands distribués à travers un champ de cellules. La facilité de l&#39;expression de protéines exogènes, ainsi que la taille de leurs cellules dans des embryons précoces, faire Xenopus laevis un modèle utile pour visualiser des ligands GFP étiqueté. ARNm synthétiques sont efficacement convertis après l&#39;injection dans des embryons de xénope à un stade précoce, et les injections peuvent être ciblés pour une seule cellule. Lorsqu&#39;il est combiné avec un traceur de lignage comme membrane attaché DP, la cellule injectée (et ses descendants) qui sont la production de la protéine surexprimée peuvent facilement être suivies. Ce protocole décrit un procédé pour la production de fluorescence étiquetée Wnt et Shh ligands injecté à partir de l&#39;ARNm. Les procédés impliquent la micro dissection des explants ectodermiques (caps animales) et l&#39;analyse de la diffusion de ligand dans plusieurs échantillons. En utilisant l&#39;imagerie confocale, informations sur la sécrétion ligand et la diffusion sur un champ de cellules peut être obtenue. Les analyses statistiques des images confocales fournissent des données quantitatives sur la forme de gradients de ligands. Ces méthodes peuvent être utiles aux chercheurs qui veulent tester les effets des facteurs qui peuvent réglementer la forme de gradients de morphogènes.

Analyse confocale des explants de plafonnement des animaux exprimant des protéines par fluorescence taggés fournit un système efficace pour la visualisation de la distribution de ligand dans différentes conditions expérimentales. Dans un exemple, la distribution de la GFP étiqueté Shh est représenté (figure 1). Au stade 2 cellules, les embryons de Xenopus sont injectés dans les cellules avec soit avec un ARNm de commande ou avec l&#39;ARNm codant pour Sulf1, une enzyme qui modifie l&#39;héparan...

Le manuscrit ici fournit un jeu simple de méthodes pour analyser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par fluorescence dans Xenopus. Ceci permet d&#39;obtenir un contexte pour tester la capacité des autres protéines de modifier la distribution de ligand et en permettant des expériences qui peuvent donner un aperçu des mécanismes de régulation des gradients de morphogènes.

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

L'objectif général de cette méthodologie est de visualiser la sécrétion et la diffusion de ligands marqués par un fluorophore dans un épithélium intact en utilisant une expression chez xip pos lavis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'établissement de gradients morphogénétiques, reconnus comme essentiels dans la spécification des lignées cellulaires durant le développement embryonnaire précoce. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une méthode simple pour visualiser la distribution des ligands dans un épithélium intact.Une partie essentielle du protocole consiste à produire des ligands biologiquement actifs qui sont normalement traités et sécrétés, et capables d'induire une réponse dans les cellules receptrices, malgré l'attachement d'une étiquette fluorescente. La microscopie confocale constitue un moyen idéal pour étudier la localisation de protéines marquées fluorescentes au sein de tissus tridimensionnels ; l'utilisation de lasers et de détecteurs indépendants permet une analyse précise dans ces types de tissus complexes et facilite la collecte de données robustes. Après avoir produit l'ARNm codant pour les ligands mar

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Developmental Biology

Biologie du développement

Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Xenopus embryonnaire ectoderme est devenu un modèle attractif pour les études de la polarité cellulaire. Un essai est décrit, dans lequel la distribution subcellulaire des protéines fluorescentes dans les cellules est évaluée ectoderme. Ce protocole aidera aborder les questions relatives au contrôle spatial de la signalisation.

Translocation polarisée des protéines fluorescentes dans les Xenopus</emEctoderme> en réponse à la signalisation Wnt

Processus de développement tels que la prolifération, la structuration, la différenciation et le guidage axonal peuvent être facilement modélisés dans la moelle épinière du poisson zèbre. Dans cet article, nous décrivons une procédure de montage pour embryons de poisson zèbre, qui optimise la visualisation de ces événements.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

Dans les embryons de xénope, les cellules du toit du blastocèle sont pluripotentes et peuvent être programmées pour générer divers tissus. Ici, nous décrivons des protocoles permettant d’utiliser des explants de toit de blastocèle d’amphibiens comme système de test pour étudier les principales caractéristiques in vivo et in vitro du développement neuronal précoce.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Cet article vidéo détaille un simple dans la méthode in vivo qui peut être utilisé pour caractériser systématiquement et efficacement les composants de voies de signalisation complexes et les réseaux de régulation dans de nombreux embryons d' invertébrés.

La puissance de la simplicité: Sea Urchin Embryons comme<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèles de développement pour l&#39;étude de la cellule cellule-à-Complex de signalisation réseau Interactions

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Nous présentons un protocole en deux parties qui combine l’imagerie fluorescente de calcium avec l’hybridation in situ, permettant à l’expérimentateur de corréler des modèles de l’activité de calcium avec des profils d’expression de gène sur un niveau unicellulaire.

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.

Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Ici, un protocole étape par étape optimisé est fourni pour la fixation, l’immunocoloration et la coupe des embryons afin de détecter des filopodes de signalisation spécialisés appelés cytonèmes dans le développement de tissus de souris.

Fixation de tissu embryonnaire de souris pour l’analyse des cytonèmes

L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation.   Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.

Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

Découvrez l'analyse confocale chez Xenopus laevis pour étudier la sécrétion et la diffusion de ligands fluorescents dans l'épithélium intact. Cette méthode permet d'explorer les modulateurs des gradients de morphogènes Wnt et Shh.

Utilisation de l'analyse confocale

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