Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude du brin positif de virus à ARN

L’objectif global de cette procédure est de sauver des particules virales infectieuses entièrement fabriquées à partir d’un CDNA cloné de brins positifs, des virus à ARN dont les génomes sont dans la même polarité que les Mr.NA cellulaires, tels que le virus de l’encéphalite japonaise. Cette génétique régénique basée sur l’AIIC est une méthode semiale qui permet la manipulation directe de l’ARN génomique viral, générant ainsi des virus recombinants pour l’étude moléculaire et génétique de la réplication virale et de la pathogenèse. Cette technique fournit également une plate-forme précieuse qui permet le développement de vaccins et de vecteurs viraux génétiquement définis pour l’administration de gènes étrangers.

Ces récipients sont applicables au clonage de l’ADNC complet pour la longueur ou la souche positive, les virus à ARN, en particulier ceux dont le génome est supérieur à 10 kb. Plusieurs membres de mon assistant de recherche en laboratoire, le professeur San Nun, le boursier postdoctoral UNG et Xing y Kim et les étudiants de premier cycle, Jordan Frank, feront la démonstration de la procédure. La partie vidéo de cette publication couvre la préparation du chromosome artificiel bactérien contenant les séquences d’intérêt, la synthèse de l’ARN, transcrit à partir du plasmide arrière, et la façon de mesurer l’infectiosité des ARN et le rendement du virus.

Toutes les procédures utilisées avant la génération du plasmide arrière sont fournies dans le protocole texte en détail. Pour cette procédure, cultivez d’abord une seule colonie d’e coli DH 10 B, en portant le plasmide arrière dans trois millilitres de deux bouillons XYT avec du chloramphénicol. Incuber la culture pendant 10 heures à 35 degrés Celsius en secouant à 225 à 250 tr/min.

Après 10 heures, augmentez l’échelle de la culture, puis inoculez 500 microlitres de croissance dans 500 millilitres de milieu et cultivez l’inoculum pendant six heures en secouant vigoureusement après six heures. Centrifuger la culture bactérienne dans des flacons de 2 250 millilitres à 3, 100 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez ensuite en suspension chaque pastille dans 30 millilitres de solution GTE.

Ajoutez 500 microlitres de lysozyme et incubez les suspensions sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparez une solution de lyse fraîche pour l’étape suivante. Après 10 minutes, ajoutez 60 millilitres de la solution de lyse et mélangez en remuant jusqu’à ce que la solution semble claire.

Laissez les réactions se dérouler à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 45 millilitres de solution de neutralisation dans chaque bouteille et retournez les bouteilles jusqu’à ce qu’elles soient bien mélangées. Ensuite, mettez-les sur de la glace pendant 10 minutes.

Récupérez les lysats neutralisés avec la centrifugation réfrigérée à haute G. Ensuite, collectez les surnageants dans deux nouvelles bouteilles de 250 millilitres. Ajoutez 0,6 volume d’isopropanol à 100 % à chacun et mettez-les sur de la glace pendant 20 minutes.

Ensuite, faites tourner les précipités, puis jetez les surnageants et dissolvez les pastilles dans cinq millilitres de tampon TE. Combinez les deux volumes dans un seul tube de 50 millilitres et précipitez l’ARN en ajoutant un volume égal de chlorure de lithium à cinq molaires et en incubant le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Utilisez une centrifugation à froid de 20 minutes pour recueillir le précipité d’ARN.

Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de 250 millilitres. Ajoutez deux volumes d’isopropanol à 100 % et placez le tube sur de la glace pour que le précipité d’ADN se forme. Après 20 minutes, faites tourner le précipité, aspirez le surnageant, remettez en suspension la pastille d’ADN dans 9,5 millilitres de tampon TE et transférez la solution d’ADN dans un tube de 50 millilitres.

Poursuivez la préparation en mettant en place le gradient de chlorure de césium avec un bromure de th. Chargez le mélange dans un tube en polypropylène refermable à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 18 et scellez le tube. Faites tourner le tube scellé pendant la nuit dans une ultracentrifugeuse pour former un gradient de chlorure de césium.

Le lendemain, prélevez une bande d’ADN du plasmide arrière du gradient de chlorure de césium. Utilisez une aiguille de calibre 18 pour créer une bouche d’aération au sommet de la pente et une aiguille de calibre 20 avec une seringue pour collecter l’ADN arrière du côté du gradient, puis transférez la collection dans un tube micro-fuge de 1,7 millilitre. Effectuez un lavage, ajoutez 2,5 volumes de butanol saturé d’eau et mélangez avec un vortex normal.

Ensuite, centrifugez le mélange à température ambiante et transférez la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube de micro-fuge de 1,7 millilitre. Répétez ce lavage six fois au total pour enlever tout le bromure d’éthidium. Maintenant, précipitez l’ADN arrière.

Ajoutez un 10e volume d’acétate de sodium à trois molaires et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % dans le tube. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez le précipité à température ambiante et lavez la pastille d’ADN avec un millilitre d’éthanol à 70 %.

Répétez l’essorage et récupérez à nouveau la pastille. Enfin, faites sécher à l’air libre la pastille d’ADN pendant 10 minutes et faites-la pénétrer dans 200 microlitres de tampon TE. Commencez par une digestion enzymatique de restriction à grande échelle du plasmide de dos avec xbo.

Un dans un volume total de 100 microlitres. Effectuez cette digestion à 37 degrés Celsius pendant 12 à 15 heures. Ensuite, incubez davantage la digestion avec 25 unités supplémentaires de nucléase de haricot mungo à 30 degrés Celsius pendant deux heures.

Après l’incubation, portez le volume à 300 microlitres avec de l’eau distillée. Effectuez maintenant une extraction de phénol en ajoutant un volume égal de phénol chloroforme, alcool isoamylique à l’échantillon dilué. Tourbillonnant vigoureusement pendant une minute, tournant dans le tube et transférant la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.

Répétez ensuite l’extraction avec du chloroforme. Ensuite, récupérez l’ADN linéarisé par précipitation d’éthanol. Récupérez la pastille d’ADN par centrifugation, jetez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre d’éthanol à 70 %.

Répétez l’étape de centrifugation et faites sécher le granulé à l’air. Après 10 minutes de séchage, dissolvez la pastille d’ADN dans 30 microlitres d’eau distillée. Examinez ensuite un microlitre du dos récupéré sur un gel AROS à 0,8 %.

Ensuite, mettez en place une transcription de 25 microlitres de l’ADN de retour linéarisé, y compris l’UTP tritié pour la quantification de l’ARN. Effectuez la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Examinez ensuite un ou deux microlitres de la réaction de transcription de ruissellement sur un gel AROS à 0,6 %.

Commencez avec des cellules BHK 21 cultivées pendant 24 heures dans des boîtes de 150 millimètres plaquées à 3 millions de cellules par boîte. Rincez les cellules monocouches avec la solution froide A puis détachez-les par la trypsine. Isation. Prélever les cellules par centrifugation à 270 GS pendant deux minutes.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 50 millilitres de solution froide A et faites-les tourner à nouveau. Répétez ce lavage trois fois après le dernier lavage. Remettez les cellules en suspension à 20 millions par millilitre dans la solution A.Ensuite, mélangez une aliquote de 400 microlitres de la suspension cellulaire avec deux microgrammes d’ARN synthétique dans un vete de deux millimètres.

Électro-purifiez rapidement le mélange dans des conditions optimales et laissez reposer les cellules pendant 10 minutes. Transférez ensuite les cellules dans un tube micro-fuge contenant 600 microlitres de milieu de culture complet. Préparez maintenant une dilution en série dix fois plus importante des cellules électroporées dans des volumes d’un millilitre de plaques de 100 microlitres d’aliquotes de chaque dilution sur des monocouches de cellules Bhk 21 normales après quatre à six heures d’incubation, superposez les cellules avec 0,5 % d’aros en MEM plus FBS et cultivez-les pendant quatre jours supplémentaires.

Les cellules Bhk 21 ont été électroporées simulées ou électroporées avec des transcrits d’ARN dérivés de deux clones indépendants du JEV pleine longueur. Quatre jours plus tard, les cellules ont été colorées avec du violet cristallin pour voir l’ARN infectieux dans les cellules. À l’aide de cette tache, les centres infectieux ont été quantifiés. Ensuite, l’expression de la protéine virale a été examinée dans des cellules électroporées d’ARN 20 heures après la transfection à l’aide d’un anti-NS, d’un sérum antis de lapin et d’un anticorps secondaire conjugué SI trois vu en rouge.

Les noyaux étaient contre-colorés avec du DAPI visible en bleu. Plus tard, 22 et 40 heures après la transfection, la production de varians infectieux s’est accumulée dans la culture. Les surnageants des cellules électroporées de l’ARN ont été examinés par des tests sur plaque.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sauver un virus infectieux entièrement à partir d’un CNA cloné d’une souche positive, de l’ARN, comme le virus de l’encéphalite japonaise. N’oubliez donc pas que travailler avec un virus de l’encéphalite japonaise et d’autres agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux. Une formation appropriée en matière de biosécurité est nécessaire avant d’effectuer cette procédure.