Name: Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour létude du brin positif de virus à ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Découvrez comment créer un chromosome artificiel bactérien infectieux contenant l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise. Cette méthode permet d'étudier la biologie virale et de développer des vaccins génétiquement définis.

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Les auteurs tiennent à remercier le fonds Utah Science, Technology and Research pour le soutien des subventions YML et la Fondation nationale de recherche de Corée (2009-0069679 et 2010-0010154) pour le soutien du SIY. Cette recherche a été soutenue par la station d’expérimentation agricole de l’Utah de l’Université d’État de l’Utah et approuvée sous le numéro de revue UAES #8753. De plus, les auteurs remercient le Dr Deborah McClellan pour son aide éditoriale.

Les auteurs ont déclaré qu’ils n’avaient pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole actuel a été utilisée avec succès pour générer de pleine longueur infectieux de clones d&#39;ADNc de deux souches différentes (CNU / LP2 et 27 SA 14 -14 à 2 28) de JEV, un flavivirus dont ADNc fonctionnel est révélée être par nature difficiles à construire et propager en raison de la toxicité de la cellule hôte et de l&#39;instabilité génétique de l&#39;ADNc clone 8,74-76 Ce protocole comporte trois composantes majeures:. premières, en maximisant la synthèse / amplification d&#39;une copie d&#39;ADNc fidèles de l&#39;ARN viral en utilisant inverse haute fidélité transcriptase / ADN polymérase; Deuxièmement, le clonage de la région virale prM-E de codage contenant des séquences toxiques (données non publiées) 74,77,78 dans un très faible nombre de copies vecteur BAC de l&#39;ADNc initial sous-clonage aux pleine longueur étapes finales d&#39;assemblage d&#39;ADNc; et la troisième, en utilisant un taux d&#39;alcoolémie de vecteur de clonage qui peut accueillir un ADN étranger avec une taille moyenne de 120 à 350 kb, 19-21 qui tolère apparemment plus grande ADN Inserts que les autres vecteurs de clonage. Cette approche de clonage sera généralement applicable à de nombreux autres virus à ARN à brin positif, en particulier ceux avec un grand génome ARN de ~ 10 à 32 kb. Génération d&#39;un clone d&#39;ADNc infectieux est une étape clé dans le développement d&#39;un système de génétique inverse pour les virus à ARN, en particulier pour les virus à ARN à brin positif, parce que son génome agit ARNm viral qui est traduit en protéines par les ribosomes de la cellule hôte. Ainsi, la replication virale peut être initiée par l&#39;introduction d&#39;un génome de longueur molécule d&#39;ARN dérivé de l&#39;ADNc dans une cellule hôte sensible. La disponibilité d&#39;un clone infectieux JEV ADNc, lorsqu&#39;il est combiné avec la technologie de l&#39;ADN recombinant, a permis de mieux comprendre les divers aspects du cycle de vie viral au niveau moléculaire, tel que l&#39;expression du gène 73,79 et la replication du génome. 63,64 De plus, un pleine longueur JEV clone d&#39;ADNc a prouvé être un outil précieux pour le développement de vaccins antiviraux 28 et des vecteurs de transfert de gènes. &lt;sup&gt; 80,81 Comme avec tous les virus à ARN à brin positif, il ya plusieurs étapes critiques dans la construction d&#39;un ADNc fonctionnelle fiable pour JEV dont ARN hautement infectieux peuvent être synthétisés in vitro. Dans l&#39;idéal, la séquence des ARN transcrits synthétiques partir d&#39;un clone de l&#39;ADNc pleine longueur doit être identique à celle de l&#39;ARN génomique viral, en particulier les 5 &#39;et 3&#39;-terminales des séquences qui sont nécessaires pour l&#39;initiation de la replication de l&#39;ARN viral . 60-62 Dans le protocole courant, la 5 &#39;et authentique extrémités 3&#39; ont été assurées en plaçant la séquence promoteur SP6 en amont du premier nucléotide d&#39;adénine du génome viral et le positionnement d&#39;un site unique artificiel de restriction Xba I en aval du dernier thymine nucléotidique du génome viral, respectivement. Plafonné ARNs de synthèse avec l&#39;authentique 5 &#39;et 3&#39; ont été produites par la transcription en run-off d&#39;un ADNc te Xba I-linéarisé et MBN-traitémplate en utilisant l&#39;ARN polymerase SP6 amorcée avec le G 7 m (5 &#39;) ppp (5&#39;) un analogue de la coiffe. Ce protocole peut être modifié de plusieurs façons. Pour la transcription in vitro, un autre ARN bactériophage polymérase (par exemple, T3 ou T7) peut être utilisé en conjonction avec sa séquence de promoteur bien défini. 27 Comme un site run-off, un site de restriction différente peut être utilisée si elle ne figure pas dans le génome viral et l&#39;ARN synthétique, si de l&#39;ADNc avec les extrémités linéarisé authentique extrémité 3 &#39;. L&#39;importance de la séquence nucléotidique de l&#39;extrémité 3 &#39;a été mise en évidence par une diminution de ~ 10 fois de l&#39;ARN infectieux quand un ARN synthétique contient trois ou quatre nucleotides des virus non lié à son extrémité 3&#39;. 27 Dans un vitro réaction de transcription, à la fois la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A et m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G bouchon analogique peut être utilisé aussi bien, bien que les derniers endroits d&#39;un nucléotide G supplémentaire sans rapport amont de l&#39;virale 5 &quot;-end, mais queaddition ne modifie pas le pouvoir infectant ou de la réplication de l&#39;ARN de synthèse. 27 En outre, l&#39;enlèvement de la matrice d&#39;ADNc à partir des transcrits d&#39;ARN par la DNase I digestion est pas nécessaire pour les tests ARN infectieux, parce que la matrice d&#39;ADNc lui-même ne sont pas infectieux. 27 La technologie d&#39;alcoolémie a été appliquée à la construction de clones infectieux d&#39;ADNc pour une poignée de virus à ARN brin positif, à savoir, deux JEVs, CNU / LP2 27 et SA 14 -14 à 2 28 (taille du génome, ~ 11 ko); deux virus de la dengue, BR / 90 26 et NGC 29 (~ 11 ko); le virus de la diarrhée virale bovine, SD1 (~ 12 kb); 25 deux classiques virus de la peste porcine, C et Paderborn (~ 12 kb); 24 le virus de la maladie de la frontière, Gifhorn (~ 12 kb); 24 le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), 30 le virus de la gastroentérite transmissible, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 le virus de la péritonite infectieuse féline,DF-2 (~ 29 kb); 32 le coronavirus respiratoire aigu sévère de syndrome, Urbani (~ 30 kb); 9 du syndrome respiratoire coronavirus Moyen-Orient, EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 et le coronavirus humain, OC43 (~ 31 kb) 31 Le principal avantage de l&#39;utilisation des taux d&#39;alcoolémie pour la construction d&#39;ADNc est la grande stabilité génétique des grands, 1- ou 2-copie plasmides BAC.; Cependant, la nature intrinsèque de son nombre extrêmement faible copie est également un grand désavantage, en raison des très faibles rendements d&#39;ADN BAC et la réduction conséquente de la pureté de l&#39;ADN BAC à l&#39;égard de l&#39;ADN chromosomique hôte. Dans le protocole actuel, le rendement de l&#39;ADN de BAC est maximisée par la croissance E. coli DH10B transformée avec le pBAC infectieuse BAC / SA 14 -14 à 2 dans un milieu riche en nutriments, 2xYT. Malgré cet effort, le rendement moyen est de seulement ~ 15 ug d&#39;ADN BAC à partir de 500 ml de bouillon 2xYT. En outre, la pureté de l&#39;ADN de BAC est mieux réalisée à l&#39;aide de CsCl-EtBr centrifugation en gradient de densité de purification, Plutôt que le plasmide d&#39;isolement utilisée en colonnes. Cependant, il est important de garder à l&#39;esprit que le E. de BAC-transformé coli ne devrait pas proliférer parce que cela pourrait mettre en péril la stabilité génétique de l&#39;ADNc clone, et la croissance plus élevé ne conduit pas nécessairement à des rendements plus élevés ou de l&#39;ADN de BAC plus pureté. Le protocole décrit ici est un optimisé, efficace et méthode simplifiée pour la construction et la propagation d&#39;une pleine longueur d&#39;ADNc clone infectieux génétiquement stable comme un taux d&#39;alcoolémie pour le JEV, une procédure que l&#39;on croyait pratiquement impossible. Cette même stratégie de clonage peut également être appliqué à de nombreux autres virus à ARN à brin positif. En général, les clones infectieux d&#39;ADNc permettent d&#39;introduire une variété de mutations (par exemple, des deletions, insertions et mutations ponctuelles) dans un génome d&#39;ARN viral à l&#39;étude de leurs fonctions biologiques dans la réplication virale et la pathogenèse. Ce système de génétique inverse à base d&#39;ADNc permet de développer et de TESt vaccin et candidats thérapeutiques ciblant un facteur (s) de virulence d&#39;un virus à ARN brin positif d&#39;intérêt particulier. En outre, cette technologie infectieux d&#39;ADNc peut également être utilisé comme un vecteur viral, capable d&#39;exprimer un gène étranger (s) d&#39;intérêt pour de nombreuses applications dans la recherche biomédicale.

Pour virologues d&#39;ARN, l&#39;avènement de la technologie de l&#39;ADN recombinant dans les années 1970 a permis de convertir des génomes d&#39;ARN viraux dans des clones d&#39;ADNc, qui pourrait ensuite être propagées sous forme de plasmides dans des bactéries pour la manipulation génétique des virus à ARN. 1 Le premier virus à ARN soit clonage moléculaire était bactériophage Qß, un virus à ARN brin positif qui infecte Escherichia coli. Un plasmide contenant une copie complète de l&#39;ADNc de l&#39;ARN génomique Qß a donné lieu à des phages infectieux Qß lorsqu&#39;il est introduit dans E. coli. 2 Peu de temps après, cette technique a été appliquée au poliovirus, un virus à ARN brin positif des humains et des animaux. Un plasmide portant un ADNc pleine longueur de l&#39;ARN génomique du poliovirus a été infectieuse quand transfecté dans des cellules de mammifères et capable de produire des virions infectieux 3 Dans cette approche &quot;de l&#39;ADN-lancé&quot;, les ADNc clones devraient être transcrites intracellulaire pour lancer la réplication de l&#39;ARN viral.cependant, il est difficile de savoir comment la transcription est initiée et la façon dont les transcriptions sont traitées à la séquence virale correcte. Cette préoccupation a conduit au développement d&#39;une variante &quot;ARN-lancé&quot; approche, grâce à quoi une copie d&#39;ADNc complète du génome de l&#39;ARN viral est clone sous un promoteur reconnu par une E. coli ou de l&#39;ARN polymérase du phage pour la production d&#39;ARN de synthèse in vitro avec défini 5 &#39;et 3&#39;, qui subissent le cycle complet de la réplication virale lorsqu&#39;il est introduit dans des cellules hôtes. 4,5 Le premier succès avec cette approche a été signalé pour Brome virus de la mosaïque , 6,7 un virus à ARN brin positif de plantes. Depuis lors, l&#39;approche de l&#39;ARN lancé a été développé pour une large gamme de virus à ARN positif, y compris les calicivirus, les alphavirus, flavivirus, arterivirus et les coronavirus. 1,4,5,8 Dans les deux ADN et ARN lancé systèmes de génétique inverse, la construction d&#39;un full-ADNc clone est la clé pour générer l&#39;ADN infectieux ou d&#39;ARN de virus à ARN à brin positif, mais il devient un véritable défi technique que la taille du génome viral augmente. 9-17 En particulier, un grand génome d&#39;ARN de ~ 10 -32 kb présente trois obstacles majeurs à le clonage d&#39;un ADNc fonctionnelle pleine longueur. 18 La première difficulté est la synthèse d&#39;un ADNc fidèles copier, puisque la fidélité de RT-PCR est inversement proportionnelle à la longueur de l&#39;ARN viral. Le second obstacle est la présence de séquences potentiellement toxiques, depuis de longues molécules d&#39;ARN sont plus susceptibles de contenir des séquences imprévues capables de faire le fragment d&#39;ADNc dans des plasmides instables dans E. coli. Le troisième et le plus important problème est la disponibilité d&#39;un vecteur approprié, car il est difficile de trouver un vecteur de clonage qui peut loger un insert d&#39;ADNc viral de&gt; 10 kb. Au cours des trois dernières décennies, ces obstacles ont été surmontés par plusieurs avancées en enzymologie, la méthodologie, und vectorologie. 1,4,5,8 Parmi ceux-ci, le développement le plus prometteur et innovant est le clonage de grands virus à ARN brin positif chromosomes bactériens artificiels comme infectieuses (BAC). Le vecteur BAC est un plasmide à faible copie clonage (1-2 copies / cellule) en fonction du E. coli facteur de fertilité, avec une taille d&#39;insert moyenne d&#39;ADN de ~ 120 à 350 kb de 19 à 21 Un fragment d&#39;ADN est inséré dans le vecteur BAC d&#39;une manière similaire à clonage dans des vecteurs de clonage généraux. les clones BAC résultant sont stables depuis de nombreuses générations dans E. coli. 22,23 À ce jour, la technologie de BAC a été utilisé pour créer des clones d&#39;ADNc infectieux pour&gt; 10 membres de trois familles de virus à ARN brin positif, à savoir, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 et Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Utilisant le virus de l&#39;encéphalite japonaise (JEV) comme un exemple, le présent ouvrage présente les procédures détaillées qui peuvent êtreutilisé pour construire une pleine longueur BAC infectieuse génétiquement stable pour une variété de virus à ARN brin positif. JEV est un flavivirus zoonotique 33 qui est transmis dans la nature entre les oiseaux, les porcs, et d&#39;autres hôtes vertébrés par les moustiques vecteurs. 34,35 Chez l&#39;homme, l&#39;infection peut provoquer le JEV grave souvent mortelle maladie neurologique encéphalite japonaise (EJ), 36 qui se produit dans Asie et certaines parties du Pacifique occidental, 37,38 avec une incidence annuelle estimée de ~ 50,000-175,000 cas cliniques. Le génome de 39,40 JEV est un ~ 11 kb, simple brin, molécule d&#39;ARN de sens positif et se compose de un seul cadre de lecture ouvert (ORF) flanqué de deux régions non codantes (DND) aux extrémités 5 &#39;et 3&#39; se termine. 41,42 L&#39;ORF code pour une polyprotéine qui est clivée par des protéases virales et hôte pour générer des 10 protéines individuelles, désigné C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5 dans la direction N- à C-terminale. De plus 34,43,44, eXtended forme de NS1 (NS1) est exprimée par -1 déphasage ribosomique au niveau des codons 8-9 de NS2A. 45,46 Sur ces 11 protéines, les trois protéines structurales (C, prM et E) sont indispensables pour la formation des maladies infectieuses 47,48 virions, et les huit autres protéines non structurales (NS1 à NS5, et NS1 &#39;) sont essentiels pour la replication virale de l&#39;ARN, l&#39;assemblage de particules de 49 à 51, 52 à 56 et l&#39;immunité innée évasion. 57-59 Les deux extrémités 5&#39; et 3 «DND contiennent conservées séquences primaires et les structures sous forme d&#39;ARN secondaire / tertiaire, 60-62 qui sont importants pour moduler la réplication de l&#39;ARN viral. 63,64 Ce protocole décrit les outils, les méthodes et les stratégies pour générer une pleine longueur BAC infectieuse de JEV SA 14 -14 à 2. 28 Ce clone BAC fonctionnel contient une copie complète de l&#39;ADNc de l&#39;ARN génomique JEV, 65 qui est entouré par un promoteur pour l&#39;ARN polymérase SP6 en amontde l&#39;extrémité 5 &#39;virale et un site de restriction Xba I unique, en aval de l&#39;extrémité 3&#39; virale pour la transcription in vitro de ruissellement. Cette technologie de BAC est applicable à la construction d&#39;un clone moléculaire d&#39;ADNc entièrement fonctionnelle pour un réseau de virus à ARN à brin positif.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Clonage moléculaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive Tube 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille 250 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (point de fusion bas)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Nouveau Angleterre BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de césium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Cancérigène</td></tr><tr><td>DE-81 Papier filtre</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp ;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td> Colonne filtrante <td>toxique et hautement mutagène</td></tr><tr><td>(kit Plasmid Maxiprep)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Glucose irritant</td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp ;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp ;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de lithium Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase de haricot mungo</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Matières biologiques dangereuses (déchets tranchants)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotide</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td> Synthèse <td></td><td>d’oligonucléotides personnalisée</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phénol (saturé en tampon)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxique et hautement corrosif</td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :Isoamyl Alcohol Life</td><td>Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxique et hautement corrosif</td></tr><tr><td>Phénol :Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxique, corrosif et irritant</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase</td> Life <td>Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène scellable (16 &times ; 76 mm)& nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 ARN polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de centrifugation (Plasmidide Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>ARNt (levure)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp ;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>2. Culture cellulaire</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture (150 mm)&nbsp ;</td><td>TPP</td><td>93150²nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette (2 mm d’écart)</td><td>Appareil Harvard</td><td>450125</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de Bovin Fœtal&nbsp ;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxique et cancérigène</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à six puits</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. Equipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel Electrophorèse</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de bureau&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Appareil Harvard</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Lampes ultraviolettes à ondes longues (portables)</td><td>Centrifugeuse de</td> table <td>UVP UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bactérienne artificial chromosomes: un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à arn

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

La génétique inverse, une approche visant à sauver un virus infectieux entièrement à partir d’un ADNc cloné, a révolutionné le domaine des virus à ARN à brin positif, dont les génomes ont la même polarité que l’ARNm cellulaire. Le système de génétique inverse basé sur l’ADNc est une méthode fondamentale qui permet la manipulation directe de l’ARN génomique viral, générant ainsi des virus recombinants pour les études moléculaires et génétiques des éléments de l’ARN viral et des produits géniques dans la réplication virale et la pathogenèse. Il fournit également une plate-forme précieuse qui permet le développement de vaccins génétiquement définis et de vecteurs viraux pour l’administration de gènes étrangers. Cependant, pour de nombreux virus à ARN à brin positif tels que le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), les ADNc clonés sont instables, ce qui constitue un obstacle majeur à la construction et à la propagation de l’ADNc fonctionnel. Le présent rapport décrit ici les considérations stratégiques liées à la création et à l’amplification d’un ADNc infectieux JEV pleine longueur génétiquement stable en tant que chromosome artificiel bactérien (BAC) à l’aide des procédures expérimentales générales suivantes : isolement de l’ARN viral, synthèse de l’ADNc, sous-clonage et modification de l’ADNc, assemblage d’un ADNc complet, linéarisation de l’ADNc, in vitro Synthèse de l’ARN et récupération du virus. Ce protocole fournit une méthodologie générale applicable au clonage de l’ADNc complet pour une gamme de virus à ARN à brin positif, en particulier ceux dont le génome est de >10 kb de longueur, dans un vecteur BAC, à partir duquel les ARN infectieux peuvent être transcrits in vitro avec une ARN polymérase bactériophage.

Pour tous les virus à ARN à brin positif, la fiabilité et l&#39;efficacité d&#39;un système de génétique inverse dépendent de la stabilité génétique d&#39;un ADNc de pleine longueur clone, dont la séquence est équivalent à la séquence consensus de l&#39;ARN génomique viral. 27 La figure 1 représente un cycle à cinq stratégie d&#39;étape pour la construction d&#39;un ADNc infectieux de pleine longueur comme un taux d&#39;alcoolémie pour JEV SA 14 -14 à 2 28: Etape 1, la purification de l&#39;ARN viral à partir du surnageant de culture de cellules de JEV infectés cellules BHK-21 (figure 1A); Etape 2, la synthèse de quatre amplicons d&#39;ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l&#39;ensemble du génome viral (figure 1B); Étape 3, le sous-clonage de chacun des quatre fragments d&#39;ADNc contiguës dans un vecteur BAC, créant pBAC / F1 à pBAC / F4 (figure 1C); Étape 4, la modification des ADNc clonés pour la transcription de l&#39;ARN polymerase SP6, soit in vitro ruissellement, plaçant une SP6séquence de promoteur immédiatement en amont de l&#39;viral extrémité 5 &#39;(pBAC / F1 SP6), ce qui élimine une préexistant site Xba I interne au niveau du nucleotide 9131 en introduisant une mutation ponctuelle silencieuse, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), et l&#39;insertion, un site run-off nouvelle Xba I artificielle immédiatement en aval de l&#39;extrémité 3 &#39;virale (pBAC / F4 RO) (figure 1D); et l&#39;étape 5, l&#39;assemblage d&#39;une pleine longueur SA 14 -14 à 2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14 à 2 (figure 1E). Le tableau 1 énumère les oligonucléotides utilisés dans cette procédure de clonage. 28 Pour la construction d&#39;une fonction JEV de l&#39;ADNc, la première étape importante est la synthèse de quatre fragments d&#39;ADNc se chevauchant en utilisant l&#39;ARN viral purifié comme matrice pour la RT-PCR. La figure 2 donne un résultat représentatif pour les quatre produits de RT-PCR qui étaient une électrophorèse sur un 0,8%gel d&#39;agarose. Ce gel démontre clairement que une pleine longueur JEV ADNc est amplifié en quatre fragments d&#39;ADNc se chevauchant. Occasionnellement, les réactions de RT-PCR peuvent produire un ou plusieurs produits spécifiques du virus ou non spécifiques qui sont la plupart du temps inférieure à celle du produit attendu, à cause du recuit des amorces non spécifiques de l&#39;ADNc au cours de la synthèse / amplification. D&#39;autre part, peu ou pas de produit attendu RT-PCR serait amplifié à cause de la contamination accidentelle RNase pendant l&#39;isolement de l&#39;ARN viral ou mauvaise exécution RT-PCR. La prochaine étape clé est le clonage et la modification d&#39;un partial- ou pleine longueur JEV ADNc dans BAC, qui est une procédure relativement simple qui utilise des techniques d&#39;ADN recombinant. 69 La figure 3 présente un résultat représentatif de la purification du clone BAC contenant un ADNc pleine longueur de JEV SA 14 -14 à 2 par bandes dans un gradient de CsCl-EtBr.Dans cette expérience, après centrifugation pendant 16 heures à 401 ​​700 × g, deux bandes distinctes, à savoir, le E. coli ADN chromosomique ci-dessus et le plasmide ADN BAC superenroulée ci-dessous, sont visibles dans le milieu du tube sous la lumière ultraviolette à ondes longues. Un volume minimal (~ 400 ul) de la bande d&#39;ADN de BAC a été soigneusement inférieur recueilli par piquer un trou avec une seringue sur le côté du tube. Par la suite, l&#39;EtBr a été extrait à partir de l&#39;ADN par extraction au BAC butanol, et l&#39;ADN libre de BAC-EtBr a été concentré par précipitation à l&#39;éthanol. La dernière étape est la détermination de l&#39;infectivité spécifique des ARN transcrits in vitro de synthèse de la pleine longueur SA 14 -14 à 2 BAC (pBAC / SA 14 -14 à 2) après transfection d&#39;ARN dans les cellules permissives (Figure 4). Cette étape comporte trois étapes successives: Etape 1, linéarisation de la pleine longueur SA 14 -14 à 2 ADNc à la 3 &#39;-fin du génome viral (figure 4A); Étape 2, la production d&#39;ARN de synthèse de l&#39;ADNc linéarisé par ruissellement transcription (figure 4B); et l&#39;étape 3, le sauvetage des virus recombinants dans les cellules BHK-21 transfectées avec les ARN de synthèse (Figure 4C). Expérimentalement, deux clones indépendants de pBAC / SA 14 -14 à 2 ont été linéarisés avec Xba I digestion et traités avec MBN pour enlever le débord 5 &#39;de quatre de base généré par la digestion Xbal. Les BAC ont été linéarisés nettoyés par extraction au phénol-chloroforme, suivie d&#39;une précipitation à l&#39;éthanol. La linéarisation des deux BACs a été démontrée purifiés sur un gel d&#39;agarose à 0,8% (figure 5A). L&#39;extraction phénol-chloroforme doit être effectuée avec soin pour veiller à ce que les taux d&#39;alcoolémie linéarisées sont RNase-free. Chacun de ces deux limites linéarisées a servi de matrice d&#39;ADNc pour la transcription de ruissellement en utilisant l&#39;ARN polymerase SP6 dans la présence de la m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un analogue de la PAC. L&#39;intégrité des ARNs synthétiques a été montré en exécutant des parties aliquotes des deux mélanges de réaction de transcription sur un gel d&#39;agarose à 0,6%, avec une référence 1 kb DNA ladder (figure 5B). Dans cet essai simple, la bande majeure d&#39;ARN proéminent toujours migré juste ci-dessous les 3 kb référencer bande d&#39;ADN et semblait être forte. Cependant, l&#39;ARN dégradé aurait un aspect maculé sur le même gel. Un dosage infectieuse de centre est l&#39;étalon-or pour déterminer l&#39;infectivité spécifique des ARN synthétiques. Cette analyse a été effectuée par électroporation cellules BHK-21 avec des échantillons d&#39;ARN, l&#39;ensemencement des aliquotes égales des 10 armoires cellules diluées en série électroporées dans des plaques à 6 puits contenant naïfs cellules BHK-21 (3 x 10 5 cellules / puits), et la superposition d&#39;agarose sur les monocouches de cellules. Après une incubation de 4 jours, les cellules survivantes ont été fixées avec du formaldehyde et colorées avec du cristal violet une solution de quantifier le nombre de centres infectieux (plaques), ce qui correspond au nombre de molécules d&#39;ARN infectieux fournis dans les cellules (Figure 6A). Etant donné que la matrice d&#39;ADNc utilisée pour la transcription in vitro a été démontrée pour être non-infectieux, 27 une portion aliquote du mélange de réaction de transcription a été directement utilisée pour l&#39;électroporation. L&#39;électroporation est la méthode préférée pour la transfection d&#39;ARN; en variante, les ARN peuvent être transfectées par d&#39;autres méthodes utilisant des liposomes DEAE-dextrane et cationiques. L&#39;électroporation d&#39;ARN est très efficace, mais &quot;arc&quot; de l&#39;impulsion électrique se produit rarement, sinon les sels sont présents dans la réaction d&#39;électroporation ou si la cuvette d&#39;électroporation est réutilisé. L&#39;expression des protéines virales dans les cellules transfectées par l&#39;ARN a été examinée par immunofluorescence en utilisant un antisérum de lapin anti-NS1 (figure 6B). La production de particules virales dans les surnageants accumulées de cellules transfectées par l&#39;ARN étaitalyzed par des dosages de plaques (Figure 6C). Les résultats de ces expériences montrent clairement que les ARN synthétiques sont dérivés d&#39;ADNc infectieux dans permissives cellules BHK-21, la génération d&#39;un titre élevé de virus recombinants. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucléotide </td><td> Séquence bis (5 &#39;à 3&#39;) </td><td> Position b </td><td> Polarité </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> Fourmije sens </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952-10977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> De 10956 à 10977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac TA </td><td></td><td> Sens </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisens </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670-10694 </td><td> Sens </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954-10977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td colspan="4"> une des séquences de JEV sont affichés en majuscules, et des séquences BAC sont indiqués en lettres minuscules. position b de nucléotides se réfère à la séquence complète du génome de JEV SA 14 -14 à 2 (numéro d&#39;accession Genbank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Oligonucleotides utilisés pour la synthèse d&#39;ADNc, l&#39;amplification par PCR et la mutagenèse BAC. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figure 1.0; Stratégie pour la construction d&#39;un ADNc de pleine longueur de JEV SA 14 -14 à 2 comme un taux d&#39;alcoolémie (A) Isolement de l&#39;ARN viral à partir de particules JEV.. Il est représenté un diagramme schématique de l&#39;ARN génomique de JEV SA 14 -14 à 2. (B) Synthèse de quatre fragments d&#39;ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l&#39;ensemble du génome viral. (C) Sous-clonage de quatre fragments d&#39;ADNc se chevauchant dans un vecteur BAC, créant pBAC / F1 à pBAC / F4. (D) la modification des ADNc clonés pour la transcription en run-off in vitro. pBAC / F1 SP6 est un dérivé de pBAC / F1 qui contient la séquence du promoteur SP6 en amont de l&#39;extrémité 5 &#39;virale. pBAC / F3 KO est un dérivé de pBAC / F3 qui contient une mutation silencieuse de point (A 9134 → T, astérisque). pBAC / F4 RO est un dérivé de pBAC / F4 qui contient un artificielle site Xba I run-off en aval de l&#39;extrémité 3 &#39;virale. (E </<html> strong&gt;) Assemblée d&#39;une pleine longueur SA 14 -14 à 2 BAC (pBAC / SA 14 -14 à 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figure 2. Synthèse des quatre fragments d&#39;ADNc se chevauchant (F1 à F4) couvrant l&#39;ARN génomique pleine longueur de JEV SA 14 -14 à 2. Les quatre produits de RT-PCR sont évalués par électrophorèse dans un gel d&#39;agarose à 0,8%. M, 1 ko échelle d&#39;ADN. Les tailles attendues des quatre fragments d&#39;ADNc sont indiqués au bas de l&#39;image du gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Purification de la BAC contenant un ADNc de pleine longueur de JEV SA 14 -14 à 2. Le plasmide d&#39;alcoolémie est isolé de E. coli DH10B par la méthode de la lyse alcaline et SDS-purifié davantage par bandes dans un gradient de CsCl-EtBr. Présenté est un exemple de gradient de CsCl-EtBr l&#39;aide d&#39;un tube en polypropylène refermable 16 × 76 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figure 4. Vue d&#39;ensemble de la récupération de virus infectieux d&#39;une pleine longueur JEV SA 14 -14 à 2 ADNc assemblé en un taux d&#39;alcoolémie. (A) de linéarisation de la matrice d&#39;ADNc. La pleine longueur JEV BAC est coupé avecXba I et traité avec MBN. (B) Synthèse des transcrits d&#39;ARN. L&#39;ADNc linéarisé est transcrit par l&#39;ARN polymerase SP6 en présence de la m G 7 (5 &#39;) ppp (5&#39;) Un analogue de coiffe. (C) de récupération de l&#39;JEVs synthétique. Les tests in vitro des ARN transcrits sont transfectées dans des cellules BHK-21 par électroporation, qui génère un titre élevé du virus synthétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figure 5. Synthèse des ARN par transcription in vitro en utilisant un taux d&#39;alcoolémie JEV pleine longueur comme un modèle d&#39;ADNc. (A) Génération du linéarisé pleine longueur JEV BAC, pBAC / SA 14 -14 à 2. Deux clones indépendants de pBAC/ SA 14 -14 à 2 (Cl.1 et CL.2) sont linéarisés par digestion avec Xba I et le traitement ultérieur avec MBN. Les BAC linéarisées sont examinés par électrophorèse dans un gel d&#39;agarose à 0,8%. (B) la production des ARNs de synthèse par transcription de ruissellement. Chacun de ces deux limites brute est utilisé comme un modèle pour l&#39;ARN polymerase SP6 transcription de ruissellement. Des parties aliquotes des deux réactions de transcription sont passés sur un gel d&#39;agarose à 0,6%. M, 1 kb échelle d&#39;ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figure 6. infectivité spécifique des ARN transcrits à partir d&#39;une synthèse JEV BAC pleine longueur et la récupération de virus synthétique. Cellules BHK-21 sont maquette électroporation (Mock) ou électroporation avec les transcrits d&#39;ARN dérivés from chacun des deux clones indépendants de la pleine longueur JEV BAC (Cl.1 et CL.2). (A) ARN infectieux. Les cellules sont recouvertes avec de l&#39;agarose et colorés avec du cristal violet à 4 jours après la transfection. ARN infectieux est déterminée par des essais infectieuses du centre d&#39;estimer la quantité d&#39;ARN infectieuse électroporation dans les cellules (panneau de gauche). En outre, des images représentatives de centres infectieuses sont présentés (panneau de droite). (B) L&#39;expression de protéine. Les cellules sont cultivées dans des glissières de la chambre 4 puits. L&#39;expression des protéines virales dans les cellules de l&#39;ARN par électroporation à 20 h post-transfection (HPT) est analysée par des dosages d&#39;immunofluorescence en utilisant un antisérum de lapin anti-NS1 primaire et un anti-IgG de lapin de chèvre conjugué à Cy3 secondaire (rouge). Les noyaux sont contre-colorées avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (bleu). Les images d&#39;immunofluorescence sont superposées sur leurs différentiel correspondant des images à contraste d&#39;interférence. (C) Le rendement viral. Les cellules sont cultivées dans uneDes boîtes de culture de 50 mm. La production de virions infectieux accumulés dans les surnageants de culture de cellules d&#39;ARN-électroporation à 22 et 40 hpt est examiné par des dosages de la plaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ici, un protocole est présenté pour la création d’un chromosome artificiel bactérien infectieux contenant un ADNc pleine longueur de l’ARN génomique à brin positif du virus de l’encéphalite japonaise. Ce protocole peut être utilisé pour construire un ADNc fonctionnel d’autres virus à ARN à brin positif, ce qui en fait un outil génomique puissant pour l’étude de la biologie des virus.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l&#39;étude du brin positif de virus à ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

L'objectif général de cette procédure est de récupérer des particules virales infectieuses produites entièrement à partir d'un ADNc cloné de virus à ARN à brin positif, dont le génome possède la même polarité que l'ARNm cellulaire, comme le virus de l'encéphalite japonaise. Cette génétique inverse basée sur l'ADNc est une méthode fondamentale qui permet la manipulation directe de l'ARN génomique viral, permettant ainsi la génération de virus recombinants pour l'étude moléculaire et génétique de la réplication virale et de la pathogenèse. Cette technique fournit également une plateforme précieuse permettant le développement de vecteurs viraux vaccinales génétiquement définis pour la délivrance de gènes étrangers.Ces méthodes s'appliquent au clonage de l'ADNc complet pour des souches à ARN de polarité négative ou positive, en particulier pour les virus dont le génome dépasse 10 kb. Plusieurs membres de mon laboratoire démontreront la procédure : l'assistante de recherche Sang-Im Yun, les chercheurs postdoctorants Byung-Hak Song et Jin-Kyoung Kim, ainsi que l'étudiante de premier cycle Jordan Frank.La partie vidéo de cette publication couvre la préparation du chromosome artificiel bactérien contenant les séquences d'intérêt, la synthèse de l'ARN transcrit à partir du plasmide d'origine, ainsi que la mesure de l'infectiosité de l'ARN et du rendement viral. Toutes les procédures utilisées avant la génération du plasmide BAC sont décrites en détail dans le protocole écrit. Pour cette procédure, commencez par cultiver une colonie isolée d’E. coli DH10B, portant le plasmide BAC, dans trois millilitres de bouillon 2X YT contenant du chloramphénicol. Incubez la culture pendant 10 heures à 35 degrés Celsius sous agitation à 225-250 tr/min.Après 10 heures, augmenter l'échelle de la culture. Ensuite, inoculer 500 microlitres de culture dans 500 millilitres de milieu et cultiver l'inoculum pendant six heures avec agitation vigoureuse. Après six heures, centrifuger la culture bactérienne dans 2 bouteilles de 250 millilitres à 3 100 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Puis resuspendre chaque culot dans 30 millilitres de solution GTE.Ajouter 500 microlitres de lysozyme et incuber les suspensions sur de la glace pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparer une solution de lyse fraîche pour l'étape suivante. Après 10 minutes, ajouter 60 millilitres de la solution de lyse et mélanger en agitant doucement jusqu'à ce que la solution devienne limpide.Laisser les réactions se dérouler à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajouter 45 millilitres de solution de neutralisation dans chaque flacon et retourner les flacons jusqu'à ce qu'ils soient complètement mélangés. Puis les placer sur de la glace pendant 10 minutes.Recueillir les lysats neutralisés par centrifugation réfrigérée à haute force g. Ensuite, récupérer les surnageants dans deux nouveaux flacons de 250 millilitres. Ajouter 0,6 volume d’isopropanol à 100 % à chacun et les placer sur de la glace pendant 20 minutes.Ensuite, centrifuger les précipités, puis éliminer les surnageants et dissoudre les culots dans cinq millilitres de tampon TE. Combiner les deux volumes dans un seul tube de 50 millilitres et précipiter l'ARN en ajoutant un volume égal de chlorure de lithium à cinq molaire et en incubant une durée de 10 minutes sur de la glace. Utiliser une centrifugation froide de 20 minutes pour recueillir le précipité d'ARN.Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 250 millilitres, ajoutez deux volumes d'isopropanol à 100 % et placez le tube sur de la glace afin que le précipité d'ADN se forme. Après 20 minutes, centrifugez pour faire tomber le précipité, aspirez le surnageant, resuspendez le culot d'ADN dans 9,5 millilitres de tampon TE et transférez la solution d'ADN dans un tube de 50 millilitres.Poursuivez la préparation en mettant en place le gradient de chlorure de césium avec du bromure d'éthidium. Chargez le mélange dans un tube en polypropylène scellable à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de 18 gauge et scellez le tube. Faites tourner le tube scellé toute la nuit dans une ultracentrifugeuse afin de former un gradient de chlorure de césium.Le lendemain, récupérez une bande d'ADN de plasmide BAC à partir du gradient de chlorure de césium. Utilisez une aiguille de 18 gauge pour créer un orifice de ventilation en haut du gradient et une aiguille de 20 gauge munie d'une seringue pour prélever l'ADN BAC sur le côté du gradient, puis transférez le prélèvement dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Effectuez un lavage, ajoutez 2,5 volumes de butanol saturé en eau et mélangez par vortexage normal. Ensuite, centrifuger le mélange à température ambiante et transférer la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Répéter ce lavage un total de six fois afin d'éliminer tout le bromure d'éthidium. Précipiter maintenant l'ADN BAC. Ajouter un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M et 2,5 volumes d'éthanol à 100 % dans le tube. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifuger le précipité à température ambiante et laver le culot d'ADN avec un millilitre d'éthanol à 70 %. Répéter la centrifugation et récupérer à nouveau le culot. Enfin, sécher le culot d'ADN à l'air pendant 10 minutes et l'éluer dans 200 microlitres de tampon TE.Commencez par une digestion à grande échelle du plasmide BAC par l'enzyme de restriction Xba-one dans un volume total de 100 microlitres. Effectuez cette digestion à 37 degrés Celsius pendant 12 à 15 heures. Ensuite, poursuivez l'incubation de la digestion avec 25 unités supplémentaires de nucléase de haricot mungo à 30 degrés Celsius pendant deux heures.Après l'incubation, ajustez le volume à 300 microlitres avec de l'eau distillée. Effectuez ensuite une extraction au phénol en ajoutant un volume équivalent de phénol-chloroforme, alcool isoamylique à l'échantillon dilué, en vortexant vigoureusement pendant une minute, en centrifugeant le tube, puis en transférant la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.Ensuite, répétez l'extraction avec du chloroforme. Puis, récupérez l'ADN BAC linéarisé par précipitation à l'éthanol. Ramassez le culot d'ADN par centrifugation, jetez le surnageant et lavez le culot avec un millilitre d'éthanol à 70 %. Répétez l'étape de centrifugation et séchez le culot à l'air libre. Après 10 minutes de séchage, dissolvez le culot d'ADN dans 30 microlitres d'eau distillée. Ensuite, analysez un microlitre de l'ADN BAC récupéré sur un gel d'agarose à 0,8 %.Ensuite, préparez une transcription de type runoff de 25 microlitres d'ADN BAC linéarisé, incluant de l'UTP tritié pour la quantification de l'ARN. Effectuez la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure. Puis, analysez un ou deux microlitres de la réaction de transcription de type runoff sur un gel d'agarose à 0,6 %.Commencez avec des cellules BHK-21 cultivées pendant 24 heures dans des boîtes de 150 millimètres ensemencées à raison de 3 millions de cellules par boîte. Rincez la monocouche cellulaire avec la solution A froide, puis détachez les cellules par trypsination. Récupérez les cellules par centrifugation à 270 g pendant deux minutes.Ensuite, resuspendre les cellules dans 50 millilitres de solution A froide et les centrifuger à nouveau. Répéter ce lavage trois fois. Après le dernier lavage, resuspendre les cellules à une concentration de 20 millions par millilitre dans la solution A. Puis mélanger un aliquot de 400 microlitres de la suspension cellulaire avec deux microgrammes d'ARN synthétique dans une cuvette de deux millimètres.Électroporer rapidement le mélange dans des conditions optimales et laisser les cellules reposer pendant 10 minutes. Transférer ensuite les cellules dans un tube microfuge contenant 600 microlitres de milieu de culture complet. Préparer maintenant des dilutions sériées d’un facteur dix des cellules électroporées, dans des volumes d’un millilitre. Ensemencer 100 microlitres d’aliquote de chaque dilution sur des monocouches de cellules BHK21 normales. Après quatre à six heures d’incubation, recouvrir les cellules avec de l’agarose à 0,5 % dans le milieu MEM supplémenté en FBS et les cultiver pendant quatre jours supplémentaires.Des cellules BHK21 ont été soumises à une électroporation témoin ou à une électroporation avec des transcrits d'ARN dérivés de deux clones indépendants du JEV-BAC de longueur complète. Quatre jours plus tard, les cellules ont été colorées au violet de crésyl pour visualiser l'ARN infectieux dans les cellules. À l'aide de cette coloration, les centres infectieux ont été quantifiés. Ensuite, l'expression des protéines virales a été examinée dans les cellules électroporées avec l'ARN 20 heures après la transfection, en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-NS1 et un anticorps secondaire marqué au Cy3, apparaissant en rouge. Les noyaux ont été contre-colorés au DAPI, visible en bleu. Ultérieurement, à 22 et 40 heures après la transfection, la production de virions infectieux accumulés dans les surnageants de culture des cellules électroporées avec l'ARN a été analysée par des dosages de plaques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler un virus infectieux entièrement à partir d'un ADNc cloné d'une souche à ARN positif, comme le virus de l'encéphalite japonaise. N'oubliez donc pas que travailler avec le virus de l'encéphalite japonaise et d'autres agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux. Une formation adéquate en biosécurité est nécessaire avant d'effectuer cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La génomique des virus simples (SVG) est une méthode pour isoler et d'amplifier le génome de virions isolés. Suspensions virales d'un assemblage mixte sont triées par cytométrie de flux sur une lame de microscope, avec des puits discrètes contenant l'agarose, capturant ainsi le virion, et la réduction de cisaillement du génome au cours du traitement en aval. Amplification du génome entier est obtenue en utilisant une amplification par déplacement multiple (MDA) résultant en matériel génomique...

L&#39;isolement et l&#39;analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »

Source : Yun, S. et al. Chromosomes artificiels bactériens : un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude des virus à ARN simple brin positif. J. Vis. Exp. (2015)Ce vidéo montre la récupération du virus de l'encéphalite japonaise infectieux à partir d'ARN synthétique transcrit à partir d'un clone de chromosome artificiel bactérien. Elle illustre comment les cellules sont électroporées avec l'ARN synthétique, permettant au génome viral de diriger la production de nouvelles particules virales.

Recouvrement de virions infectieux à partir de cellules transfectées avec de l'ARN synthétique dérivé d'un chromosome artificiel bactérien

Nous présentons ici une nouvelle approche pour identifier les virus végétaux avec les génomes d’ADN double brin. Nous utilisons des méthodes standard pour extraire l’ADN et l’ARN de feuilles infectées et de réaliser le séquençage de prochaine génération. Outils bioinformatiques assemblent des séquences en contigs, identifient des contigs représentant les génomes de virus et affecter des génomes aux groupes taxonomiques.

Combinant l’analyse de l’ADN dans une Extraction de Virion brut avec l’analyse de l’ARN des feuilles infectées pour découvrir de nouveaux génomes de Virus

ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

La récente épidémie de virus Zika souligne l'importance d'établir des approches génétiques inversées pour mettre au point des vaccins et/ou des stratégies thérapeutiques. Ici, nous décrivons le protocole pour sauver un virus Zika recombinant infectieux d'un clone d'ADNc pleine longueur assemblé dans un chromosome artificiel bactérien sous le contrôle du promoteur humain de cytomégalovirus immédiatement-tôt.

Sauvetage du virus Zika recombinant d'un clone d'ADNc chromosomique artificiel bactérien

Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N0)pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).

Génération et assemblage de nucléoopsides spécifiques au virus du virus respiratoire syncytial

Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.

La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3' des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

Nous décrivons une méthode efficace pour séparer l'ADN simple brin, double brin de l'ADN et des molécules d'ARN à partir de l'environnement communautés virales. Les acides nucléiques sont fractionnés par chromatographie d'hydroxyapatite avec des concentrations croissantes de phosphate contenant du tampon. Cette méthode permet l'isolement de tous les types d'acides nucléiques viraux dans des échantillons environnementaux.

Séparation de l&#39;ADN simple brin, double brin de l&#39;ADN et l&#39;ARN à partir d&#39;un environnement communautaire viral en utilisant chromatographie d&#39;hydroxyapatite

Découvrez comment créer un chromosome artificiel bactérien infectieux contenant l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise. Cette méthode permet d'étudier la biologie virale et de développer des vaccins génétiquement définis.

Bactérienne Artificial Chromosomes: Un outil de génomique fonctionnelle pour l'étude du brin positif de virus à ARN

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