Rapid

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une hybridation in situ rapide sur un tissu cérébral préfixé au paraformaldéhyde. Cela est accompli en premier lieu en déshydratant des sections de tissu cérébral et en traitant ces sections avec les réactifs de prétraitement un, deux et trois. La deuxième étape consiste à hybridater les sections avec des sondes oligonucléotidiques primaires, puis avec les sondes secondaire, troisième et quatrième.

Ensuite, ajoutez le substrat rouge rapide pour détecter l'ARN cible. La dernière étape consiste à quantifier le niveau des signaux d'ARNm à l'aide du logiciel Image J. En définitive, les variations de l'expression génique de l'ARN peuvent être obtenues en comparant les groupes expérimental et témoin.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle est relativement simple, peu coûteuse, reproductible et qu'elle prend moins de deux jours à réaliser. Ce travail a été développé par mes soins et par John Jay Lenan de l'École de médecine vétérinaire de Ross University, ainsi que par Jean Soza et RU Tao du Collège de médecine de l'Université atlantique de Floride. Dans cette procédure, prélevez quatre lames à partir de boîtes à lames conservées dans l'enceinte congelée à moins 80 degrés Celsius.

Attribuez les sections aux tests de P-P-I-B-D-A-P-B et de HT, deux gènes A marqueurs, et étiquetez-les avec un stylo à bille. Ensuite, immergez les lames dans de l'alcool à 100 % à température ambiante pendant cinq minutes. Puis faites sécher les lames pendant cinq minutes dans la hotte aspirante ; pour le prétraitement, pipetez 20 microlitres du réactif de prétraitement 1 sur chaque section, puis placez les lames sur un support en rangée dans un plateau humide.

Agiter doucement le plateau d'humidité sur un agitateur horizontal à faible vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, rincer les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes. Plonger les lames dans un bécher de 1000 millilitres contenant 450 millilitres du réactif de prétraitement deux.

Ensuite, faire bouillir les lames pendant cinq minutes au total à 100 degrés Celsius afin de restaurer la structure de l'ARN. Après cela, laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes à chaque fois. Placer les lames dans de l'alcool à 100 % pendant cinq minutes.

Ensuite, faites sécher les lames pendant cinq minutes. Dans la hotte, utilisez un stylo hydrophobe pour tracer un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section tissulaire. Ensuite, pipetez 10 microlitres du réactif de prétraitement trois sur chaque zone sélectionnée afin d'augmenter la pénétration de la sonde, puis couvrez le plateau d'humidité avec un couvercle.

Ensuite, placer le plateau dans l'étuve d'hybridation équipée d'un agitateur horizontal. Régler la température de l'étuve à 40 degrés Celsius et agiter doucement le plateau pendant 30 minutes. Par la suite, laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes à chaque fois. À cette étape, pipeter 10 microlitres de la sonde P-P-I-B-D-A-P-B ou HTR deux A sur les zones sélectionnées.

Ensuite, recouvrez le plateau d'humidité avec un couvercle afin d'éviter l'évaporation du réactif. Agitez doucement les lames sur un agitateur horizontal à faible vitesse tout en les incubant à 40 degrés Celsius dans l'étuve pendant deux heures. Puis, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage, deux minutes à chaque fois, et ajoutez 10 microlitres du réactif d'amplification un sur chaque zone sélectionnée à l'aide d'une pipette.

Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois, puis pipeter 10 microlitres du réactif d'amplification deux sur chaque zone sélectionnée. Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. À chaque fois, ajouter 10 microlitres du réactif d'amplification trois sur chaque zone sélectionnée. Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajoutez à la pipette 10 microlitres du réactif d'amplification quatre sur chaque zone sélectionnée. Agitez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajoutez 10 microlitres du réactif d'amplification cinq sur chaque zone sélectionnée à l’aide d’une pipette. Agitez doucement et incubez les lames à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajouter 10 microlitres du réactif d'amplification six sur chaque zone sélectionnée à l’aide d’une pipette. Agiter doucement et incuber les lames à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois. Maintenant, pipeter 10 microlitres du réactif rouge sur chaque zone sélectionnée, placer les lames dans le plateau d'humidité sur l'agitateurb horizontal à température ambiante et agiter doucement à faible vitesse pendant 10 minutes. Puis laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant 10 minutes.

À chaque fois, séchez les lames à 60 degrés Celsius dans l’étuve pendant 15 minutes. Ensuite, placez les lames dans le xylène sous la hotte aspirante pendant cinq minutes. Puis, ajoutez à la pipette 20 microlitres de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et recouvrez avec une lame couvre-objet.

Dans cette étape, faites glisser et déposez le fichier image dans la fenêtre principale de l'image J. Allez dans la barre de menu et sélectionnez image. Ensuite, sélectionnez type dans le menu déroulant et choisissez huit bits.

Ensuite, sélectionnez l'option de réglage, puis sélectionnez le seuil pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de la barre inférieure dans la boîte de dialogue de manière à éliminer le fond indésirable. Allez dans la barre de menu et sélectionnez Analyser, puis sélectionnez analyser les particules pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue.

Réglez la taille des particules à 10. Ensuite, sélectionnez « afficher les contours » et cochez « afficher les résultats » et « résumer les cases ». Enfin, cliquez sur « OK » pour visualiser les données des particules dans les boîtes de dialogue.

Pour le calcul à l’aide d’un tableur, saisissez les données dans la feuille Excel et faites la moyenne du nombre de particules dans le groupe au sérum physiologique comme valeur de référence. Calculez ensuite le niveau en pourcentage de chaque section et tracez un graphique en conséquence. Voici les images en microscopie optique des signaux d'hybridation indiqués par les points rouges.

Les tissus ont été préfixés avec du paraformaldéhyde chez des rats profondément anesthésiés, préalablement traités au sérum physiologique et à la MDMA. Les sondes oligonucléotidiques utilisées sont D-A-P-B-P-P-I-B et HT deux A. Cette figure montre l'effet sur l'expression génique hypothalamique de HT deux A chez des rats préalablement traités à la MDMA ; une réduction de 20 % de l'expression de HT deux A a été observée. Cette technique facilite pour les chercheurs du domaine des neurosciences la mesure de l'expression génique des ARN messagers, en utilisant l'hybridation in situ sur les tissus cérébraux préfixés au paraformaldéhyde.