Name: Rapid In Situ Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez une méthode rapide d'hybridation in situ pour tissus cérébraux de rats préfixés au paraformaldéhyde, utilisant des sondes oligonucléotidiques ciblant le gène htr2a. Cette technique simplifiée permet de quantifier l'expression génique en moins de deux jours.

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Cette étude a été soutenue par la subvention du NIH (R15DA029863), la subvention Florida Atlantic University de recherche de premier cycle (M30014) et de l&#39;École de médecine vétérinaire de subvention de recherche Ross University. Nous tenons à remercier l&#39;Institut national sur l&#39;abus des drogues (Rockville, MD) pour fournir (±) 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ±) pour ce travail.

Les procédures d&#39;utilisation des animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;école de médecine vétérinaire de l&#39;Université de Ross et Florida Atlantic University. Bien que les techniques stériles et des gants sont nécessaires, l&#39;environnement RNase-free est pas nécessaire lors de l&#39;utilisation de ce protocole. 1. Préparation <ol><li> Préparation des tissus et de sectionnement <ol><li> Attribuer des rats au hasard en trois groupes: les frais / solution saline (SAL; NaCl 0,9%), le préfixe / SAL et préfixés / 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA; voir détails dans le tableau 1). </li><li> Administrer trois doses de 1 ml / kg SAL et 10 mg / kg par voie intrapéritonéale MDMA, respectivement, pour les groupes SAL et MDMA à intervalle de 2 h. Permettre aux animaux de survivre le traitement pendant 6 jours. </li><li> Au jour 7, administrer 100 mg / kg de kétamine en combinaison de 5 mg / kg par voie intrapéritonéale xylazine aux rats pour une anesthésie profonde (ie, la perte de clignotement de la cornée et tail pincer réflexes). </li><li> Pour le groupe frais / SAL, décapiter rapidement rats et enlever le cerveau pour le test de cerveau frais (voir les détails dans la référence 5). </li><li> Pour les groupes / MDMA préfixés / SAL et préfixés, faire une coupe le long du sternum environ 10 -12 cm et ensuite exposer l&#39;extrémité du sternum. </li><li> Maintenez l&#39;extrémité du sternum avec une pince hémostatique et couper la membrane latéralement des deux côtés avec des ciseaux pointus et ensuite coupé vers le haut à travers les côtes et en parallèle vers les poumons. </li><li> Avec une main, tenir la pointe ventrale du cœur avec une petite pince. Avec l&#39;autre main, percer le ventricule gauche avec une aiguille de calibre 18 de la seringue (noter le côté de l&#39;adaptateur de l&#39;aiguille est reliée à un tuyau de silicium en forme de Y Sal et paraformaldéhyde conteneurs glacées et les pompes péristaltiques, voir la référence 9). </li><li> Tournez sur la pompe de SAL au niveau moyen de la vitesse d&#39;écoulement (~ 5 ml / min) et à la perforation de l&#39;oreillette droite avec la pince pour permettre l&#39;évasion de retour circulation. Maintenir SAL perfusion pendant 30 min. </li><li> Tournez sur la pompe de paraformaldéhyde au niveau moyen et laissez la glace-paraformaldéhyde 4% froid pour perfuser l&#39;animal pendant 30 min. </li><li> Retirer l&#39;instrument de perfusion et de décapiter l&#39;animal. Faire un postéro couper à travers la ligne médiane du crâne, puis battre le crâne pour exposer la cavité du crâne 10. </li><li> Retirer le cerveau avec une spatule à partir de la cavité du crâne et du cerveau placer dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de paraformaldehyde à 4%. Gardez le cerveau dans le tube contenant paraformaldéhyde à 4 ºC réfrigérateur pendant 24 h. </li><li> Déplacer le cerveau dans un tube centrifuge de 50 ml contenant 25 ml de solution de saccharose à 30% à 4 ° C pendant 3 jours. Enfin, stocker le cerveau dans les sacs en plastique à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Montez le cerveau sur un mandrin avec intégration des médias et de geler les médias enrobage contenant cerveau dans un cryostat à une température de -26 ºC. Couper le gelé fraisn cerveau cerveau en 20 sections um et le paraformaldéhyde-préfixés en sections de 10 um. Transférer la section à une lame de microscope RT en touchant la diapositive à la section. </li><li> Air sec à température ambiante pendant 4 h. Conserver les diapositives de section dans un sac étanche scellée à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Prenez diapositives de la -80 ° C congélateur et attribuer des sections dans une des trois tests: HT2A, PPIB (contrôle positif) ou dapB (contrôle négatif); marque et sections de l&#39;étiquette avec un stylo à bille (ne pas utiliser un crayon). Plonger les lames dans 100% d&#39;alcool à la température ambiante pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans une hotte. </li></ol></li><li> Prétraitement <ol><li> Pipette 20 pl du réactif de prétraitement-1 (inactivation de la phosphatase alcaline) aux coupes sur des lames. Placer les lames sur un rail de support d&#39;une plaque à l&#39;humidité (à noter que le plateau est recouvert d&#39;un couvercle afin de maintenir une humidité élevée pour empêcher l&#39;évaporation à partir de la réaction de solution). </li><li> Secouer doucement le plateau de l&#39;humidité sur un agitateur horizontal à basse vitesse pendant 10 min. Laver les lames à deux reprises avec de l&#39;eau distillée deux fois (ddH 2 O) pendant 2 min. Immerger la lame dans un bécher de 200 ml contenant 150 ml du réactif de prétraitement-2 (rupture des liaisons transversales induites par paraformaldéhyde fixation). Faire bouillir les diapositives pour un total de 5 min à 100 ° C (de restauration induite par la chaleur de la structure de l&#39;ARN 11). </li><li> Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. Placer les lames dans alcool à 100% pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans la hotte. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section de tissu (par exemple, des structures non-corticales, y compris le thalamus et l&#39;hypothalamus comme indiqué dans la figure 2). </li><li> Pipette 10 ul du prétraitement-3 réactif (augmentation du taux de pénétration de la sonde) à chaque zone sélectionnée, et couvrent le plateau de l&#39;humidité avec le couvercle. Placer le plateau dans le four à hybridationéquipé du agitateur horizontal et régler la température du four à 40 ºC; secouer doucement le plateau pendant 30 min. Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;hybridation et d&#39;amplification <ol><li> Pipette 10 ul de TR2A, PPIB et dapB réactifs de sonde, respectivement, sur les zones sélectionnées. Couvrir le bac d&#39;humidité avec le couvercle pour empêcher l&#39;évaporation du réactif. Secouer doucement sur l&#39;agitateur horizontal réglé à une vitesse faible. Incuber les lames à 40 ° C dans le four pendant 2 heures. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif d&#39;amplification-1 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-2 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min. </li><li> Laver les lames à deux reprises wvec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-3 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-4 de chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-5 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-6 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 15 min. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. </li></ol> 3. Signal Detection <ol><li> Introduire à la pipette 10 ul du réactif rouge à chaque région sélectionnée (A noter que le réactif est un mélange de rouge et rouge-B-A dans un rapport 1:60 et doit être utilisé immédiatement). Placer la lame dans le bac d&#39;humidité sur le agitateur horizontal à température ambiante et agiter doucement à basse vitesse pendant 10 min. </li><li> Laver les lames deux fois avec (ddH 2 O) pendant 10 min. Sécher les lames à 60 ° C dans le four pendant 15 min. Placer les lames dans le xylène sous la hotte pendant 5 min. Pipette 20 ul de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et couvrir avec une lamelle. </li></ol> 4. Capture d&#39;image <ol><li> Prenez microphotographies numériques des zones sélectionnées (par exemple, l&#39;hypothalamus, les figures 1 et 3) avec un grossissement de 4 × 20 × et des lentilles d&#39;objectif. Enregistrez le fichier d&#39;image. </li></ol> 5. Analyse des particules de l&#39;image <ol><li> Glissez et déposez le fichier de l&#39;image dans la fenêtre principale de ImageJ. Allez à la barre de menu et sélectionnez &#39;Image&#39;, suivant, sélectionnez &quot;Type&quot; dans le menu déroulant, puis sélectionnez &#39;8-bit&#39;. </li><li> Sélectionnez «Réglage», puis sélectionnez «Threshold &#39;pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de barre inférieure dans la boîte de dialogue afin que le fond indésirable est retiré. Allez à la barre de menu et sélectionnez «Analyser», puis sélectionnez «analyser des particules &#39;pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue. </li><li> Régler la taille des particules à 10, sélectionner la prochaine &#39;Show présente »et sélectionnez« Afficher les résultats »et« boîtes Résumer&#39;. Enfin, cliquez sur «OK» pour afficher les données de particules dans les boîtes de dialogue. </li></ol> 6. Calcul Spreadsheet <ol><li> Saisissez les données dans la feuille Excel et en moyenne le nombre de particules dans le groupe SAL comme base de référence. Calculer le niveau de pourcentage de chaque section et faire un graphique en conséquence (Figure 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
<li>Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-ethylmaleimide+%28NEM%29+can+significantly+improve+in+situ+hybridization+results+using+35S-labeled+oligodeoxynucleotide+or+complementary+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes.</a> J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diag%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> J Vis E. , (2014).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+E%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis E. , (2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pericytes+and+capillary+diameter+in+brain+slices+and+isolated+retinae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proto%22%5BJournal%5D)">Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae.</a> Nat Proto. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytoche%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).</li>
<li>Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+rat+dentate+granule+cells%3A+comparison+between+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Method%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue.</a> J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).</li>
<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’une des principales préoccupations des essais d’hybridation in situ est de choisir les techniques appropriées utilisées pour la conservation de l’ARN en raison des enzymes RNase. Il est bien connu que ces enzymes sont largement présentes dans les cellules et l’environnement, ce qui peut affecter les résultats. Cependant, l’activité enzymatique peut être rapidement distinguée en plaçant le tissu dans la solution de glace carbonique/alcool5,12. Bien que la conservation rapide soit essentielle pour l’h...

<classe p = 'jove_content'> syndrome de sérotonine (5-hydroxytryptamine ; 5-HT) est un trouble neurologique aigu causé par des drogues favorisant la 5-HT telles que les antidépresseurs1, tout en survenant également dans des situations d’utilisation de MDMA à des fins récréatives2. Les mécanismes moléculaires responsables des sautes d’humeur, des déficits d’apprentissage et de mémoire qui se produisent en association avec le syndrome aigu ne sont pas bien compris3,4. L’hybridation in situ est un outil de recherche puissant permettant la détection et la quantification d’ARNm spécifiques exprimés potentiellement à l’échelle d’une cellule unique. La méthode conventionnelle d’hybridation in situ consiste à utiliser un riboprobe marqué radioactif qui hybride spécifiquement le gène d’intérêt. Cependant, un inconvénient majeur est que la méthode nécessite des étapes de préparation et d’hybridation de sonde compliquées et longues, ainsi que l’accès à des tissus frais congelés conservés dans un environnement exempt deRNase 5,6. 
<Des sondes oligonucléotidiques ont récemment été développées pour hybrider des fragments d jove_content>'ARN plus courts que ceux requis pour les ribopsondes7. De plus, les sondes produisent un signal de fond faible sans sacrifier la spécificité8. Cette nouvelle technologie de sonde peut être utilisée pour l’hybridation in situ sur des tissus cérébraux préfixés au paraformaldéhyde couramment disponibles dans les laboratoires d’immunocytochimie.
Ici, nous décrivons un protocole d’hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques sur le cerveau de rat préfixé au paraformaldéhyde et comparons les résultats avec ceux observés dans un cerveau fraîchement congelé5,6. Ce protocole est utilisé pour tester l’hypothèse selon laquelle l’abus de substances MDMA provoque des modifications de l’ARNm htr2a du gène du récepteur 5-HT2A dans le cerveau. Nous avons commencé la procédure par un traitement à la MDMA suivi d’une perfusion tissulaire de paraformaldéhyde de l’animal, d’une hybridation in situ de la sonde thr2a et d’une analyse des données. Notez que dapB (le gène bactérien codant pour la dihydrodipicolinate réductase) est utilisé comme contrôle négatif, et ppiB (gène d’entretien codant pour la peptidylprolyl isomérase B) comme contrôle positif.

<table><tbody><tr><td>RNAscope Negative Control Probe-DapB</td><td>Advanced cell diagnostic, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>Advanced cell diagnostic, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red</td><td>Advanced cell diagnostic, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Ppib</td><td>Advanced cell diagnostic, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>Diagnostic cellulaire avancé, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur horizontal</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lame de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid<em&gt; in situ</em&gt; hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur brain paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

< toxicité de la classe p = 'jove_content'>3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ; ecstasy) peut provoquer des modifications spécifiques à la région de l’expression de l’ARNm sérotoninergique en raison du syndrome aigu de sérotonine (5-hydroxytryptamine ; 5-HT). Cette hypothèse peut être testée en utilisant l’hybridation in situ pour détecter le gène htr2a du récepteur de la sérotonine 5-HT2A. Dans le passé, de telles procédures, utilisant du ribopobbe radioactif, étaient difficiles en raison du flux de travail compliqué qui nécessitait plusieurs jours et de la difficulté supplémentaire que la technique nécessitait l’utilisation de tissus frais congelés conservés dans un environnement exempt de RNase. Récemment, le développement de courtes sondes oligonucléotidiques a simplifié les procédures d’hybridation in situ et a permis l’utilisation de coupes cérébrales préfixées par le paraformaldéhyde, qui sont plus largement disponibles en laboratoire. Ici, nous décrivons un protocole détaillé utilisant des sondes oligonucléotidiques non radioactives sur les tissus cérébraux préfixés. Les sondes d’hybridation utilisées pour cette étude comprennent dapB (un gène bactérien codant pour la dihydrodipicolinate réductase), ppiB (un gène d’entretien codant pour la peptidylprolyl isomérase B) et htr2a (un gène de la sérotonine codant pour les récepteurs 5-HT2A). Cette méthode est relativement simple, bon marché, reproductible et nécessite moins de deux jours.

En utilisant les sondes d&#39;ARN oligonucléotidique (&lt;25 nt), l&#39;hybridation peut être détectée sous forme de points rouges dans les cellules de l&#39;hypothalamus préparés à partir de cerveaux congelés paraformaldehyde préfixée et frais. Les molécules d&#39;ARNm HTR2A sont présents dans certaines cellules (indiquées par les flèches solides), mais pas d&#39;autres (flèches ouvertes). Nous avons observé qu&#39;il n&#39;y a pas de différence entre le paraformaldehyde préfixée et les tissus congelés frais <...

Ce protocole décrit une méthode d’hybridation in situ rapide et simplifiée idéale pour les cerveaux préfixés au paraformaldéhyde, réduisant ainsi le besoin d’étapes complexes prolongées lors de l’utilisation de tissus frais congelés. La méthode est validée par l’identification du gène htr2a du récepteur de la sérotonine 5-HT2A chez le rat.

Rapid<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une hybridation in situ rapide sur un tissu cérébral préfixé au paraformaldéhyde. Cela est accompli en premier lieu en déshydratant des sections de tissu cérébral et en traitant ces sections avec les réactifs de prétraitement un, deux et trois. La deuxième étape consiste à hybridater les sections avec des sondes oligonucléotidiques primaires, puis avec les sondes secondaire, troisième et quatrième.Ensuite, ajoutez le substrat rouge rapide pour détecter l'ARN cible. La dernière étape consiste à quantifier le niveau des signaux d'ARNm à l'aide du logiciel Image J. En définitive, les variations de l'expression génique de l'ARN peuvent être obtenues en comparant les groupes expérimental et témoin.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle est relativement simple, peu coûteuse, reproductible et qu'elle prend moins de deux jours à réaliser. Ce travail a été développé par mes soins et par John Jay Lenan de l'École de médecine vétérinaire de Ross University, ainsi que par Jean Soza et RU Tao du Collège de médecine de l'Université atlantique de Floride. Dans cette procédure, prélevez quatre lames à partir de boîtes à lames conservées dans l'enceinte congelée à moins 80 degrés Celsius.Attribuez les sections aux tests de P-P-I-B-D-A-P-B et de HT, deux gènes A marqueurs, et étiquetez-les avec un stylo à bille. Ensuite, immergez les lames dans de l'alcool à 100 % à température ambiante pendant cinq minutes. Puis faites sécher les lames pendant cinq minutes dans la hotte aspirante ; pour le prétraitement, pipetez 20 microlitres du réactif de prétraitement 1 sur chaque section, puis placez les lames sur un support en rangée dans un plateau humide.Agiter doucement le plateau d'humidité sur un agitateur horizontal à faible vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, rincer les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes. Plonger les lames dans un bécher de 1000 millilitres contenant 450 millilitres du réactif de prétraitement deux.Ensuite, faire bouillir les lames pendant cinq minutes au total à 100 degrés Celsius afin de restaurer la structure de l'ARN. Après cela, laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes à chaque fois. Placer les lames dans de l'alcool à 100 % pendant cinq minutes.Ensuite, faites sécher les lames pendant cinq minutes. Dans la hotte, utilisez un stylo hydrophobe pour tracer un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section tissulaire. Ensuite, pipetez 10 microlitres du réactif de prétraitement trois sur chaque zone sélectionnée afin d'augmenter la pénétration de la sonde, puis couvrez le plateau d'humidité avec un couvercle.Ensuite, placer le plateau dans l'étuve d'hybridation équipée d'un agitateur horizontal. Régler la température de l'étuve à 40 degrés Celsius et agiter doucement le plateau pendant 30 minutes. Par la suite, laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant deux minutes à chaque fois. À cette étape, pipeter 10 microlitres de la sonde P-P-I-B-D-A-P-B ou HTR deux A sur les zones sélectionnées.Ensuite, recouvrez le plateau d'humidité avec un couvercle afin d'éviter l'évaporation du réactif. Agitez doucement les lames sur un agitateur horizontal à faible vitesse tout en les incubant à 40 degrés Celsius dans l'étuve pendant deux heures. Puis, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage, deux minutes à chaque fois, et ajoutez 10 microlitres du réactif d'amplification un sur chaque zone sélectionnée à l'aide d'une pipette.Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois, puis pipeter 10 microlitres du réactif d'amplification deux sur chaque zone sélectionnée. Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. À chaque fois, ajouter 10 microlitres du réactif d'amplification trois sur chaque zone sélectionnée. Agiter et incuber les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajoutez à la pipette 10 microlitres du réactif d'amplification quatre sur chaque zone sélectionnée. Agitez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, lavez les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajoutez 10 microlitres du réactif d'amplification cinq sur chaque zone sélectionnée à l’aide d’une pipette. Agitez doucement et incubez les lames à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes. Ajouter 10 microlitres du réactif d'amplification six sur chaque zone sélectionnée à l’aide d’une pipette. Agiter doucement et incuber les lames à température ambiante pendant 15 minutes.Ensuite, laver les lames deux fois avec le tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois. Maintenant, pipeter 10 microlitres du réactif rouge sur chaque zone sélectionnée, placer les lames dans le plateau d'humidité sur l'agitateurb horizontal à température ambiante et agiter doucement à faible vitesse pendant 10 minutes. Puis laver les lames deux fois avec de l'eau doublement distillée pendant 10 minutes.À chaque fois, séchez les lames à 60 degrés Celsius dans l’étuve pendant 15 minutes. Ensuite, placez les lames dans le xylène sous la hotte aspirante pendant cinq minutes. Puis, ajoutez à la pipette 20 microlitres de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et recouvrez avec une lame couvre-objet.Dans cette étape, faites glisser et déposez le fichier image dans la fenêtre principale de l'image J. Allez dans la barre de menu et sélectionnez image. Ensuite, sélectionnez type dans le menu déroulant et choisissez huit bits.Ensuite, sélectionnez l'option de réglage, puis sélectionnez le seuil pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de la barre inférieure dans la boîte de dialogue de manière à éliminer le fond indésirable. Allez dans la barre de menu et sélectionnez Analyser, puis sélectionnez analyser les particules pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue.Réglez la taille des particules à 10. Ensuite, sélectionnez « afficher les contours » et cochez « afficher les résultats » et « résumer les cases ». Enfin, cliquez sur « OK » pour visualiser les données des particules dans les boîtes de dialogue.Pour le calcul à l’aide d’un tableur, saisissez les données dans la feuille Excel et faites la moyenne du nombre de particules dans le groupe au sérum physiologique comme valeur de référence. Calculez ensuite le niveau en pourcentage de chaque section et tracez un graphique en conséquence. Voici les images en microscopie optique des signaux d'hybridation indiqués par les points rouges.Les tissus ont été préfixés avec du paraformaldéhyde chez des rats profondément anesthésiés, préalablement traités au sérum physiologique et à la MDMA. Les sondes oligonucléotidiques utilisées sont D-A-P-B-P-P-I-B et HT deux A. Cette figure montre l'effet sur l'expression génique hypothalamique de HT deux A chez des rats préalablement traités à la MDMA ; une réduction de 20 % de l'expression de HT deux A a été observée. Cette technique facilite pour les chercheurs du domaine des neurosciences la mesure de l'expression génique des ARN messagers, en utilisant l'hybridation in situ sur les tissus cérébraux préfixés au paraformaldéhyde.

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Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Cette vidéo démontre la détection de la synthèse de l’ARN du récepteur de la sérotonine à l’aide de sondes oligonucléotidiques dans le tissu cérébral du rat affecté par le syndrome sérotoninergique. Le protocole comprend le prétraitement tissulaire, l’hybridation de sondes et la détection enzymatique pour visualiser et quantifier l’expression de l’ARN du récepteur de la sérotonine au microscope.

Hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques pour étudier l’expression de l’ARN dans des sections de cerveau de rat

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence  avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016). Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à...

 Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

La localisation de l’expression génique sur des types de cellules spécifiques peut être difficile en raison de l’absence d’anticorps spécifiques. Nous décrivons ici un protocole de triple détection simultanée de l’expression génique en combinant l’hybridation in situ d’ARN à double fluorescence avec l’immunomarquage.

Combinant Double Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation avec Immunomarquage pour la détection de l&#39;expression de trois gènes chez la souris Sections du cerveau

Nous avons appliqué une stimulation magnétique transcrânienne répétitive (rTMS) à l’hémisphère unilatéral du cerveau du rat, en plaçant une bobine en forme de 8 de 25 mm à 1 cm du sommet sur la ligne biauriculaire et en angulant la bobine de 45°. Un système de refroidissement par eau interne a été utilisé pour le rTMS pendant plus de 20 min.

Répétitif stimulation magnétique transcrânienne à l&#39;Unilatérale hémisphère de cerveau de rat

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.

Combinaison de l’hybridation in situ par fluorescence multiplex avec l’immunohistochimie fluorescente sur des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées ou fixes

DetectSyn est un test fluorescent rapide et impartial qui mesure les changements dans le nombre relatif de synapses (engagement pré- et postsynaptique) entre les traitements ou les états pathologiques. Cette technique utilise une technique de ligature de proximité qui peut être utilisée à la fois dans les neurones cultivés et les tissus fixes.

DetectSyn: Une méthode fluorescente rapide et impartiale pour détecter les changements dans la densité des synapses

Nous avons mis au point un test d’hybridation in situ Duplex pour cartographier les isoformes IR-A et IR-B des récepteurs de l’insuline dans le plexus choroïde murin, surmontant ainsi les limites des méthodes traditionnelles. Cette approche à haute résolution révèle l’expression spécifique des isoformes, offrant de nouvelles perspectives sur la signalisation de l’insuline cérébrale et les thérapies potentielles ciblées sur les isoformes pour les troubles neurologiques.

Visualisation précise des récepteurs A et B de l’insuline dans le cerveau murin avec un test d’hybridation in situ de l’ARN

Découvrez une méthode rapide d'hybridation in situ pour tissus cérébraux de rats préfixés au paraformaldéhyde, utilisant des sondes oligonucléotidiques ciblant le gène htr2a. Cette technique simplifiée permet de quantifier l'expression génique en moins de deux jours.

Rapid In Situ Hybridation utilisant sondes oligonucléotidiques sur Brain Paraformaldéhyde préfixée de rats avec syndrome sérotoninergique (Vidéo) | JoVE Journal

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