Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca 2+ Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé
10 septembre 2015
Cet article décrit le protocole détaillé et l'équipement nécessaire pour une double cartographie optique du potentiel transmembranaire (V m) et d'une connexion intra-réticulum sarcoplasmique (SR) Ca 2+ dans le coeur de lapin Langendorff perfusé. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de V m et SR Ca 2+ dynamique dans le coeur intact.
L’objectif global de cette procédure est de cartographier simultanément optiquement le réticulum intrasarcoplasmique libre, le calcium et le potentiel transmembranaire dans le cœur de lapin isolé intact et isolé perfusé de LOR. Ceci est accompli en excisant d’abord le cœur de lapin et en canulant l’aorte pour la perfusion rétrograde de lanor. La deuxième étape consiste à éliminer la contraction en ajoutant une contraction d’excitation se désolidarisant au perfu huit.
Ensuite, la perfusion est commutée sur une boucle de recirculation de petit volume et un indicateur de calcium de faible affinité est ajouté à température ambiante. Les dernières étapes consistent à réchauffer le cœur à 37 degrés Celsius à l’aide de la boucle de profusion de grand volume et à ajouter le colorant sensible à la tension. Ainsi, au cours de l’expérience, les changements dans le calcium et le potentiel transmembranaire sont mesurés en excitant le cœur avec de la lumière bleue et en mesurant la lumière émise avec des caméras CM OS à grande vitesse.
Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet aux chercheurs de sonder directement le réticulum sarcoplasmique ou SR pour une dynamique calcique courte sans interférence des signaux calciques transmembranaires. Cette méthode peut également aider à répondre à des questions clés liées au rôle de la manipulation du calcium SR dans la contribution aux arythmies, car le potentiel transmembranaire est enregistré simultanément avec le calcium SR, Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car les signaux optiques de calcium SR sont de très faible amplitude. Par conséquent, le bon chargement de l’indicateur de calcium est essentiel Pour ce protocole, il est nécessaire d’avoir à portée de main une solution de tyro fraîchement préparée.
Quatre litres suffiront. Ne mélangez pas les solutions mères concentrées sans dilution. Préparez également les autres solutions à l’avance comme indiqué dans la bulle de protocole de texte l’alimentation des tyros avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone, et ajustez le débit de gaz pour régler le pH de la solution très proche de 7,4.
La solution doit être à température ambiante. Préparez le système de perfusion L andorf à recirculation en plaçant un filtre en nylon en ligne avec des pores de 11 microns pour filtrer le perfu sate. Maintenant, amorcez le système de profusion principal avec environ deux litres de tyros oxygénés.
Le volume total de deux litres comprend la solution dans le réservoir. Ensuite, préparez et amorcez une courte ligne de profusion qui contourne le réservoir de solution afin de créer une boucle de profusion à recirculation de petit volume pour la grippe oh cinq N am. En téléchargeant, le volume total dans le système de recirculation plus petit doit être d’environ 150 millilitres.
Pour préparer le système de surveillance de la pression, connectez un transducteur de pression à la conduite de profusion et connectez la sortie du transducteur à un amplificateur trans bridge. Allumez maintenant le système d’acquisition de données. Réglez-le pour surveiller en permanence l’ECG et la pression de profusion.
Ensuite, ajustez la pression de perfusion de base à zéro millimètre de mercure. Enfin, alignez la caméra de cartographie optique comme décrit dans le protocole texte. Pour commencer, fixez le lapin et anesthésiez-le avec du pentobarbital, ainsi qu’un bolus de 1000 unités d’héparine.
Couvrez les yeux pour calmer le lapin. Commencez par une incision médiane pour exposer le sternum et les côtes à l’aide de ciseaux à bout émoussé. Coupez le sternum entre le xiphoïde et le meibum.
Ensuite, ouvrez soigneusement le sternum sans endommager le cœur et écartez les côtes pour exposer le cœur. Ensuite, retirez rapidement tout le bloc cœur-poumon en coupant tous les vaisseaux et tissus environnants. Transférez le bloc cœur-poumon dans environ 100 millilitres de solution tyro glacée.
Dans le bloc de tissu excisé, localisez l’aorte et coupez l’aorte ascendante juste à proximité des trois branches de l’arc aortique. Ensuite, canulez l’aorte avec la canule de calibre huit attachée au système de profusion. Fixez l’aorte à la canule avec un morceau de suture en soie USP zéro.
Après avoir fixé la canule, disséquez soigneusement la trachée, les poumons et la graisse épicardique. Ensuite, identifiez la valve mitrale et utilisez soigneusement des pinces et des ciseaux tranchants pour endommager ou retirer un feuillet. Ainsi, une congestion de solution dans le ventricule gauche ne peut pas se produire.
Continuez en immergeant le cœur dans la chambre de perfusion horizontalement avec le côté antérieur vers le haut. Placez la canule sur un morceau de sain. Fixez la canule avec des broches en forme de U insérées à travers le morceau de sard et dans le fond en silicone du plat de perfusion.
Cela empêchera le cœur de bouger. Lors de l’imagerie, une petite épingle à insectes peut être utilisée pour stabiliser l’apex si nécessaire, mesurer la quantité de solution de tyro utilisée lors de la canulation et la remplacer par une solution fraîche pour maintenir la solution totale en circulation à deux litres. Maintenant, immergez complètement les électrodes ECG dans le bain de chaque côté du cœur, mais pas en contact avec le cœur.
Vérifiez ensuite que cela fait d’une dérivation normale une morphologie ECG. Pendant ce temps, maintenez la pression aortique à 60 à 70 millimètres de mercure en ajustant le débit des perfusibles entre 25 et 35 millilitres par minute. Maintenant, éteignez les lumières de la pièce et ajoutez 0,3 à 0,6 millilitre de solution mère de statine BLE au PERFU huit pour une concentration finale de 10 à 20 micromolaires.
Après 10 à 15 minutes, les contractions cardiaques devraient cesser. Passez ensuite au système de profusion de petits volumes. L’une des clés d’une imagerie calcique SR réussie est le bon chargement du colorant Flow Five N am.
Cela nécessite une perfusion de petit volume pour obtenir une concentration élevée de colorant et des conditions de température ambiante. Pour éviter la désestérification du D dans le cytosol, préparez maintenant 500 microlitres de solution de chargement de la grippe O cinq N am et mélangez-le avec 500 microlitres de solution routière. Ajoutez-le ensuite au PERFU huit.
Laissez le téléchargement se poursuivre pendant 45 minutes, puis allumez le bain-marie en circulation pour réchauffer le système à 37 degrés Celsius. Après une heure de téléchargement, revenez au volume plus important de Perfu huit. Ensuite, mélangez 50 microlitres du colorant sensible à la tension RH 2 37 dans un millilitre de tyros chauds.
Injectez-le lentement dans le système pendant environ cinq minutes et procédez à la cartographie optique du cœur. Pour commencer, concentrez les caméras de cartographie optique sur le champ approprié pour réduire le mouvement sur la surface du PERFU huit. Faites flotter une lamelle sur la solution.
Ajustez maintenant le faisceau lumineux LED pour fournir un éclairage uniforme au cœur. Pour chaque enregistrement optique, définissez le protocole de stimulation souhaité. Allumez le voyant d’excitation et collectez une à quatre secondes de données dans un délai d’une à deux heures.
Le bruit d’une fuite de colorant mettra fin à l’expérience. Ensuite, lavez le système avec de l’eau déminéralisée. Puis 70 % d’éthanol et terminez par un autre rinçage à l’eau déminéralisée.
En utilisant le protocole décrit, la séparation spectrale du signal de potentiel transmembranaire et du réticulum sarcoplasmique ou du signal calcique SR peut être séparée. Des traces optiques pendant la stimulation continue ont également été enregistrées. Des cartes d’activation ont ensuite été construites à partir des données en traçant le temps d’activation de chaque pixel.
Sur un graphique isochronal, il y a un retard typique de huit à 10 millisecondes entre les deux signaux. Il a été possible de quantifier la variation relative de la RS diastolique. Charge calcique et amplitudes systoliques de libération de calcium SR à différents cycles de stimulation. Une manipulation pathologique du calcium SR a été observée après l’application de l’isoprotérénol, agoniste des récepteurs bêta-adrénergiques.
Les flèches rouges indiquent une fuite de calcium évidente du sr. Dans ces conditions, le déclenchement des potentiels d’action par le calcium peut se produire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer une cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire et des signaux calciques SR dans le cœur de lapin Perfusé de Lang Endorf intact
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Aperçu
Cet article décrit un protocole de cartographie optique double du potentiel transmembranaire et du calcium libre dans le réticulum sarcoplasmique dans le cœur de lapin perfusé selon Langendorff. Cette méthode permet l'observation directe et la quantification de ces dynamiques dans le cœur intact.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Physiologie cardiovasculaire
- Techniques d'imagerie optique
Contexte
- La compréhension de la dynamique cardiaque est essentielle pour l'étude de la fonction cardiaque.
- Le potentiel transmembranaire et les niveaux de calcium sont des indicateurs clés de la santé cardiaque.
- La cartographie optique offre une méthode non invasive pour étudier ces paramètres.
- La technique de perfusion Langendorff permet des études sur cœur isolé.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode de cartographie optique simultanée du V m et du Ca2+ du réticulum sarcoplasmique.
- Pour améliorer la compréhension de l'électrophysiologie cardiaque.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Exérèse du cœur de lapin et canulation de l'aorte pour une perfusion rétrograde.
- Utilisation d'un découpleur excitation-contraction pour éliminer la contraction.
- Passage à un circuit de perfusion en recirculation avec un indicateur calcique à faible affinité.
- Réchauffement du cœur et ajout d'un colorant sensible au voltage pour la cartographie optique.
Résultats principaux
- Mesure simultanée réussie du V m et des dynamiques de Ca 2+ du réticulum sarcoplasmique.
- Mise en évidence de l'efficacité de la technique de cartographie optique.
- Apporté des connaissances sur la relation entre le calcium et le potentiel transmembranaire.
- Mise en place d'un protocole fiable pour les études futures.
Conclusions
- La technique de cartographie optique double est efficace pour l'étude de la dynamique cardiaque.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en physiologie cardiaque.
- Des applications futures pourraient inclure des études sur les maladies cardiaques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette méthode permet la mesure directe et simultanée du calcium intra-réticulum sarcoplasmique et du potentiel transmembranaire dans un tissu cardiaque intact, offrant ainsi un aperçu mécanistique du couplage excitation-contraction et des substrats arythmogènes. En précisant les dynamiques spatiales et temporelles de la gestion du Ca2+ du RS dans un modèle physiologiquement pertinent, elle soutient la validation des cibles et la réduction des risques en découverte de médicaments cardiovasculaires. L'approche établit un lien entre les mécanismes moléculaires et les phénotypes au niveau tissulaire, renforçant la fiabilité prédictive des évaluations précliniques de sécurité et d'efficacité.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses thérapeutiques en quantifiant la charge et la dynamique de libération du Ca2+ dans le réticulum sarcoplasmique sous stress physiopathologique, comme la stimulation bêta-adrénergique.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle des cibles impliquées dans la régulation du calcium, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique lors de la sélection précoce des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés dotés d'une capacité de détection double permettant d'évaluer les effets des composés sur l'électrophysiologie et l'homéostasie calcique.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation des tests grâce à la surveillance simultanée du Vm et du Ca2+ du réticulum sarcoplasmique, améliorant ainsi la reproductibilité dans le criblage des canaux ioniques et des modulateurs calciques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre les perturbations moléculaires et les phénotypes tissulaires arrhythmogènes, permettant une modélisation de systèmes pertinents pour la maladie afin d'aligner des biomarqueurs translationnels.
- Valeur opérationnelle : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en identifiant précocement des signaux pro-arythmogènes lors de l'évaluation préclinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'optimisation des candidats médicaments et l'évaluation préclinique de la sécurité, en particulier pour les composés agissant sur les canaux ioniques cardiaques ou les protéines régulatrices du calcium.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en révélant les relations bidirectionnelles entre le Vm et le Ca2+ du RS sous stimulation électrique et en présence de défis pharmacologiques.
- Écrantage : Offre une prêts-à-l'emploi pour les tests et des résultats quantitatifs permettant de comparer des composés d'intérêt à des conditions témoins selon un format standardisé.
- Analytique : Fournit des mesures spatiotemporelles à haute résolution des transitoires calciques et de la dynamique du potentiel d'action, permettant une analyse comparative entre groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie les observations à la continuité préclinique en modélisant les substrats arythmogènes observés dans les états pathologiques.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour la pharmacologie de sécurité cardiaque et les études de mécanisme d'action dans plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à l'observation directe de la gestion du Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique et de ses conséquences électrophysiologiques.
- Valeur opérationnelle : Normalisation et reproductibilité par cartographie optique à double paramètre dans un système perfusé Langendorff contrôlé.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) en détectant les déclencheurs arythmogènes médiés par le calcium avant des échecs coûteux en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur leurs effets sur la stabilité calcique du réticulum sarcoplasmique et sur la stabilité transmembranaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Une expertise en cartographie optique, en techniques de perfusion et en manipulation de colorants fluorescents est requise pour une acquisition réussie du signal.
- Les équipements comprennent des caméras CMOS à haute vitesse, des systèmes d'excitation à LED et des dispositifs de perfusion capables de fonctionner en mode de recirculation et à grand volume.
- La standardisation entre équipes dépend d'une charge uniforme en colorant, d'un contrôle précis de la température et de protocoles de stimulation cardiaque cohérents entre les laboratoires.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles (par exemple, tissu de rat ou humain) peut nécessiter une optimisation de la concentration de l'indicateur et des paramètres de perfusion.
- Les limitations pratiques incluent l'amplitude faible du signal des indicateurs calciques du réticulum sarcoplasmique, ce qui exige une charge soigneuse en colorant et une minimisation des interférences cytosoliques.
