Name: Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 28 s
Description: Découvrez une méthode pour quantifier le recrutement des cellules tumorales dans les poumons à l'aide d'un modèle de métastase chez la souris. Cette technique permet d'étudier les mécanismes moléculaires de la métastase in vivo.

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Toutes les procédures effectuées sur des souris ont été approuvées par Medical University de l’Animal Research Committee of Tokyo Women.
1. queue Injection dans la veine des cellules de poumon de Lewis carcinome (LLC)
<ol><li>Maintenir les cellules LLC en DMEM additionné de 10 % FCS, dans un humidifié 5 % CO2 incubateur à 37 ° C. Cellules doivent contenir un système d’expression de protéine fluorescente (p. ex., GFP).</li>
	<li>Éliminer les cellules de la boîte de pétri en utilisant un réactif de dissociation cellulaire non enzymatiques. Suivre le protocole du fabricant.</li>
	<li>Prélever des cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger à x 400 g pour 3 min. remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS de pipetage et centrifuger le tube (400 x g, 3 min). Ensuite, retirez le surnageant.<ol>
<li>Répétez cette étape de lavage une fois de plus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après le deuxième lavage, passez les cellules à travers un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) et remettre en suspension dans du PBS pour donner une densité finale de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Injecter 0,1 mL de suspension cellulaire (1 x 105 cellules, aiguille de 29 G) dans chaque souris C57BL/6 (garçons de 8-10 semaines vieux) via la veine caudale.</li>
</ol>2. isolement des poumons et de compter les cellules sous un stéréomicroscope de Fluorescence
<ol><li>Euthanasier les souris par inhalation de CO2 .</li>
	<li>Enlever la peau sur la surface ventrale de la poitrine avec des ciseaux. Ensuite, couper les côtes et le diaphragme pour exposer la cavité thoracique. Rincer les PBS (100 cmH2O, total 15 mL) à travers le ventricule droit avec une aiguille 25 G de perfusion à ailes et les tubulures.</li>
	<li>Découpez le cœur et le thymus. Saisir la trachée avec une pince et tirer vers le haut, les tissus conjonctifs autour de trachée de dissection aux ciseaux. Disséquer les poumons et les laver dans du PBS.</li>
	<li>Détacher chaque lobe et observez-la sous un stéréomicroscope de fluorescence.</li>
</ol>3. poumon Digestion
<ol><li>Dissoudre 10 mg de collagénase, 10 mg d’a et 10 µg de DNase dans 10 mL de DMEM sans sérum. Filtrer sur un filtre de seringue de 0,22 µm pour préparer la solution de digestion enzymatique.</li>
	<li>Dés le lobe caudal isolé avec des ciseaux. Placer les morceaux de poumon dans une seringue de 10 mL, suivie par le piston.</li>
	<li>Aspirer la solution de digestion (5 mL) dans la seringue en tirant sur le piston. Fonctionner le piston monte et descend jusqu'à ce que le poumon s’enfonce dans la solution. Ensuite, placez le tampon de poumon et de la digestion dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Agiter le tube pendant 15 min à 37 ° C dans un agitateur réciproque (150 tr/min). Poumons peuvent devenir lambeaux pendant l’incubation.</li>
	<li>Pipette de haut en bas jusqu'à ce que les cellules pulmonaires sont complètement dispersées. Agiter le tube supplémentaire 30 min à 37 ° C dans un agitateur réciproque (150 tr/min).</li>
	<li>Passer les cellules pulmonaires à travers un tamis de cellule 40 µm. Tournez en bas les cellules à 400 g pendant 3 min.</li>
</ol>4. cytométrie de cellules pulmonaires
<ol><li>Dissoudre 100 mg de BSA dans 10 mL de PBS et filtre par un filtre de seringue 0,22 µm pour préparer les PBS - 1 % de BSA.</li>
	<li>Retirez le surnageant de l’échantillon obtenu à l’étape 3.6 à l’aide d’une pipette et ajouter 2 mL de solution de lyse des globules rouges. Puis, centrifuger les cellules à 400 g pendant 3 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS - 1 % de BSA en pipettant également et centrifuger le tube (400 x g, 3 min). Jeter le surnageant.<ol>
<li>Répétez cette étape de lavage une fois de plus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspendre les cellules dans 1 mL de PBS - 1 % de BSA et passer à travers un nouveau tamis cellulaire de 40 µm.</li>
	<li>Analyser les cellules avec un cytomètre en flux pour compter les cellules tumorales (à l’aide de la configuration du filtre FL1 pour GFP-LLC).</li>
</ol>

<ol><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Kaplan, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR1-positive+haematopoietic+bone+marrow+progenitors+initiate+the+pre-metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche.</a> Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).</li>
<li>Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-mediated+upregulation+of+chemoattractants+and+recruitment+of+myeloid+cells+predetermines+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis.</a> Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S100A8-serum+amyloid+A3-TLR4+paracrine+cascade+establishes+a+pre-metastatic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Clara+cell-mediated+homeostatic+inflammation+is+involved+in+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis.</a> Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+amyloid+A3+binds+MD-2+to+activate+p38+and+NF-%CE%BAB+pathways+in+a+MyD88-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner.</a> Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).</li>
<li>Erler, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+lysyl+oxidase+is+a+critical+mediator+of+bone+marrow+cell+recruitment+to+form+the+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche.</a> Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+destabilization+in+the+premetastatic+phase+facilitates+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis.</a> Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).</li>
<li>Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-metastatic+niche%3A+finding+common+ground%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The pre-metastatic niche: finding common ground.</a> Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).</li>
<li>Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review.</a> The Breast. 23, 552-560 (2014).</li>
<li>Wolf, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+CCR2+signaling+induced+by+colon+carcinoma+cells+enables+extravasation+via+the+JAK2-Stat5+and+p38MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway.</a> Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).</li>
<li>Hiratsuka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+tumours+modulate+innate+immune+signalling+to+create+pre-metastatic+vascular+hyperpermeability+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci.</a> Nature Communications. 4, 1853(2013).</li>
<li>Deguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eritoran+inhibits+S100A8-mediated+TLR4%2FMD-2+activation+and+tumor+growth+by+changing+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment.</a> Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).</li>
<li>Ieguchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM12-cleaved+ephrin-A1+contributes+to+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis.</a> Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Prétraitement des souris avec des anticorps, de drogues, une alimentation riche en graisses ou milieu conditionné par tumeur avant l’injection de cellules tumorales est possible. L’étape la plus difficile dans cet essai est l’injection dans la veine queue. Injection incomplète se traduit par des données non concluantes. La veine caudale C57BL/6 est particulièrement difficile à identifier, résultant en des injections a échoué. Placer les souris sur un coussin chauffant (37 ° C) aide à dilate la veine caudale afin que l’in...

Métastase tumorale représente une mortalité élevée dans les maladies liées au cancer. Du point de vue des enquêtes au niveau moléculaire, les métastases peuvent être divisés en plusieurs étapes : initiation tumorale sur le site de la tumeur primitive, la croissance de la tumeur primitive et l’invasion en entourant les tissus, intravasation, circulation dans les vaisseaux sanguins , l’extravasation à des organes éloignés et re-croissance de la tumeur. Chaque étape consiste à différents ensembles de molécules/signaux1.
Études à ce jour ont porté sur les événements qui se produisent dans des organes éloignés avant de commencent aux cellules tumorales circulant dans le sang, qui est également connu comme le stade métastatique pre2,3,4,5, 6. Nos études de modèle de souris ont révélé que la phase pré métastatique facilite les métastases pulmonaires en créant des réactions inflammatoires à basse altitude et de longue durée dans les poumons. La phase pré métastatique est caractérisée par l’hyperperméabilité de themicrovasculature, le recrutement des cellules de moelle osseuse provenant (BMDC) et une augmentation des cytokines/chemokine-comme des molécules dont S100A8 et SAA33,4 . Il a été signalé que lysyl oxydase modifie la matrice extracellulaire dans les poumons pour recruter BMDCs7. Un autre rapport a révélé l’importance de la Angpt2, MMP3 et MMP10 dans la phase pré métastatique8. En d’autres termes, les interactions complexes entre les tumeurs primaires, la moelle osseuse et des organes distants doivent être compris et correctement modulée (par exemple, à l’aide de médicaments qui ciblent les protéines impliquées dans ces interactions) pour prévenir les métastases9 . Pour régler la phase pré métastatique, il abord convient visualisé et une évaluation des interventions diagnostiques ou thérapeutiques. Nous rapportons ici une analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire qui permet l’étude de la phase pré métastatique dans les poumons.
Les cellules tumorales injectées directement dans le vaisseau sanguin de la souris sont similaires à circulant les cellules tumorales de patients atteints de cancer, bien qu’il peut y avoir des différences entre les cellules et les cellules tumorales circulantes. Cellules tumorales circulantes eux-mêmes subissent certains changements caractéristiques lorsqu’ils entrent dans la circulation de la tumeur primaire. Néanmoins, les cellules cultivées peuvent former des tumeurs chez des souris immunodéficientes lorsqu’ils sont injectés dans la veine caudale. En outre, dans le système de modèle de souris, fluorescence étiqueté cellules tumorales peut être utilisé qui permettent le suivi de ces cellules dans le corps. Le comportement des cellules tumorales circulantes est critique car ils déterminent les conséquences ultimes du cancer patients10. Sang n’est pas un bon endroit pour la survie des cellules de tumeur2. Ils doivent échapper à l’attaque par le système immunitaire et ont besoin de signaux anti-apoptotiques pour empêcher l’apoptosis en raison du manque de support physique. Des cellules tumorales avec des capacités plus élevées d’initiation tumorale métastatique sites génèrent plusieurs nodules de tumeur. Si les cellules tumorales montrent tropisme d’organe spécifique, métastase doit être observée dans ces organes particuliers. Dans ce test, les premières étapes de la cascade métastatique (croissance de la tumeur primitive et invasion) ne sont pas inclus, et si l’accent est mis sur l’interaction entre la circulation de cellules tumorales et les cellules du stroma (cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules du sang). Dans des essais d’injection de cellules de tumeur classiques, les chercheurs doivent attendre que les nodules de tumeur atteignent une taille tangible pour détecter les métastases. Dans ce cas, le nombre exact de cellules tumorales dans les vaisseaux sanguins ne peut être quantifié. En outre, ce processus comporte une phase de repousse de tumeur, ce qui indique que les autres facteurs dans les cellules tumorales peuvent affecter le résultat.
Comptage étiqueté sous un stéréomicroscope de fluorescence des cellules tumorales est un processus simple. Le stéréomicroscope offre un large champ de vision afin que le poumon entier peut être scanné. Cytométrie en flux est également un outil utile qui donne instantanément un nombre précis de cellules tumorales dans les tissus. Compter les cellules fluorescentes dans les tissus sous un microscope confocal est également possible et affiche les photos plus précises des cellules de tumeur métastatique, mais il prend du temps et peut donner des résultats biaisés si seulement une zone sélectionnée est comptabilisée. Le but ultime de ce test est d’observer avec quelle facilité les cellules tumorales s’accumuler dans les poumons. Comme indiqué précédemment,3,4, si les poumons sont en phase métastatique préalable en raison de la signalisation inflammatoires de la tumeur primaire, les cellules tumorales injectées ont tendance à s’accumuler dans les poumons, ce qui implique des chances plus élevées de métastases pulmonaires. Autres conditions (polyarthrite rhumatoïde, l’asthme, etc.) et leur traitement avec des agents anti-inflammatoires (par exemple les anti-TNFα) peuvent atténuer les métastases pulmonaires. Par conséquent, nous concluons que ce test est un outil puissant pour évaluer la possibilité de métastases pulmonaires.

<table><tbody><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>sans calcium, sans magnésium</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td>trace de</td></tr><tr><td>globules rouges tampon de lyse</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à cellules</td><td>BD</td><td>352340</td><td>40 micromètres mesh</td></tr><tr><td>Kit de marquage par fluorescence</td><td>Sigma</td><td>MIN26-KIT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu ; m filtre à seringue</td><td>sartorius</td><td>17597K</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. composé</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde Phosphate Buffer Solution</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent les métastases tumorales, divers essais à l’aide de la souris comme animal modèle ont été proposées. Nous démontrons ici, un simple test pour évaluer l’extravasation de cellules tumorales ou micrométastase. Dans ce test, les cellules tumorales ont été injectées dans la veine de la queue, et après une courte période, les poumons ont été disséqués et digérés pour compter les cellules tumorales marquées accumulés. Ce dosage saute l’étape initiale de l’invasion de la tumeur primitive dans le vaisseau sanguin et facilite l’étude des événements dans l’organe lointain où se produit la métastase tumorale. Le nombre de cellules injectées dans le vaisseau sanguin peut être optimisé afin d’observer un nombre limité de métastases. Il a été signalé que les cellules du stroma dans des organes éloignés contribuent à métastases. Ainsi, cet essai pourrait être un outil utile pour étudier les éventuels médicaments ou dispositifs pour la prévention des métastases tumorales.

Les poumons présentent plusieurs cellules de GFP-LLC 2 h après l’injection (Figure 1 a). Il est à noter que les taches fluorescentes également détectés dans le filtre rouge devraient être exclus du nombre nombre d’éléments. La grande majorité des cellules LLC disparaître des poumons 24 h après l’injection (Figure 1).
Pour confirmer le nombre de la GFP-SARL dans les poum...

Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie tumorale sur les mécanismes moléculaires de la métastase. Le principal avantage de cette technique est que le recrutement de cellules tumorales dans un organe éloigné peut être quantitate. Commencez par utiliser un réaccien de dissociation cellulaire non enzymatique pour enlever le carcinome pulmonaire de Lewis exprimant des protéines fluorescentes, ou LLC, cellules de leur récipient de culture selon les protocoles standard.Transférer la solution cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres avant la centrifugation, et la centrifugeuse laver les granulés deux fois en cinq millilitres de PBS par lavage. Après le deuxième lavage, filtrer les cellules à travers une passoire à cellules poreuses de 40 micromètres, et diluer la suspension à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre. Chargez ensuite les cellules dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 29 et injectez 100 microlitres de cellules dans la veine arrière de chaque souris mâle de huit à dix semaines, C57-Black-6.Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez des ciseaux pour enlever la peau de la surface ventrale de chaque souris, et coupez les côtes et le diaphragme pour exposer la cavité thoracique. Utilisez une aiguille d’infusion ailé de calibre 25 et un tube pour rincer 15 millilitres de PBS à travers le ventricule droit, et enlever le cœur et le thymus. Saisir la trachée avec des forceps, tirer vers le haut, disséquer les tissus conjonctifs autour de la trachée, pour récolter les poumons.Ensuite, lavez les poumons dans PBS, et détachez un lobe pour la visualisation des cellules fluorescentes in situ sous un microscope à fluorescence. Pour digérer le tissu pulmonaire, dés d’abord le lobe caudal avec des ciseaux, et placer les morceaux de poumon dans une seringue de 10 millilitres. Fermez la seringue avec le piston et aspirez cinq millilitres de solution de digestion dans la seringue, déplaçant le piston dans et hors de l’arbre de seringue jusqu’à ce que le tissu pulmonaire soit disséminé dans toute la solution.Distribuez le lisier pulmonaire dans un tube de 50 millilitres et digéz le tissu sur un shaker réciproque pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 150 rpm. À la fin de l’incubation, triturer le tissu restant jusqu’à ce que les cellules pulmonaires soient complètement dispersées et remettre le tube au shaker pendant 30 minutes supplémentaires. Filtrez ensuite les cellules à travers une passoire poreuse de 40 micromètres et recueillez les cellules par centrifugation.Pour analyser les cellules pulmonaires isolées par cytométrie d’écoulement, résuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge pendant une minute à température ambiante, et recueillez les cellules par centrifugation. Puis centrifugez la pastille deux fois en cinq millilitres de PBS frais complétés par 1% d’albumine de sérum bovine par lavage. Après la deuxième centrifugation, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS frais plus BSA, et filtrez les cellules à travers une nouvelle passoire pore de 40 micromètres pour la quantification des cellules tumorales par cytométrie d’écoulement.Les poumons présentent de nombreuses cellules GFP-LLC deux heures après l’injection, la grande majorité des cellules disparaissant des poumons dans les 24 heures. Notez que les taches fluorescentes détectées dans le filtre rouge doivent être exclues du nombre de cellules. Pour confirmer le nombre de GFP-LLC dans les poumons, l’un des lobes peut être utilisé pour l’analyse cytométrique de flux comme démontré.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’une procédure de section congelée est une méthode plus précise pour observer l’emplacement exact des cellules tumorales.

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