Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire
26 février 2019
Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.
Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie tumorale sur les mécanismes moléculaires de la métastase. Le principal avantage de cette technique est que le recrutement de cellules tumorales dans un organe éloigné peut être quantitate. Commencez par utiliser un réaccien de dissociation cellulaire non enzymatique pour enlever le carcinome pulmonaire de Lewis exprimant des protéines fluorescentes, ou LLC, cellules de leur récipient de culture selon les protocoles standard.
Transférer la solution cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres avant la centrifugation, et la centrifugeuse laver les granulés deux fois en cinq millilitres de PBS par lavage. Après le deuxième lavage, filtrer les cellules à travers une passoire à cellules poreuses de 40 micromètres, et diluer la suspension à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre. Chargez ensuite les cellules dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 29 et injectez 100 microlitres de cellules dans la veine arrière de chaque souris mâle de huit à dix semaines, C57-Black-6.
Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez des ciseaux pour enlever la peau de la surface ventrale de chaque souris, et coupez les côtes et le diaphragme pour exposer la cavité thoracique. Utilisez une aiguille d’infusion ailé de calibre 25 et un tube pour rincer 15 millilitres de PBS à travers le ventricule droit, et enlever le cœur et le thymus. Saisir la trachée avec des forceps, tirer vers le haut, disséquer les tissus conjonctifs autour de la trachée, pour récolter les poumons.
Ensuite, lavez les poumons dans PBS, et détachez un lobe pour la visualisation des cellules fluorescentes in situ sous un microscope à fluorescence. Pour digérer le tissu pulmonaire, dés d’abord le lobe caudal avec des ciseaux, et placer les morceaux de poumon dans une seringue de 10 millilitres. Fermez la seringue avec le piston et aspirez cinq millilitres de solution de digestion dans la seringue, déplaçant le piston dans et hors de l’arbre de seringue jusqu’à ce que le tissu pulmonaire soit disséminé dans toute la solution.
Distribuez le lisier pulmonaire dans un tube de 50 millilitres et digéz le tissu sur un shaker réciproque pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 150 rpm. À la fin de l’incubation, triturer le tissu restant jusqu’à ce que les cellules pulmonaires soient complètement dispersées et remettre le tube au shaker pendant 30 minutes supplémentaires. Filtrez ensuite les cellules à travers une passoire poreuse de 40 micromètres et recueillez les cellules par centrifugation.
Pour analyser les cellules pulmonaires isolées par cytométrie d’écoulement, résuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge pendant une minute à température ambiante, et recueillez les cellules par centrifugation. Puis centrifugez la pastille deux fois en cinq millilitres de PBS frais complétés par 1% d’albumine de sérum bovine par lavage. Après la deuxième centrifugation, resuspendez la pastille en un millilitre de PBS frais plus BSA, et filtrez les cellules à travers une nouvelle passoire pore de 40 micromètres pour la quantification des cellules tumorales par cytométrie d’écoulement.
Les poumons présentent de nombreuses cellules GFP-LLC deux heures après l’injection, la grande majorité des cellules disparaissant des poumons dans les 24 heures. Notez que les taches fluorescentes détectées dans le filtre rouge doivent être exclues du nombre de cellules. Pour confirmer le nombre de GFP-LLC dans les poumons, l’un des lobes peut être utilisé pour l’analyse cytométrique de flux comme démontré.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’une procédure de section congelée est une méthode plus précise pour observer l’emplacement exact des cellules tumorales.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de quantifier l'accumulation de cellules tumorales dans les poumons dans un modèle animal de métastase tumorale. Cette technique permet de quantifier le recrutement de cellules tumorales au sein d'un organe éloigné, offrant ainsi des informations sur les mécanismes moléculaires de la métastase.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Oncologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- La compréhension de la métastase tumorale est essentielle pour la recherche sur le cancer.
- La quantification de l'accumulation des cellules tumorales peut révéler des informations biologiques importantes.
- L'utilisation de modèles animaux est courante pour l'étude de la progression du cancer.
- Les cellules exprimant des protéines fluorescentes facilitent le suivi et la quantification.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de quantifier l'accumulation des cellules tumorales dans les poumons.
- Étudier le recrutement des cellules tumorales dans un modèle métastatique.
- Approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la métastase.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un réactif de dissociation cellulaire non enzymatique.
- Centrifugation et lavage des culots cellulaires dans du PBS.
- Filtration des cellules à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres de diamètre de pore.
- Injection de la suspension cellulaire diluée dans la veine caudale de souris.
Résultats principaux
- La méthode permet une quantification efficace de l'accumulation des cellules tumorales.
- Démontre la faisabilité du suivi des cellules tumorales in vivo.
- Apporte des connaissances sur la dynamique du recrutement des cellules tumorales.
- Contribue à la compréhension des processus métastatiques.
Conclusions
- Cette méthode constitue un outil précieux pour l'étude de la biologie tumorale.
- Elle améliore la capacité à étudier la métastase dans des modèles animaux.
- De futures études pourront s'appuyer sur cette technique afin d'explorer des cibles thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai permet une évaluation quantitative du recrutement des cellules tumorales vers des organes distants, contribuant à l'atténuation des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments ciblant les métastases. En contournant les étapes d'envahissement de la tumeur primaire, il se concentre sur les interactions stromales et les événements d'extravasation essentiels à la validation préclinique des cibles. La méthode fournit une lecture reproductible et évolutive pour évaluer in vivo des composés anti-métastatiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant la contribution du stroma à la métastase dans les organes distants.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles en quantifiant l'accumulation des cellules tumorales dans les poumons après injection.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en mesurant les effets du composé sur la dynamique de recrutement des cellules tumorales.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi du test : Produit des résultats standardisés et quantitatifs par cytométrie en flux pour des campagnes de criblage de composés.
- Reproductibilité : Utilise des concentrations cellulaires et des volumes d'injection définis afin d'assurer une modélisation cohérente de la métastase.
- Évolutivité : Compatible avec le traitement multipuits et l'analyse à haut contenu pour l'atténuation des risques ciblés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise les micrométastases pulmonaires pour étudier les mécanismes de colonisation organes-spécifiques.
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique d'agents anti-métastatiques.
- Décisions ajustées au risque : Informe les critères d'aller ou de ne pas aller en fonction de la réduction du nombre de cellules tumorales marquées.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Positions le long du continuum de découverte, allant du test d'hypothèses sur des cibles jusqu'à l'optimisation de composés promoteurs, permettant une évaluation quantitative de composés modulant les métastases.
- Biologie de la découverte : Permet l'analyse mécanistique des interactions tumeur-stroma dans les niches métastatiques.
- Tri : Fournit des lectures quantitatives basées sur la fluorescence pour la validation des résultats dans les tests de métastase.
- Analytique : Génère des données quantifiables sur les cellules tumorales par cytométrie en flux, destinées à l'analyse dose-réponse et statistique.
- Recherche translationnelle : S'aligne sur les stratégies de biomarqueurs en suivant la dissémination de cellules marquées in vivo.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude croisée des mécanismes de métastase entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique des voies de métastase grâce à un recrutement spécifique aux organes quantifiable.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'administration des cellules tumorales et le traitement des tissus pour permettre des comparaisons reproductibles entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une élimination précoce des risques associés aux thérapeutiques ciblant les métastases.
- Impact sur le portefeuille : Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données précliniques de suppression des métastases.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en injection intraveineuse caudale chez la souris et en techniques de dissociation tissulaire.
- Dépend d'un équipement de cytométrie en flux et de contrôles de compensation de fluorescence.
- Exige des protocoles standardisés de préparation des cellules appliqués uniformément entre les équipes de recherche.
- Implique une optimisation de la dose cellulaire afin d'éviter des signaux biaisés dus à une accumulation pulmonaire excessive.
- Limité à la quantification de l'accumulation pulmonaire ; ne permet pas de capturer l'invasion de la tumeur primitive ou la dissémination métastatique ultérieure.
