Livraison des protéines, des peptides ou imperméable aux cellules petites molécules dans des cellules vivantes par incubation avec le réactif dfTAT endosomolytique

L'objectif général de l'expérience suivante est d'acheminer des macromolécules dans des cellules vivantes à l'aide d'un dimère, la protéine tat fluorescente ou le réactif df tat, capable de pénétrer efficacement les cellules sans les endommager. Cela est réalisé en premier lieu en produisant et en purifiant l'agent d'acheminement. Dfta comme deuxième étape.

Dfta est incubé avec les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius en présence du cargo macromoléculaire d'intérêt ; df tat induit l'absorption du cargo à l'intérieur des vésicules endocytiques. Ces vésicules mûrissent en endosomes précoces, atteignant finalement l'étape de l'endosome tardif, où DF tat est capable de libérer le cargo dans l'espace cytosolique des cellules. Ensuite, les cellules sont observées par microscopie de fluorescence afin d'évaluer l'efficacité de livraison de detta ainsi que du cargo d'intérêt.

Les résultats montrent que le DF TT peut pénétrer dans les cellules avec une efficacité élevée et sans cytotoxicité observable. Le DF tat peut délivrer des macromolécules de différentes tailles dans l'espace cytosolique des cellules, comme on peut l'observer par microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux approches existantes de délivrance solide est que notre agent de délivrance présente une efficacité de transfert élevée sans impact négatif observable sur la physiologie cellulaire. En outre, elle est facile à utiliser, car elle ne nécessite qu'une simple étape de co-incubation.

Pour commencer, effectuez la synthèse de FTA en faisant gonfler 500 milligrammes de résine R amide, MBHA, dans du diméthylformeamide ou DMF, dans un récipient SPPS standard de 50 millilitres pendant une heure, en réalisant la réaction à température ambiante avec juste assez d'azote gazeux pour faire buller le mélange. Synthétisez FTA sur la résine rink amide MBHA en utilisant 1,2 millimole de chaque acide aminé protégé FM indiqué dans le protocole écrit, pour chaque réaction de couplage d'acide aminé. Ajoutez également 0,44 gramme de HBTU et 0,51 millilitre de DIEA dissous dans du DMF, et réalisez chaque réaction de couplage d'acide aminé pendant quatre heures ; procédez ensuite après les quatre heures de couplage.

Lavez la résine avec du DMF et effectuez l'étape de protection FD comme décrit dans le protocole écrit. Répétez jusqu'à ce que la chaîne peptidique linéaire de FTA soit synthétisée. Ensuite, éliminez le groupe protecteur MTT en incubant la résine avec 20 millilitres d'une solution composée de 1 % d'acide trifluoroacétique ou TFA et de 2 % de triisopropylsilane ou TIS dans du DCM pendant cinq minutes.

Étant donné que l'élimination du groupe protecteur MTT entraînerait l'apparition d'une couleur jaune, répéter cette opération jusqu'à ce qu'aucune couleur jaune ne soit observée lors du lavage de la résine avec du DCM et du DMF en alternance. Ajouter une solution supplémentaire contenant 1 % de TFA dans du DCM à la résine afin de s'assurer qu'aucun MTT n'est éliminé et que la solution reste limpide.

Ensuite, dissoudre le T-M-R-H-B-T-U et la DIEA dans du DMF et ajouter ce mélange à la résine. Laisser la réaction se dérouler toute la nuit en utilisant de l'azote sec pour assurer l'agitation, après la protection fmoc et la conjugaison de l'acide aminé. Laver la résine avec du DCM et la laisser sécher pour assurer le clivage complet du peptide à partir de la résine.

Ajouter une solution contenant 92,5 % de TFA, 2,5 % d’eau, 2,5 % de TIS et 2,5 % de thiodiol d’éthane à la résine peptidique pendant trois heures à température ambiante afin d’assurer la déprotection globale et le clivage de la résine. Précipiter les produits peptidiques bruts à l’aide d’éther éthylique anhydre froid en versant la solution préparée dans 40 millilitres d’éther éthylique. Centrifuger à quatre degrés Celsius et à 4 000 ×g pendant 20 à 25 minutes.

Répétez cette étape pour permettre le lavage du précipité avec de l'éther éthylique anhydre froid. Suspendez les précipités dans de l'eau, lyophilisez-les, puis resuspendez les produits obtenus dans du TFA aqueux 0,1 % pour le test ACEDONITE. Effectuez une chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à l'aide d'une colonne analytique C18.

Pour analyser chaque peptide, utilisez un débit de un millilitre par minute et une détection à 214 nanomètres et 550 nanomètres. Ensuite, effectuez une HPLC semi-préparative sur une colonne C 18 pour la purification des peptides. Utilisez un débit de quatre millilitres par minute et une détection à 214 nanomètres et 550 nanomètres pour tous les essais.

Utilisez des gradients linéaires avant de réaliser la réaction d'oxydation. Confirmez l'identité correcte des peptides par MALDI conformément au protocole du fabricant. Dissolvez le FTA dans du tampon salin phosphate aéré.

Veillez à ce que le pH soit compris entre 7,0 et 7,5. Après l'ajout du peptide, incubez la réaction toute la nuit pour permettre son achèvement. Purifiez le produit par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse et analysez-le par spectrométrie de masse, comme précédemment, puis lyophilisez le DF tat pur et resuspendez-le dans 200 microlitres d'eau pour mesurer la concentration.

Tout d'abord, resuspendez un aliquot du DF tat purifié dans 149 microlitres de solution de TCEP 50 millimolaire et laissez l'échantillon réagir pendant environ 20 minutes. Lors de cette étape, le DF tat est réduit en son homologue monomère, le F tat, afin d'éliminer l'extinction de l'absorbance provoquée par la proximité du fluorophore TMR et du DF tat. Ajoutez toutes les solutions à une cellule en quartz CVE et mesurez l'absorbance à 556 nanomètres.

En utilisant la loi de Beer, déterminez la concentration de la solution. Cela correspond à la concentration de FTA.

Divisez la concentration de FTA par deux pour obtenir la concentration de dfta. Faites croître les cellules dans un milieu approprié jusqu'à une confluence de 80 à 90 % dans une atmosphère humide à 37 degrés Celsius contenant 5 % de CO2, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS et une fois avec NRL 15. Incubez les cellules avec cinq micromoles de df tat avec ou sans charge utile, comme la protéine fluorescente verte améliorée, et maintenez à 37 degrés Celsius pendant une heure afin d'induire une fuite endosomale après l'incubation.

Lavez les cellules trois fois avec de l'héparine dans du milieu L 15 pour éliminer le DF tat lié à la membrane plasmique des cellules. Comme étape finale, observez les cellules au microscope à fluorescence en utilisant un filtre pour la protéine fluorescente rouge ou RFP afin d'évaluer la différence entre le F TAT et le D ftt. Les cellules HeLa sont incubées avec chaque peptide pour déterminer la différence dans leur localisation cellulaire.

Comme illustré ici, FTA se localise selon une distribution ponctuée. Cette distribution est compatible avec le fait que le peptide reste piégé à l'intérieur des endosomes. En revanche, le signal fluorescent de dfta présente une distribution homogène dans tout le cytosol et le noyau.

La distribution cytosolique de DF tat est observée dans plusieurs lignées cellulaires différentes. Les images à 20 x montrent qu'un pourcentage très élevé de cellules dans une boîte présente une distribution cytosolique de DF tat, sans toxicité cellulaire, comme en témoigne l'absence de coloration nucléaire au cyt blue, afin de déterminer si la fuite endosomale induite par dfta permet la livraison de protéines de grande taille dans le cytosol des cellules. L'EGFP a été utilisé pour détecter la livraison de protéines correctement repliées.

EGFP présentait une distribution fluorescente verte cytosolique et nucléaire, similaire à celle observée pour DF tat dans plus de 90 % des cellules, sans toxicité apparente. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules ne doivent pas être trop confluentes. De plus, les cellules doivent être soigneusement lavées pour éliminer le FPS avant d'ajouter le df tap.