Name: Production de lADN double brin Ministrings (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Apprenez à produire des ADN ministrings linéaires covalents fermés en une seule étape in vivo. Cette méthode efficace améliore la livraison de gènes vers les cellules eucaryotes en moins de huit heures.

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Les auteurs remercient le Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et pour le financement de ces travaux.

1. Préparation des milieux et des cultures <ol><li> Pour LB + Amp: Préparez 500 ml de bouillon Luria-Bertani (LB) stérilisés à l&#39;aide d&#39;un autoclave à 121 ° C pendant 30 min. Supplément avec de l&#39;ampicilline pour obtenir une concentration finale de 100 ug / ml d&#39;ampicilline et stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour TB + Amp: Préparez-vous à de grandes (500 ml ou plus) des volumes de Ministring production. Préparer 600 ml de bouillon Terrific stérile (TB) stérilisé à l&#39;autoclave à 121 ° C pendant 30 min. Supplément avec de l&#39;ampicilline pour obtenir une concentration finale de 100 ug / ml d&#39;ampicilline et stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour la gélose LB + Amp: Préparation des plaques d&#39;agar LB stérile en préparant LB + Amp supplémenté avec 15 g / l d&#39;agar-agar. Aliquotes environ 15 - 20 ml dans des boîtes de Petri stériles et stocker à l&#39;envers à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer une plaque de série de W3NN [PDMS] en striant aseptique W3NN [PDMS] cellules sur gélose LB + Amp. Incuber la plaque overnight à 30 ° C, jusqu&#39;à ce que des colonies isolées peuvent être observées. Ne pas incuber W3NN dessus de cette température pour éviter dérépression expression protelomerase. </li><li> transfert aseptique 5 ml de LB + Amp dans un tube à essai stérile. Préparer une culture de nuit de W3NN [PDMS] en inoculant ce volume avec une seule colonie de la plaque de série. Incuber la nuit de culture à 30 ° C dans un agitateur à 230-250 rpm. </li></ol> 2. Phase de croissance <ol><li> Aseptique transfert 10 ml de LB + Amp dans un Erlenmeyer de 125 ml flacon stérile et inoculer avec 100 ul de la culture de la nuit W3NN [PDMS] dans le prêt LB + Amp, faisant une dilution de 1: 100. <ol><li> Pour de plus grands volumes, ajouter 500 pi de culture de la nuit dans 50 ml de TB + Amp dans un Erlenmeyer de 250 ml, au lieu de LB + Amp. </li><li> Vous pouvez également utiliser comme deuxième culture «représentant» à l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Incuber dans un incubateur à agitation par secousses à 30 ° C et à 250 tours par minute jusqu&#39;à ce que le culture atteint le milieu de la phase logarithmique tardive, indiquée par une densité optique (DO) ou de l&#39; absorbance A 600 = 0,8. Après 1-2 heures, le milieu devrait commencer à apparaître trouble à l&#39;œil nu. <ol><li> transfert aseptique 1 ml de la culture à une cuvette de spectrophotomètre propre. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance de la lumière à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre UV-vis de la longueur d&#39;onde réglée sur 600 nm. Utiliser 1 ml des milieux dans lesquels les cellules ont été cultivées pour régler le blanc (LB ou TB). En option, utiliser la culture représentative de l&#39;étape 2.1.3 pour cette étape à la place. </li><li> Si la culture n&#39;a pas encore atteint la DO appropriée, retourner au shaker et vérifier encore une fois toutes les demi-heure. Vérifiez la DO plus fréquemment que l&#39;A 600 se rapproche de 0,8. </li></ol></li><li> Une fois que la culture a atteint la phase logarithmique tardive, indiquée par A 600 = 0,8, aseptique transférer la culture dans 50 ml tubes à centrifuger stériles. </li><li> Recueillir les cellules en centrifugeant la culture à 10 000 g pendant 10 min. Inspecter pour un pellet au fond du tube. </li><li> Décanter le surnageant clarifié dans un conteneur de déchets biohazard approprié. Ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Répétez les étapes 2.4-2.5 jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont été recueillies. </li><li> Re-suspendre le culot dans 100 ul de LB + Amp. Aspirer à l&#39;aide d&#39;une micropipette ou d&#39;utiliser un mélangeur à vortex. Pour une plus grande production de MiniString, re-suspendre le culot d&#39;un TB 50 ml + culture Amp dans 1 ml de milieu LB frais + Amp. </li></ol> 3. Ministring production <ol><li> Ajouter stérilement 20 ml de LB + Amp dans un Erlenmeyer et la chaleur de 125 ml à 42 ° C. Pour une plus grande production de MiniString, préparer 500 ml de LB + Amp, préchauffé à 42 ° C. </li><li> Transférer la remise en suspension dans le milieu préchauffé. </li><li> Incuber à 42 ° C et à 250 tours par minute jusqu&#39;à la phase logarithmique passé, indiquée par A 600 = 1,0. Ne pas laisser 20 ml de culture à 42 ° C passé 1 h. </li><li> Réduire la température à 37 ° C et laisser la culture pour un additional 90 min. Pour 500 ml, laisser la culture pendant une période d&#39;induction supplémentaire de 90-120 minutes et ne pas diminuer la température. </li><li> Réduire la température à 30 ° C et on laisse la culture sous agitation à 200 tours par minute pendant une période de descente de température supplémentaire de 2 h. Pour 500 ml, étendre le rétrogradage de température à 4 heures ou toute la nuit. </li></ol> 4. Récolte Ministrings <ol><li> Aseptique transférer la culture dans 50 ml tubes à centrifuger stériles. Centrifugeuse à 10.000 xg pendant 10 min et vérifier une pastille. </li><li> Décanter le surnageant dans un récipient pour déchets biologiques dangereux approprié sans perturber le culot. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont été recueillies. </li><li> Maintenir la pastille pour l&#39;extraction de plasmide avec toute extraction commerciale et kit d&#39;enlèvement de endotoxine ou gel flash dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C pour l&#39;extraction ultérieure. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons ici un système simple pour la production de Ministrings LCC ADN en utilisant un protocole de chaleur inductible une seule étape, qui ne nécessite aucun équipement spécial en dehors de ce qui est utilisé dans la croissance bactérienne typique et la manipulation. Ministrings d&#39;ADN sont stables linéaires des cassettes d&#39;expression d&#39;ADN libre en torsion, dépourvu d&#39;éléments génétiques procaryotes. Ils peuvent être utilisés à la place des procédés classiques pour le transfert de gènes, l&#39;expression de gènes rapporteurs, ainsi que dans les évaluations vers l&#39;efficacité de l&#39;expression transgénique dans des systèmes eucaryotes. Ministrings d&#39;ADN combinent la biocompatibilité et l&#39;augmentation des gains d&#39;efficacité de transfection de &quot;mini&quot; vecteurs avec le profil de sécurité supérieur de vecteurs d&#39;ADN linéaires. Notre seule étape robuste dans la plate - forme de production in vivo rapidement et facilement produit Ministrings d&#39;ADN pour toute application de transfert de gène sans avoir besoin de plusieurs processus in vitro coûteux. Il y a plusieurs étapes critiques àassurer une production optimale de MiniString (figures 2 et 3). induction de chaleur est l&#39;étape la plus critique pour Ministring production. Absence totale de Ministring production est très probablement due à l&#39;absence d&#39;induction de chaleur (cellules conservées à 30 ° C), où la répression de l&#39;expression protelomerase empêche la conversion du précurseur plasmide LCC MiniString. En suivant le protocole d&#39;induction de la chaleur, attendre un rendement d&#39;environ 75% de la production. induction de la chaleur est optimale alors que les cellules sont en phase logarithmique. Bien qu&#39;il n&#39;y ait pas de différence statistiquement significative dans Ministring PE lors de l&#39; utilisation des cellules en phase stationnaire ( &quot;Overgrown&quot;, Figure 3), nous avons observé une diminution de près de 50% du rendement global de plasmide. Les rendements dépendent du protocole d&#39;extraction du plasmide utilisé. Pour la production de MiniString optimale, déclencher l&#39;induction de la chaleur tandis que les cellules sont en phase logarithmique. Mauvaise production MiniString sera très probablement un résultat de longue upshift ou insufficie températurent rétrogradage de température. Prolongée upshift de température est déconseillée car cela active le E. coli réponse de choc thermique 15, qui peut inhiber l&#39; activité de protelomerase et interférer avec la stabilité du plasmide. Par conséquent, le calendrier rétrogradage de température est une autre étape essentielle pour une production efficace de MiniString. Sans temps d&#39;incubation supplémentaire à 30 ° C, Ministring efficacité de la production a été jugée très faible ( «retrait anticipé», Figure 3). Cela peut être attribué à la quantité de temps nécessaire pour l&#39;expression et l&#39;activité Tél. L&#39;origine prophage encodage PY54 Tel protelomerase infecte normalement Yersinia, qui croît de façon optimale autour de 28 ° C 12, qui indique que 30 ° C peut également être plus optimale pour l&#39; activité de Tel. Le système de production d&#39; ADN minivector utilise une plate - forme in vivo pour générer bactériennes minivectors d&#39;ADN libre de séquence de haute qualité. Les modifications apportées au protocole peut inclure modifiant les milieux de croissance pour optimiser le plasmide et la production de protéines dans le but de promouvoir la croissance des cellules pendant la phase de croissance (TB au lieu de LB), ou augmenter Ministring production et l&#39;efficacité de conversion. Pour de plus grands volumes de culture (200 ml et plus), rétrogradage de température et d&#39;incubation à 30 ° C peut être prolongée pendant une nuit sans grave impact négatif sur Ministring PE. Nous avons inclus des modifications dans notre protocole pour 500 ml de cultures à titre d&#39;exemple. Purification de Ministrings d&#39;ADN peut être accéléré par la digestion in vitro endonucléase du squelette procaryotes. Il y a un certain nombre de sites cibles d&#39;endonucléase (par exemple, PI-Scel, Pvul, Scal) disponible sur le squelette procaryotes du plasmide précurseur, qui peut être coupé pour exposer linéaire extrémités ouvertes, permettant la dégradation in vitro de l&#39;épine dorsale procaryotes. L&#39; isolement de Ministrings provenant d&#39; autres espèces de vecteur peut également être réalisée par chromatographie sur membrane échangeuse d&#39;anions 16. Une limitation de courant associé au système de production de vecteurs LCC ADN est la nécessité d&#39;une purification de l&#39;ADN provenant MiniString d&#39;autres produits LCC et CCC. Bien purifié facilement à l&#39;aide des méthodes d&#39;isolement de plasmide standard, l&#39;étape d&#39;isolement peut encore être un inconvénient dans un cadre à grande échelle. La séparation de la MiniString peut prendre du temps en utilisant AGE si le MiniString et l&#39;épine dorsale procaryote LCC sont aussi de taille similaire. En variante, la Chromatographie sur membrane d&#39;échange d&#39;anions peut fournir une meilleure séparation des Ministrings à partir d&#39; espèces de vecteurs CCC 16. Température upshift peut être une autre limitation potentielle que des températures élevées activent également la réponse de choc thermique dans E. coli, ce qui affecte négativement la protéine recombinante donne 17 et de réduire par conséquent les taux de plasmide Ministring conversion. Nous rapportons ailleurs des optimisations de la plate - forme de production pour contourner et / ou d&#39; atténuer ces effets de choc thermique 18. noussont également optimiser actuellement des méthodes pour éliminer ou réduire la contamination LCC squelette procaryotes in vivo. l&#39;intégration chromosomique de l&#39;ADN MiniString LCC perturbe le chromosome de l&#39;hôte et soumet la cellule à l&#39;apoptose. Non seulement cela réduit conséquences négatives potentielles de mutagenèse insertionnelle tels que l&#39;oncogenèse et le silençage des gènes adjacents, ce qui améliore sa sécurité; l&#39;effet létal peut également servir d&#39;une méthode idéale pour knock-in et des études de remplacement de gène sans les effets secondaires associés et les dégâts de l&#39;intégration. Vecteurs ADN MiniString peuvent être appliquées vers le transfert et l&#39; expression de gènes pour des protéines thérapeutiques, de l&#39; ARN, des anticorps ou des antigènes dans une cible donnée in vivo ou remplacer un allèle fonctionnel mal- ou non. Le inductible par la chaleur in vivo système de production simple en une étape permet de vecteurs d&#39; ADN MiniString d&#39;être facilement produites pour des applications cliniques et industrielles.

L&#39;objectif est de produire des quantités évolutives de linéaire fermé de façon covalente minivectors (LCC) d&#39;ADN en utilisant un système in vivo de production de MiniString d&#39;efficacité simple et haute en une seule étape chaleur inductible ADN. Ministrings d&#39;ADN fournissent une stratégie non-virale sûre et efficace pour fournir l&#39;ADN. Ils combinent la sécurité des vecteurs LCC avec l&#39;efficacité de minicercles d&#39;ADN, et offrent également une alternative plus sûre à des vecteurs dérivés de virus, sans compromettre l&#39;efficacité de la transfection. Pour un système de délivrance de transgène pour réussir, le vecteur d&#39;ADN doit entrer dans la cellule hôte cible et d&#39;exprimer le transgène (s) codé. Il existe plusieurs barrières cellulaires qui doivent être surmontés dans la pratique, en particulier dans les systèmes de mammifères. Afin d&#39;éviter la dégradation par les nucleases sériques et de la détection par le système immunitaire réticulo-endothélial, le vecteur d&#39;ADN doit être bio- et immuno-compatible avec le système cible. ADN Unprotected est rapidement digéré par les nucléases de plasmaet la membrane de plasmide est constitué de barrières de lipoprotéines denses, de sorte que le vecteur d&#39;ADN doit être capable de traverser rapidement la membrane plasmique des cellules cibles. Une fois dans la cellule, les vecteurs doivent traverser le cytoplasme et passer à travers la membrane nucléaire pour pénétrer dans le noyau pour l&#39;expression du transgène. Les techniques non-virales livraison de gènes se concentrent sur le renforcement de la cellule tissulaire et de ciblage. Cependant, l&#39;utilisation de plasmides traditionnels avec ces techniques permet de réduire l&#39; efficacité de transfection en raison de la présence de séquences bactériennes immunogènes, ce qui réduit au silence l&#39; expression du gène rapidement 1,2. les plasmides classiques comportent généralement des gènes de résistance aux antibiotiques pour l&#39;entretien dans les systèmes procaryotes. Cependant, ceux-ci peuvent produire des effets indésirables potentiels chez les hôtes humains ou conférer une résistance à la flore d&#39;accueil d&#39;origine naturelle par des effets de transfert de gène horizontal. Les plasmides classiques contiennent également des motifs dinucléotide CpG 2, ce qui peut déclencher une réponse immunostimulatrice non désirée, ce qui pourraitréduire ou faire taire l&#39;expression du transgène. Comme ils sont uniquement constitués de la cassette d&#39;expression eucaryote, minivectors d&#39;ADN, tels que minicercles d&#39;ADN 3, sont une meilleure alternative pour la livraison de gènes car ils présentent une biodisponibilité améliorée extracellulaire et intracellulaire et l&#39; amélioration de l&#39; expression des gènes en raison de leur taille réduite et de l&#39; absence d&#39;éléments procaryotes immunostimulantes 4. Le vecteur tarifs de taille réduite par rapport à une meilleure résistance aux forces de cisaillement associées à l&#39; administration in vivo à un site cible 5. Le nombre plus élevé de copies du vecteur par unité de masse nécessite moins un réactif de transfection, ce qui diminue la toxicité. Toutefois, en cas d&#39;intégration du vecteur aléatoire dans un chromosome hôte, circulairement de manière covalente (CCC) des vecteurs, y compris les deux minicercles d&#39;ADN et des plasmides classiques fermés, conférer une continuité moléculaire et peut donc conduire à la mutagenèse insertionnelle, ce qui peut avoir des conséquences dévastatrices <sup&gt; 6. En comparaison, l&#39; intégration d&#39;un vecteur d&#39;ADN linéaire perturbe le chromosome et déclenche les voies de la mort cellulaire, ce qui élimine la cellule mutante à partir de la population de cellules en prolifération et la prévention de la mutagenèse insertionnelle 7. Minimalistic expression du gène immunologiquement défini (MIDGE) vecteurs 8 et micro-linéaire des vecteurs 9 (MiLV) sont des vecteurs LCC ADN développés in vitro. Vecteurs de MIDGE ont montré jusqu&#39;à une amélioration de l&#39; expression du transgène de 17 fois in vivo par rapport à l&#39; ADN plasmidique classique vecteurs 11, et ont démontré des résultats prometteurs dans le traitement vaccin 10 et le cancer 8 gène. En outre, en raison de la structure sans torsion du minivector LCC moins un réactif de transfection est nécessaire par rapport à la contrepartie CCC surenroulé, réduisant ainsi la toxicité 7. Nos vecteurs d&#39;ADN de LCC améliorés, Ministrings d&#39;ADN, ont démontré l&#39;efficacité et la bioavai d&#39;expression supérieure7 labilité. En outre, Ministrings d&#39;ADN sont produites sur un système in vivo de la production de chaleur inductible par une étape, une solution pratique et rentable à la cécidomyie et MiLV LCC vecteurs, qui nécessitent des étapes multiples in vitro. Le système de production de MiniString d&#39;ADN à démontrer est un processus thermique inductible simple , réalisée in vivo, ce qui en fait à la fois rentable et facilement évolutive. Ce système exploite le bactériophage Yersinia enterocolitica PY54 dérivé Tél / pal protelomerase système de recombinaison 12 pour séparer la cassette d&#39;expression eucaryote minimale du squelette de plasmide procaryote. Nous avons conçu Escherichia coli cellules (W3NN) pour exprimer Tel protelomerase sous le contrôle du bactériophage λ promoteur inductibles par la chaleur, cI [Ts] 857 13. Lors de l&#39; expression, Tel protelomerase agit sur ​​les sites actuels cibles de pal à l&#39; intérieur &quot; de Super Sequence&quot; (SS) sites situés sur le plasmide précurseurpour donner des produits LCC, à partir duquel le MiniString d&#39;ADN peut ensuite être purifié (figure 1). Les sites SS sur le plasmide précurseur de MiniString d&#39;ADN codent également pour les sites cibles pour les autres recombinases , notamment la recombinase Cre (loxP), TELN protelomerase (telRL) et la recombinase FLP (FRT), ce qui facilite ainsi la production de LCC isogénique et minivectors CCC d&#39;un plasmide précurseur. De plus, chaque site de SS est flanquée des deux côtés par SV40 (SV40e) des séquences qui servent à améliorer la 14 translocation nucléaire. Nous avons démontré ailleurs que l&#39; addition successive de SV40e confère progressivement des augmentations correspondantes de l&#39; efficacité de transfection 7. Le plasmide précurseur (ADNp MiniString ou PDMS) contient un polylieur (figure 1) pour faciliter l&#39; insertion d&#39;un gène d&#39;intérêt souhaité en fusion transcriptionnelle avec le rapporteur fluorescente verte (GFP). La technologie de l&#39;ADN peut minivectorêtre utilisés à la place des procédés classiques pour le transfert de gènes, l&#39;expression de gènes rapporteurs, et les évaluations vers l&#39;efficacité de l&#39;expression du transgène dans des systèmes eucaryotes. Ministrings d&#39;ADN combinent la biocompatibilité et l&#39;augmentation des gains d&#39;efficacité de transfection de &quot;mini&quot; vecteurs avec le profil de sécurité supérieur de vecteurs d&#39;ADN linéaires. Notre solide plate-forme de production en une seule étape rapide et facilement produit Ministrings d&#39;ADN pour toute demande de transfert de gènes et offre un profil de sécurité supérieur.

<table><tbody><tr><td>E. coli souche W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>pour le traitement des mini-chaînes : Nafissi & Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td> Plasmide parent <td>Mediphage</td><td></td><td>pour le traitement des mini-chaînes : également appelé mini-chaîne d’ADNp (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Milieux de culture déshydratés : LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar déshydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Eau Milipore ultra-pure</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>Modèle Z00Q0V0US</td> : Gants chirurgicaux <td>pour système de purification d’eau Mili-Q Advantage A10</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri Fisherbrand avec couvercle transparent arêté surélevé (100&nbsp ; x&nbsp ; 15&nbsp ; mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Tubes à essai</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Stérile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&nbsp ; BD Falcon</td><td>62406-200,Tubes</td><td></td></tr> <tr><td>à centrifuger stériles de 50 ml</td><td>&nbsp ; FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (100-1 000 &mu ; l)</td>Micropipette <td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>(20-200&nbsp ; &mu ; l)</td>Pointes de pipette stériles <td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>(100-1 250&nbsp ; &mu ; l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette stériles (1-200&nbsp ; &mu ; l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific&nbsp ;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer stérile (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer stérile (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer stérile (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Modèle : Centrifugeuse au sol Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter&nbsp ;</td><td>369001</td><td>Modèle : Centrifugeuse</td></tr> de <tr><td>paillasse</td><td>Avanti</td> J-E Beckman <td>362114</td><td>Modèle : GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Mélangeur Vortex Analogique&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN de 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production de l&#39;adn double brin ministrings

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Nous avons construit de manière covalente linéaires fermés minivectors (LCC) d&#39;ADN comme un gène-vecteur de délivrance alternative non-virale produite par une simple plate - forme in vivo. Ministrings d&#39;ADN possèdent un profil accru de sécurité et aussi efficacement livrer la cargaison d&#39;ADN à des cellules ciblées. des vecteurs d&#39;ADN classiques comportent des séquences procaryotiques indésirables, y compris les gènes de résistance aux antibiotiques, des motifs CpG, et les origines bactériennes de replication, ce qui peut conduire à la stimulation des réponses immunitaires de l&#39;hôte. La biodisponibilité des vecteurs d&#39;ADN classiques est également compromise en raison de leur taille moléculaire plus grande. Leur nature circulaire peut également conférer une intégration chromosomique, conduisant à la mutagenèse insertionnelle. des séquences bactériennes sont excisés à partir minivectors d&#39;ADN, ne laissant que le gène d&#39;intérêt (GOI) et des éléments d&#39;expression eucaryotes nécessaires. Nos minivectors d&#39;ADN de LCC, ou Ministrings d&#39;ADN, sont dépourvus de séquences bactériennes immunogènes; par conséquent, l&#39;amélioration de thbiodisponibilité eir et d&#39;expression GOI. Dans le cas de l&#39;intégration du vecteur dans le chromosome, le MiniString d&#39;ADN LCC lethally perturber le chromosome de l&#39;hôte, ce qui élimine le mutant potentiellement dangereux de la population cellulaire proliférante. Par conséquent, Ministrings d&#39;ADN offrent les avantages de l&#39;ADN &#39;minicercle&#39;, tout en éliminant le risque d&#39;événements d&#39;intégration de vecteur indésirables. En comparaison avec les plasmides classiques et leurs homologues (CCC) fermé de manière covalente circulaire isogéniques, Ministrings d&#39;ADN montrent la biodisponibilité supérieure, l&#39;efficacité de transfection et la cinétique cytoplasmiques - ils nécessitent donc des quantités plus faibles d&#39;agents tensioactifs cationiques pour la transfection efficace des cellules cibles. Nous avons construit une seule étape dans le système inductible in vivo pour la production d&#39;Ministrings d&#39;ADN dans Escherichia coli , qui est simple à utiliser, rapide et évolutive.

Après extraction de l&#39;ADN, résiduel plasmide précurseur, LCC squelette procaryotes, et l&#39;MiniString d&#39;ADN seront récupérés. rendement plasmidique global et la pureté peuvent être évalués à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. La pureté est estimée à l&#39;aide du rapport de l&#39;absorbance à 260 nm et 280 nm (A260 / A280), où un rapport de 1,9 à 2,0 est optimal. Tous les LCC et CCC produits peuvent être séparés par électrophorèse sur gel d&#39; agarose (AGE) (Figure 2). AGE visualise les résultats de Ministring production après l&#39;induction de la chaleur, avant Ministring purification. Une évaluation qualitative de la production Ministring peut être faite à ce stade en comparant l&#39; intensité de la bande de la MiniString (2,4 kb) au plasmide parent (5,6 kb) (figure 2). Ministring ADN peut être récupéré via des protocoles standards d&#39;extraction de gel plasmidique suivants AGE. La figure 3 résume Ministring efficacité de la production dans diverses conditions susceptibles de se produire lors de reportment sur le protocole. Ministring efficacité de la production a été déterminée en fonction de l&#39;intensité des bandes d&#39;ADN en utilisant le programme d&#39;analyse du fabricant. Tout programme de densitométrie similaire peut être utilisé pour analyser les résultats de AGE. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1:. Vue d&#39;ensemble de Ministring production (A) Le vecteur parent contient un polylinker en fusion transcriptionnelle avec un gène rapporteur, encadrée par les deux sites de SS. L&#39;épine dorsale code bêta-lactamase pour la résistance à l&#39;ampicilline et contient également plusieurs sites de coupure uniques à la colonne vertébrale pour la digestion in vitro. (B) Vue d&#39; ensemble du protocole principal. Étapes 2) Phase de croissance et 3) Ministring production sont représentés dans un diagramme de fournir un schéma d&#39;ensemble des étapes, mettant en évidence la simplicité du protocole. (C) Ministring induction. Induction de chaleur inactive le répresseur sensible à la température, permettant l&#39; expression de tel suivi par l&#39; activité sur les sites Tel SS dans les plasmides parents. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figure 2: Ministring production après écarts de protocole. 1: Contrôle, 2: non induit, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: retrait anticipé. ADN MiniString est d&#39;environ 2,4 kb, LCC épine dorsale est de 3 kb et pNN9 plasmide parent est de 5,6 kb. l&#39;intensité de la bande des bandes de MiniString et LCC squelette baisse avec des déviations de protocole, ce qui indique un rendement de MiniString inférieur. De gauche à droite: 1 kb échelle de New England Biolabs; Contrôle, suivant le protocole; Non induit, non upshift de température; Envahi, température durin monter les rapportsg phase stationnaire; Overinduced, étendu upshift de température; élimination précoce, aucune rétrogradage de température. Les plasmides ont été extraits en utilisant le kit Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figure 3:. Effets des écarts de protocole sur Ministring efficacité de la production (PE) Les résultats sont la moyenne de 3 essais. PE est estimée à partir intensité de la bande relative mesurée en utilisant Alphalmager HP après AGE. Les écarts se produisent aux étapes suivantes: contrôle, suivant le protocole; Non induit, aucune upshift de température à l&#39;étape 2; Envahi, upshift de température a commencé pendant la phase stationnaire à l&#39;étape 1.6; Overinduced, étendu upshift de température à l&#39;étape 2.3; élimination précoce, les cellules enlevée et extraitesans rétrogradation de température à l&#39; étape 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Le minivecteur d’ADN linéaire fermé de manière covalente (LCC) (ministring d’ADN) est un vecteur de livraison de gènes non viral offrant une efficacité de transfection élevée et est pertinent pour toute application de livraison d’ADN. Le système de production est simple, rapide et évolutif in vivo. Le protocole suivant fournit des instructions visuelles étape par étape pour la production de mini-chaînes d’ADN.

Production de l&#39;ADN double brin Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des minivecteurs d'ADN linéaires, covalentement fermés et sûrs, ou des minicordes d'ADN, à l'aide d'un système de production simple en une seule étape. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine des vecteurs d'ADN et de la livraison de gènes. En particulier, comment produire efficacement des vecteurs de transfert génique plus sûrs et plus efficaces appelés minicordes d'ADN.L'avantage principal de cette technique est qu'elle constitue une approche in vivo efficace et simple, en une seule étape, pour la production de minicercles d'ADN. Pour préparer les milieux, après avoir préparé 500 millilitres de LB, 600 millilitres de TB et du LB agar pour les boîtes de culture, stériliser par autoclavage à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après refroidissement, ajouter à chaque milieu de l'ampicilline, à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre.Conserver le milieu liquide à quatre degrés Celsius. Ensuite, verser de 15 à 20 millilitres de gélose LB additionnée d'ampicilline dans des boîtes de Petri stériles, puis, après refroidissement, les conserver retournées à quatre degrés Celsius. Étaler les cellules W3NN PDMS sur gélose LB enrichie en ampicilline et incuber la boîte à 30 degrés Celsius pendant toute une nuit jusqu'à l'apparition de colonies isolées.Ensuite, à partir d'une colonie unique provenant de la boîte de striation, préparez une culture de 16 à 20 heures de W3NN PDMS en inoculant cinq millilitres de LB additionné d'ampicilline. Incubez la culture à 30 degrés Celsius et entre 230 et 250 tr/min pendant la nuit. Dans un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres, inoculez 10 millilitres de LB additionné d'ampicilline avec 100 microlitres de la culture de 16 à 20 heures de W3NN PDMS afin d'obtenir une dilution au 1/100.Incuber la culture à 30 degrés Celsius et à 250 tr/min jusqu'à ce qu'elle apparaisse trouble à l'œil nu et atteigne la phase logarithmique moyenne à tardive. Ensuite, transférer 1 millilitre de culture dans une cuvette propre. Puis, à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis réglé sur une longueur d'onde de 600 nanomètres et en utilisant le milieu de culture servant à faire croître les cellules, effectuer le réglage du blanc avant de mesurer l'absorbance lumineuse de la culture.Si la culture n'a pas encore atteint la DO appropriée, remettez-la au agitateur et vérifiez à nouveau toutes les demi-heures. Une fois que la culture a atteint la phase exponentielle moyenne, transférez-la dans des tubes stériles de centrifugation de 50 millilitres. Récupérez les cellules par centrifugation à 10 000 ×g pendant 10 minutes.Versez le surnageant clair dans un contenant approprié pour déchets biologiques, puis utilisez 100 microlitres de LB plus amp pour resuspendre le culot en pipetant plusieurs fois ou en vortexant. Pour induire la production de ministring, ajoutez 20 millilitres de LB plus amp dans un flacon Erlenmeyer de 125 millilitres et chauffez à 42 degrés Celsius. Transférez le culot resuspendu dans le milieu préchauffé et incubez à 42 degrés Celsius et 250 tr/min au-delà de la phase exponentielle, ou pendant une durée maximale d'une heure pour 20 millilitres.Réduisez la température à 37 degrés Celsius et laissez la culture pendant 90 minutes supplémentaires. Ensuite, abaissez davantage la température à 30 degrés Celsius et laissez la culture agiter à 200 tr/min pendant deux heures. Pour récolter les ministrings, transférez la culture dans des tubes stériles de 50 millilitres pour centrifugeuse.Ensuite, centrifuger à 10 000 × g pendant 10 minutes et vérifier la présence d’un culot. Enfin, décantar le surnageant et utiliser un kit commercial d’extraction et de retrait des endotoxines pour extraire le plasmide. Après l’extraction de l’ADN, le plasmide précurseur résiduel, le squelette procaryote LCC et la minicorde d’ADN seront récupérés et pourront être séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, comme illustré ici.Avant la purification du ministring, une évaluation qualitative de la production du ministring peut être effectuée à ce stade en comparant l'intensité de la bande du ministring à celle du plasmide parent. Cette figure résume les rendements de production de ministring susceptibles d'être observés dans diverses conditions lors de la mise en œuvre du protocole. Le rendement de production du ministring a été déterminé en fonction de l'intensité de la bande d'ADN.Une fois maîtrisée, cette technique peut être entièrement réalisée en moins de huit heures, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de respecter scrupuleusement les changements de température appropriés. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'électrophorèse sur gel d'agarose ou la digestion par endonucléase peuvent être réalisées afin d'isoler les minicercles ou de vérifier l'efficacité de production.Cette technique peut grandement améliorer la livraison de gènes dans les cellules eucaryotes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment maximiser la production de minicordes d'ADN à l'aide de notre plateforme de production. N'oubliez pas que, lorsqu'on manipule le bromure d'éthidium, les éclairages UV peuvent être extrêmement dangereux, et il convient toujours de porter des équipements de sécurité adéquats en laboratoire lors de l'exécution de cette procédure.

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