Évaluation de la sensibilité et de la prostate péri-Mast Cell Activation dans un modèle murin de la séparation maternelle néonatale

L’objectif global de l’expérience suivante est de déterminer l’impact du stress précoce sur le système urogénital en mesurant la sensibilité mécanique périgénitale et l’activation des mastocytes dans la prostate chez des souris mâles C 57 noires six qui ont subi une séparation maternelle néonatale. Ceci est réalisé en effectuant d’abord une séparation maternelle néonatale sur des portées de petits souris C 57 black six pour induire un stress précoce pendant 20 jours consécutifs. La deuxième étape consiste à mesurer la sensibilité mécanique périgénitale par l’application d’une série de monofilaments de Von Fre sur la région périgénitale.

Ensuite, une coloration au bleu de toluidine acidifié est effectuée sur des sections cryostat de la prostate de souris. Afin de quantifier l’activation des mastocytes. Les résultats montrent que la séparation maternelle néonatale augmente la sensibilité mécanique périgénitale et l’activation des mastocytes prothétiques sur la base de nos analyses comportementales et histologiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la prostatite auto-immune expérimentale, est qu’elle intègre l’exposition au stress au cours du développement précoce, ce qui précipite la symptomatologie plus tard dans la vie, similaire à ce qui est observé chez les patients atteints de prostatite chronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des douleurs pelviennes chroniques, telles que l’impact du stress au début de la vie sur le comportement, et fournir des preuves histologiques d’états de douleur altérés. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la prostatite chronique, elle peut également être appliquée à d’autres syndromes douloureux fonctionnels tels que la cystite interstitielle, le syndrome de la vessie douloureuse, la vulvodynie, la fibromyalgie ou les migraines.

Il peut même être appliqué à d’autres comorbidités psychologiques courantes telles que l’anxiété et la dépression. Le lendemain de la naissance, retirez la digue de la cage familiale et placez-la dans un récipient secondaire propre. Frottez une poignée de litière entre des mains gantées propres pour maintenir l’odeur de la cage domestique, puis transférez une profondeur d’un à deux centimètres de la litière de la cage domestique dans un haut-parleur en verre de deux litres propre et étiqueté de manière appropriée. De plus, à environ la moitié de tout matériau d’enrichissement supplémentaire présent dans la cage domestique, tel que des nids ou du papier froissé, placez tous les chiots d’une seule portée dans le bécher préparé et placez immédiatement le bécher à 33 degrés Celsius et 50 % d’humidité pendant 180 minutes.

Pendant la période d’incubation séparée, retirez la mère du conteneur secondaire et retournez-la dans la cage d’origine. Remettez la cage de la maison à l’endroit où elle se trouve dans le vivarium. À la fin de la période de séparation, récupérez la cage d’accueil et retirez la mère, en la plaçant dans un conteneur secondaire propre.

Retirez ensuite le bécher de l’incubateur et déposez une poignée de litière entre des mains gantées propres pour maintenir l’odeur de la cage domestique pendant la manipulation des chiots. Déplacez doucement les chiots individuellement du bécher à la cage domestique et retournez tout enrichissement et litière restants dans le bécher dans la cage domestique. Une fois que tous les chiots ont été renvoyés, déplacez la digue du conteneur secondaire à la cage d’accueil et retournez-la à son emplacement de logement approprié dans le vivarium.

Répétez toute cette procédure pour chaque portée subissant une séparation maternelle néonatale tous les jours jusqu’au 21e jour postnatal. Ensuite, sevrez les chiots et logez-les dans les mêmes conditions que les souris témoins pendant toute la durée de l’expérience. Préparez la zone d’essai en plaçant un sous-matelas absorbant sous une table supérieure en treillis métallique surélevée de 55 centimètres de hauteur.

La table doit offrir suffisamment d’espace pour permettre à l’enquêteur de s’approcher par le dessous sans effrayer les souris. Placez jusqu’à 12 souris de huit semaines individuellement sous des chambres en plastique perforé transparent sur la table en treillis métallique. Placez un objet lourd sur le dessus des chambres pour empêcher les souris de s’échapper.

Tenez la base d’un monofilament à trois points de 22 grammes et exposez le monofilament rétracté. Placez la sonde de manière à ce que le monofilament soit orienté verticalement. Lorsque la souris est alerte, immobile et que son poids corporel est réparti uniformément entre les pattes arrière.

Appliquez-le sur le côté gauche ou droit du scrotum, en évitant la ligne médiane jusqu’à ce qu’une légère courbure soit observée dans le filament. Maintenez le monofilament en place pendant 10 secondes ou jusqu’à ce que l’animal montre une réponse positive telle qu’une secousse ou un saut vif ou un comportement de léchage ou de morsure dirigé vers le monofilament. Si une souris ne bouge pas et ne présente aucune réponse positive pendant l’application du monofilament pendant dix secondes, enregistrez une réponse négative pour tester toutes les souris en utilisant la même taille de filament, puis passez au monofilament approprié suivant.

Continuez à tester chaque souris en utilisant le monofilament suivant, plus grand ou plus petit, selon le cas, pour quatre applications supplémentaires. Après l’observation de la première réponse positive, disséquez puis cryosectionnez, fixez le tissu prostatique de souris âgées de neuf semaines dans des coupes cryogéniques de sept microns d’épaisseur. Ensuite, préparez une solution mère de bleu de toluidine à 1 % en ajoutant un gramme de bleu de toluidine O à 100 millilitres d’éthanol à 70 % et agitez le mélange jusqu’à ce qu’il entre en solution.

Conservez la solution mère à température ambiante jusqu’à trois semaines. Dans un autre bécher, ajoutez un gramme de chlorure de sodium à 100 millilitres d’eau placée sur une plaque à mélanger. Ajustez le pH de la solution saline à l’aide d’acide chlorhydrique 12 molaires jusqu’à ce qu’une plage de pH de 0,5 à 1,0 soit atteinte.

Préparez ensuite une solution de travail au bleu de toine acidifié à 0,25 % en combinant huit millilitres de la solution mère bleue d’Udine et 32 millilitres de la solution acide de chlorure de sodium à 1 %. Versez-le de haut en bas pour assurer l’incorporation totale de la solution mère de bleu d’ode et mélangez À l’aide d’un vortex, préparez la solution de travail fraîche pour chaque lot de lames. Lavez les sections de tissu en trempant individuellement les lames pendant environ une seconde dans un tube conique de 50 millilitres contenant un volume suffisant de PBS pour immerger complètement le tissu.

Laissez les lames sécher à l’air libre sur une serviette en papier. Ensuite, placez les lames dans un bocal en verre contenant suffisamment de la solution de travail au bleu de toluidine à 0,25 % pour garantir que les sections de tissu seront complètement immergées. Incuber les toboggans pendant 10 à 15 minutes sur une plate-forme à bascule réglée à 15 tr/min.

Ensuite, trempez les diapositives dans du PBS pendant environ une seconde pour éliminer tout excès de bleu d’udine et placez les diapositives dans une boîte à diapositives de manière à ce que les diapositives soient sur le côté. Pour permettre le drainage. Faites sécher les lames dans un four à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures ou toute la nuit à température ambiante.

Une fois sèches, plongez les lames dans de l’éthanol à 95 % pendant environ une seconde, puis laissez la section sécher complètement. Répétez cette procédure une à 10 fois jusqu’à ce que le tissu sèche plus bleu que violet. Ensuite, plongez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant environ une seconde et laissez la section sécher complètement.

Répétez cette procédure une à 10 fois jusqu’à ce que le tissu soit bleu foncé à bleu moyen mais pas violet. Enfin, fixez la tache en incubant les lames dans du xylène à 100 % pendant trois minutes. Laissez-les sécher puis recouvrez, glissez les lames avec du glycérol PPS ou un support de montage permanent à base de xylène.

Égouttez tout excès de support et conservez les lames terminées à température ambiante. Lorsqu’elles ont été testées avec une série graduée de monofilaments Von Frame, une séparation maternelle néonatale de huit semaines, les souris ont présenté une allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïves. Cela se traduit par une réduction significative du seuil de sevrage mécanique qui a suscité une réponse comportementale positive.

Des preuves supplémentaires de prostatite chronique, de syndrome de douleur pelvienne chronique peuvent être observées histologiquement, illustrées ici sont des coupes cryostatiques de tissus prostatiques qui ont été colorés au bleu d’o toluidine acidifié pour observer les granules de tryptase logés dans les mastocytes. Un pourcentage significativement plus élevé de mastocytes dégranulés a été observé dans les coupes de prostate des souris de séparation néonatale. Par rapport aux souris naïves Lors de la séparation maternelle néonatale, il est important de se rappeler de maintenir l’odeur de la cage domestique pour éviter le rejet des chiots par la mère Après cette procédure.

D’autres méthodes, comme les tests en plein champ ou une préférence de liquide à deux choix, peuvent être utilisées pour évaluer les preuves comportementales de troubles de l’humeur comorbides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l’activation des mastocytes prostatiques en tant que preuve comportementale et histologique de la prostatite chronique et des souris après une séparation maternelle néonatale.