Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Ce manuscrit détaille une méthode utilisée pour générer des xénogreffes dérivées de patients atteints d’un cancer de la prostate (PDX) à partir de cellules tumorales circulantes (CTC). La génération de modèles PDX à partir de CTC fournit un modèle expérimental alternatif pour étudier le cancer de la prostate ; La tumeur la plus fréquemment diagnostiquée et une cause fréquente de décès par cancer chez les hommes.

L’objectif global du protocole suivant est de générer un cancer de la prostate. Xénogreffe dérivée d’un patient à partir de cellules tumorales circulantes. Ceci est réalisé en prélevant d’abord du sang périphérique de patients atteints d’un cancer de la prostate avancé.

Dans un deuxième temps, le compartiment cellulaire mononucléé du sang est isolé, qui contient les cellules tumorales circulantes. Ensuite, les cellules mononucléées sont colorées avec un anticorps CD 45 ZI Afin de sélectionner les cellules tumorales circulantes à l’aide de la cytométrie en flux, les cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéprimées. Les résultats montrent la génération de xénogreffes de cancer de la prostate basée sur l’injection de cellules tumorales circulantes isolées par cytométrie en flux à partir du sang périphérique de patients atteints de cancer de la prostate.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la prostate en générant de nouveaux modèles expérimentaux qui peuvent être utilisés pour la caractérisation moléculaire du cancer de la prostate et le développement de nouveaux biomarqueurs. La démonstration de la procédure sera faite par Williams, un étudiant du laboratoire, et Omada, un chercheur du département d’oncologie ici à Mount Sinai, pour commencer à collecter du sang total chez certains patients atteints d’un cancer de la prostate métastatique, car ils ont le potentiel d’avoir un grand nombre de cellules tumorales circulantes dans leur sang périphérique. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, transférez le sang entier dans un tube conique en polystyrène de 50 millilitres, avec la solution de sel d’équilibre de Hank.

Dans un rapport de un à un, pipetez doucement le mélange pour l’homogénéiser. Ensuite, ajoutez 15 millilitres d’une solution d’appel FI dans un tube conique vide en polystyrène de 50 millilitres. Pipetez doucement 20 millilitres de sang total dilué, en utilisant le réglage le plus bas sur le dessus de la solution pour former une couche supérieure distincte.

Ensuite, centrifugez le tube à 400 G pendant 30 minutes. À température ambiante, réglez la décélération de la centrifugeuse sur le réglage le plus bas pour éviter le mélange des solutions après la séparation. Après la centrifugation, identifiez la fine bande blanche et grise des cellules mononucléées du sang périphérique et des cellules tumorales circulantes prises en sandwich entre la couche supérieure du plasma et la solution de séparation.

Au fond du tube, collectez soigneusement les cellules de la bande blanche grise et transférez-les dans un tube en polystyrène de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, ajoutez celle de Hank. Équilibrer la solution saline dans les cellules isolées pour un volume total de 10 millilitres.

Centrifugez à nouveau le mélange à 400 Gs pendant 10 minutes à température ambiante. Afin de laver les cellules, retirez le surnageant et répétez ce lavage. Faites un pas de plus.

Après le deuxième lavage, jeter le surnageant. Mettez en suspension le reste de la pastille dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges et incubez la solution pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 400 G pendant trois minutes à température ambiante et retirez le tampon de lyse en jetant le surnageant.

Enfin, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de PBS complété par 10 % de sérum fœtal bovin avant la coloration. Quantifiez le nombre de cellules viables à l’aide de la méthode standard d’exclusion du bleu trian sur un hémomètre, un cytomètre ou un compteur de cellules automatisé. Diluez ensuite les cellules à 1 million de cellules par millilitre dans du PBS avec 10 % FBS, et placez-les sur de la glace pendant une heure.

Pour bloquer la liaison non spécifique, répartissez la suspension cellulaire dans deux tubes séparés. Étiquetez un tube pour les cellules de contrôle et un tube pour les cellules de coloration CD 45 dans le tube de contrôle. Ajouter des IgG un Kappa Zi à une dilution de un à 250 à une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre.

Dans le tube de coloration CD 45. Ajouter l’anticorps primaire conjugué CD 45 ZI à la même concentration de 10 nanogrammes par millilitre et incuber les suspensions cellulaires sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le snat.

Laver les cellules deux fois en suspendant chaque pastille dans du PBS stérile complété par 10 % de FBS, suivi d’une centrifugation à 400 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après le lavage, suspendez les cellules dans une solution d’un millilitre de PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de colorant. Filtrez la solution finale à travers des capuchons de crépine de 35 micromètres dans des tubes de polystyrène de 12 millimètres sur 75 millimètres afin d’exclure tout amas de cellules ou débris.

Ensuite, excluez les cellules positives au CD 45 et les cellules mortes de la suspension en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence pour les éliminer comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Mélangez la suspension de cellules tumorales de la prostate triées avec des protéines de la matrice extracellulaire dans un rapport de un à un et placez le mélange sur de la glace. Ensuite, anesthésez une bouche immunodéficiente masculine de huit à 10 semaines conformément aux directives de l’établissement en utilisant du fluor iso inhalé à 5 % dans un litre par minute d’oxygène.

Assurez-vous d’une anesthésie appropriée en vérifiant la perte du réflexe cornéen et de l’orteil chez la souris. Prélevez 250 microlitres de suspension cellulaire à l’aide d’une aiguille de calibre 25 et d’une seringue d’un millilitre. Ensuite, injectez tout le volume de la suspension cellulaire de la matrice extracellulaire par voie sous-cutanée dans les deux flancs supérieurs des tumeurs du moniteur de souris en effectuant une palpation hebdomadaire des sites d’injection de souris pour la croissance des densités nodulaires sous-cutanées.

Sur la base de la méthode de sélection négative utilisée dans ce protocole, il est nécessaire d’exclure les cellules mortes à l’aide de la coloration DAPI. Comme le montre ici, le pourcentage de cellules CD 45 négatives par rapport aux cellules viables restantes est variable et dépend de la charge tumorale du patient, mais elles sont facilement séparées des cellules CD 45 positives. Lorsqu’un gate approprié est utilisé, après l’implantation de la suspension de cellules tumorales de la prostate, les densités nodulaires sous-cutanées deviendront visibles sur les deux flancs de la souris.

Chaque densité nodulaire représente la croissance d’une xénogreffe et peut être appréciée comme distincte du tissu sain, car elle dépasse de la musculature dorsale de la souris et a une texture plus ferme. Des modèles de xénogreffes dérivées de patients générées à partir de cellules tumorales circulantes récapitulent les tumeurs de la prostate humaine telles que observées par la coloration à l’hémat, à la toïne et à l’éosine, et par l’immunohistochimie pour les marqueurs cellulaires spécifiques de la prostate tels que le récepteur des androgènes et l’antigène membranaire spécifique de la prostate après la génération des xénogreffes. D’autres protocoles, comme le profilage de l’expression des gènes ou des protéines, peuvent être effectués pour explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contribuent à l’agressivité du cancer de la prostate.