Name: Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez la génération de xénogreffes dérivées de patients à partir de cellules tumorales circulantes pour l'étude du cancer de la prostate. Cette méthode par cytométrie en flux permet de créer des modèles expérimentaux fiables pour la recherche oncologique.

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Nous remercions le Dr Jordi Ochando des ressources partagées en cytométrie en flux du Mount Sinai Medical Center pour leur aide dans l’analyse par cytométrie en flux. Nous remercions la Dre Rumana Huq de l’Installation de ressources partagées en microscopie du Centre médical Mount Sinai pour son aide en matière d’imagerie. Les auteurs remercient la Fondation TJ Martell pour son soutien dans ce projet.

Ce protocole a été réalisée à notre institution avec l&#39;approbation du conseil institutionnel d&#39;éthique de la recherche et est en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain. 1. Collecte de sang périphérique de patients atteints de cancer de la prostate avancé Remarque: Sélectionnez les patients atteints de cancer de la prostate métastatique. Obtenir le consentement écrit du patient et enregistrer les caractéristiques cliniques des patients, y compris l&#39;âge à l&#39;isolement et une chimiothérapie antérieure et les traitements hormonaux. Les patients atteints de la maladie métastatique auront potentiellement plus forte concentration de CTC dans le sang périphérique. <ol><li> Prélever des échantillons sanguins après consentement éclairé et sous un Institutional Review Board appropriée protocole approuvé. Porter des gants en latex et une blouse de laboratoire pendant toute la procédure. </li><li> Connectez 25 G aiguille à ailettes et de tubes à porte-aiguille. Utilisez un tampon imbibé d&#39;alcool pour nettoyer la zone deveine antécubitale entre biceps et avant-bras, puis appliquer garrot sur le bras du patient. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans la veine de papillon coude et pousser le tube de collecte de sang dans le support de l&#39;aiguille pour commencer la collecte. Recueillir environ 10 ml de sang dans des tubes de collecte contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour empêcher la coagulation. </li><li> Retirer l&#39;aiguille papillon du patient et appliquer une pression avec un tampon de gaze stérile sur le site de ponction de la veine pendant 1 min. Site Couvrir avec un pansement stérile. </li></ol> 2. Isolement des cellules mononucléaires Remarque: Le sang recueilli à partir de l&#39;étape 1 contient des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) (par exemple, les lymphocytes et monocytes), en plus des CTC mononucléaires. <ol><li> Pipette sang entier dans 50 ml tube de polystyrène conique avec une pipette sérologique de 5 ml et ajouter une solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) dans un rapport de 1: 1. Doucement mélange de pipette pour homogénéiser. </li><li> Ajouter 15 ml d&#39;une solution préparation du commerce (Ficoll-Paque) pour séparer des composants du sang par centrifugation en gradient de densité faible à une vitesse de 50 ml polystyrène tube conique vide. </li><li> Pipette doucement le sang total et mélange HBSS, de l&#39;étape 2.1, dans le tube de polystyrène de l&#39;étape 2.2, pour former la couche supérieure distincte. Set pipette au plus bas réglage pour minimiser le mélange de solutions, ce qui garantira une séparation efficace. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (25 ° C). Réglez décélération au plus bas pour empêcher le mélange de solutions après la séparation. Accélération peut être réglé à toute vitesse. </li><li> Après centrifugation, d&#39;identifier la bande blanc-gris de la couche mince CMSP et CTC en sandwich entre le plasma sur la solution supérieure et la séparation au fond du tube. </li><li> Recueillir les cellules de la bande blanc-gris à l&#39;étape 2.5 dans un tube de 50 ml de polystyrène à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. </li><li> Ajouter HBSS à 50 ml polystyrène tube conique avec CMSP et CTC et centrifuge de nouveau à 400 g pendant 10 min à RT laver. </li><li> Décanter culot liquide et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS et centrifuger à nouveau à 400 g pendant 3 min à température ambiante pour se laver. </li><li> Jeter le surnageant, remettre le culot restant avec 5 ml de tampon de lyse de Red Blood Cell et incuber la solution pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer le rouge globules tampon de lyse par centrifugation à 400 g pendant 3 minutes à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1x complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour bloquer avant la coloration des anticorps. </li></ol> 3. Les cellules mononucléaires coloration avec CD45-FITC anticorps pour cellulaire activé par fluorescence (FACS) <ol><li> Quantifier le nombre de cellules viables (trypan bleu-négative) de l&#39;étape (2.11) à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé. Préparer un x 10 6 cellules / ml de suspension 1 (dans PBS 1x avec 10% de FBS) et le placer sur la glace pendant 1 heure. </li><li> Distribuer le quantifiéssuspension cellulaire de l&#39;étape précédente dans deux tubes. Tubes d&#39;étiquetage que le contrôle et CD45 coloration. </li><li> Dans le tube de commande, ajouter IgG1κ-FITC (2,5 pg / ml) à une dilution de 1: 250. Dans le tube de coloration de CD45, CD45 FITC ajouter (2,5 pg / ml) anticorps primaire conjugué à une dilution de 1: 250 et on incube les suspensions de cellules sur de la glace pendant 30 min. CD45 étiquetage d&#39;antigène est utilisée pour exclure les cellules hématopoïétiques. </li><li> Centrifuger les cellules à 400 g pendant 3 min à 4 ° C, et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules deux fois, en mettant en suspension chaque culot avec 1 x PBS stérile additionné de FBS à 10% suivie d&#39;une centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans une solution de 1 ml de PBS 1X contenant 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une concentration de 10 ug / ml. </li><li> Filtrer la solution finale à 35 um bouchons de tamis 12 mm dans des tubes de polystyrène de 75 x mm. </li></ol> 4. Isolement de la prostate par CTCFACS Remarque: Utiliser un cytomètre de flux pour recueillir en direct CTC CD45 négatives. <ol><li> Définir les contrôles de compensation en utilisant des cellules du tube étiqueté, «contrôle». </li><li> Créer portes qui excluent les débris et amas de cellules en utilisant des paramètres de l&#39;avant-scatter et dispersion latérale appropriées. </li><li> Mettre en place la porte de la FITC en utilisant les suspensions de cellules à partir du tube marqué &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li> (Cellules DAPI-négative) Porte viables en utilisant le bleu du Pacifique-un canal. </li><li> Recueillir CD45 démographique négative dans un tube de 15 ml polystyrène conique stérile contenant 2 ml de Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS. </li><li> Centrifugeuse de la prostate de suspension de cellules tumorales triés à 400 g pendant 3 min, puis remettre en suspension les culots dans 200 - 500 pi de milieu RPMI supplémenté avec 10% de FBS. </li></ol> 5. Injection de CTC dans souris et le suivi de la croissance des xénogreffes Note:Effectuer toutes les procédures animales en conformité avec les protocoles approuvés par le comité de protection des animaux dans les institutions. Ce protocole a été réalisée à notre institution en vertu d&#39;un protocole d&#39;utilisation des animaux spécifiques approuvées par notre Comité de protection des animaux conformément et le respect de toutes les agences réglementaires et institutionnels, règlements et directives pertinentes. <ol><li> Mélanger la prostate suspension de cellules tumorales triés avec la matrice extracellulaire à un ratio de 1: 1 et le placer sur la glace. </li><li> Anesthetize souris avant l&#39;implantation sous-cutanée dans une chambre de fourniture de 5% (v / v) d&#39;isoflurane inhalées dans 1 L / min d&#39;oxygène. Assurer une anesthésie appropriée en vérifiant pour la perte du réflexe cornéen et des orteils chez la souris. </li><li> En utilisant une aiguille de 25 G et une seringue de 1 ml, injecter 250 ul de cellules de tumeur de la prostate et de la matrice extracellulaire suspension cellulaire sous-cutanée dans les deux flancs supérieurs de 8-10 semaines une ancienne souris immunodéficiente mâle. Injecter 250 ul indépendamment de la concentration CTC comme le volume d&#39;injection est le important valeur. Administration SQ maximum chez la souris a pas plus de 1 ml. &#160;</li><li> Surveiller les souris en effectuant palpation hebdomadaire des sites d&#39;injection de la souris sur la croissance de densités nodulaires sous-cutanées et par la mesure de poids des souris deux fois par semaine. </li><li> Euthanasier souris par le dioxyde de carbone asphyxie suivie par dislocation cervicale et les xénogreffes récolte du cancer de la prostate humain sous-cutanés lorsque la taille de la tumeur est supérieure à 0,5 cm et de moins de 1 cm de plus grand diamètre pour assurer un tissu tumoral suffisant pour les analyses moléculaires et des passages en série. Euthanasier les souris présentant des signes de détresse ou de perte de poids de 15% malgré l&#39;absence de tumeur est palpable. </li></ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
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<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce manuscrit décrit un procédé pour la génération de modèles PDX cancer de la prostate à partir de CTC. L&#39;utilisation de CTC pour la génération de PDX modèles présente plusieurs avantages potentiels importants par rapport aux méthodes existantes. Tout d&#39;abord, la collecte des CTC accessible à partir de sang périphérique permet de générer des modèles expérimentaux chez le même patient à différents stades de la maladie. D&#39;autre part, la collecte de sang représente un procédé plus sûr et peu ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient xénogreffes dérivés sont des modèles expérimentaux de plus en plus populaires utilisés pour la recherche sur le cancer. Ils peuvent être utilisés pour la caractérisation de biomarqueurs et de voies biologiques, l&#39;évaluation pré-clinique de l&#39;efficacité des médicaments, et la création d&#39;avatars pour les thérapies personnalisés du cancer 1,2. Auparavant, les autres groupes de recherche ont développé des modèles PDX soit par implantation ou injection de suspensions de cellules tumorales uniques ou des explants tumoraux chez des souris immunodéprimées entier 1. Ces PDX modèles nécessitent collection chirurgicale de la tumeur solide frais, ascite maligne ou des épanchements pleuraux provenant d&#39;un patient subissant une intervention chirurgicale qui est à la fois coûteux et expose le patient à un risque accru de morbidité iatrogène. Un développement récent important dans la recherche sur le cancer est la détection, l&#39;isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes. Ces cellules tumorales échappent à partir de la masse de la tumeur primaire et pénètrent dans la circulationoù ils jouent un rôle essentiel dans les métastases et la rechute, la cause la plus commune de cancer de la mortalité liée 3. L&#39;évaluation et la caractérisation des CTC à partir de plusieurs types de tumeurs solides ont fourni des informations cliniques pour le diagnostic, le pronostic et le suivi de la maladie résiduelle 3. Une variété d&#39;approches actuellement utilisées reposant soit sur ​​les propriétés physiques, l&#39;expression de biomarqueurs, ou des caractéristiques fonctionnelles de CTC peut être utilisé pour isoler efficacement CTC 4. Les méthodes existantes d&#39;isolation CCT macroscopique comprennent la centrifugation en gradient de densité, filtration physique avec des pores de filtrage et de séparation contre des molécules de surface. Les méthodes d&#39;isolement plus largement utilisés CCT sont basés sur la capture à base d&#39;anticorps de la CTC. Tant sélection positive et négative de marqueurs de surface cellulaire peut être utilisée pour isoler les CTC partir de sang périphérique. La sélection positive pour les CTC dans la circulation périphérique utilise couramment marqueurs épithéliaux (par exemple, un EpCAM) quire exprimé sur les cellules, mais pas CTC hématopoïétiques. L&#39;inconvénient de cette méthode est que les CTC avec un potentiel métastatique ont souvent fait l&#39;objet d&#39;épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT), qui régule à la baisse des marqueurs de surface 3 épithéliales. Afin d&#39;isoler les CTC avec un potentiel métastatique, une méthode de sélection négative qui utilise le marqueur de surface hématopoïétiques, CD45, pour épuiser la population de cellules de leucocytes normales peut être utilisé 5. Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et une cause majeure de décès liés au cancer chez les hommes 6. Les mécanismes de la progression de la tumeur et de l&#39;agressivité sont pas complètement compris et par conséquent la génération et la caractérisation des modèles expérimentaux qui récapitulent l&#39;hétérogénéité moléculaire de cancer de la prostate sont d&#39;un intérêt considérable. PDX modèles de cancer de la prostate ont été précédemment générée par la prise de greffe de cellules de cancer de la prostate humaines dans immunodépriméssouris promis 7,8. Toutefois, la production de ces modèles a été entravée par le taux de prise de greffe bas de cancer de la prostate dans des souris immunodéprimées, qui est principalement attribuable à la nature indolente de la maladie. Récemment, des CTC ont été utilisées pour générer le cancer du sein 9, le cancer du poumon et de la prostate 10 11 modèles PDX. Ces études de preuve de concept introduit la possibilité de générer des modèles PDX indépendante de la nécessité pour la collecte de l&#39;échantillon chirurgicale. Dans cet article, nous décrivons en détail un procédé pour la production de ce nouveau modèle expérimental.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &micro ; m Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube conique en polystyrène</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubes en polystyrène avec capuchon de filtre de cellules</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td>352235</tr><tr><td>BD Vacutainer Tubes de prélèvement de sang lavande avec EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de prélèvement de sang ailé BD avec aiguille rétractable à bouton-poussoir Calibre</td><td></td><td></td><td></td>23</tr><tr><td>BD Vacutainer Porte-aiguille</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à usage unique Garrot</td><td></td><td></td><td></td>en latex jetable</tr><tr>Gants <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>en latex ou sans latextampons imbibés d’alcool</td> 2 x 2 tampons <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de gaze de coton</td></tr><tr><td>Pansement</td><td></td><td></td><td></td>adhésif</tr><tr><td>Aiguille</td><td></td><td></td><td></td>25</tr><tr><td>g seringue</td><td></td><td></td><td></td> de 1 ml</tr></tbody></table>

génération de cancer de la prostate des patients dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX) gagnent en popularité dans la recherche sur le cancer et sont utilisés pour l’évaluation préclinique des médicaments, l’identification de biomarqueurs, les études biologiques et les stratégies de médecine personnalisée. Les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle essentiel dans les métastases tumorales et ont été isolées chez des patients atteints de plusieurs types de tumeurs. Récemment, les CTC ont été utilisés pour générer des modèles expérimentaux PDX du cancer du sein et de la prostate. Ce manuscrit détaille la méthode de génération de modèles PDX du cancer de la prostate à partir de CTC développés par notre groupe. Les avantages de cette méthode par rapport aux modèles PDX conventionnels comprennent l’indépendance vis-à-vis de la collecte d’échantillons chirurgicaux et la génération de modèles expérimentaux à différents stades de la maladie. La centrifugation à gradient de densité suivie de la lyse des globules rouges et de la déplétion en cytométrie en flux des cellules mononucléées CD45 positives est utilisée pour enrichir les CTC à partir d’échantillons de sang périphérique prélevés sur des patients atteints d’une maladie métastatique. Les CTC sont ensuite injectés à des souris immunodéprimées ; Les xénogreffes générées par la suite peuvent être utilisées pour des études fonctionnelles ou récoltées pour la caractérisation moléculaire. La principale limite de cette méthode est la méthode de sélection négative utilisée pour l’enrichissement CTC. Malgré cette limitation, la génération de modèles PDX à partir de CTC fournit un nouveau modèle expérimental à appliquer à la recherche sur le cancer de la prostate.

Ce protocole permettra à la génération de modèles de PDX isolés CD45 prostate négative CTC cancéreuses. Basé sur la méthode de sélection négative utilisée dans notre protocole, il est nécessaire d&#39;exclure les cellules mortes en utilisant DAPI tache. Le pourcentage de cellules CD45 négatives détectées par cytométrie de flux est variable et dépend de la charge tumorale du patient (figure 1A). La coloration par immunofluorescence de cellules non triées à l&#39;aide de CD45 et DAPI (pour identifier les ...

Ce manuscrit détaille une méthode utilisée pour générer des xénogreffes dérivées de patients atteints d’un cancer de la prostate (PDX) à partir de cellules tumorales circulantes (CTC). La génération de modèles PDX à partir de CTC fournit un modèle expérimental alternatif pour étudier le cancer de la prostate ; La tumeur la plus fréquemment diagnostiquée et une cause fréquente de décès par cancer chez les hommes.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

L'objectif général du protocole suivant est de générer un cancer de la prostate. Greffe hétérologue dérivée de cellules tumorales circulantes. Ceci est réalisé en prélevant d'abord du sang périphérique chez des patients atteints d'un cancer de la prostate avancé.En second lieu, le compartiment des cellules mononucléées sanguines est isolé, lequel contient les cellules tumorales circulantes. Ensuite, les cellules mononucléées sont marquées par un anticorps CD 45 ZI. Afin de sélectionner les cellules tumorales circulantes par cytométrie en flux, les cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes. Les résultats montrent la génération de xénogreffes de cancer de la prostate à partir de cellules tumorales circulantes isolées par cytométrie en flux à partir du sang périphérique de patients atteints d’un cancer de la prostate.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la prostate en générant de nouveaux modèles expérimentaux pouvant être utilisés pour la caractérisation moléculaire du cancer de la prostate et le développement de nouveaux biomarqueurs. La démonstration de la procédure sera assurée par Williams, un étudiant du laboratoire, et Omada, un chercheur du service d'oncologie de Mount Sinai. Pour commencer, prélvez du sang total chez des patients sélectionnés atteints d'un cancer de la prostate métastatique, car ils peuvent présenter un nombre élevé de cellules tumorales circulantes dans leur sang périphérique. À l’aide d’une pipette serologique de 10 millilitres, transférez le sang total dans un tube conique en polystyrène de 50 millilitres, contenant également une solution saline équilibrée de Hank.Dans un rapport de un à un, pipetez doucement le mélange pour l'homogénéiser. Ensuite, ajoutez 15 millilitres d'une solution FI call pack dans un tube conique en polystyrène vide de 50 millilitres. Pipetez doucement 20 millilitres de sang total dilué, en utilisant le réglage le plus bas, par-dessus la solution afin de former une couche supérieure bien distincte.Ensuite, centrifuger le tube à 400 G pendant 30 minutes. À température ambiante, régler la décélération de la centrifugeuse au niveau le plus bas afin d'éviter le mélange des solutions après la séparation. Après la centrifugation, identifier la mince bande blanche ou grise constituée des cellules mononucléées du sang périphérique et des cellules tumorales circulantes, située entre la couche supérieure de plasma et la solution de séparation.En bas du tube, prélvez soigneusement les cellules de la bande grise blanchâtre et transférez-les dans un tube en polystyrène de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, ajoutez ensuite la solution saline équilibrée de Hank jusqu’à un volume total de 10 millilitres.Centrifuger à nouveau le mélange à 400 Gs pendant 10 minutes à température ambiante. Afin de laver les cellules, éliminer le surnageant et répéter ce lavage. Réaliser une étape supplémentaire.Après le deuxième lavage, éliminer le surnageant. Suspendre le culot restant dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges et incuber la solution pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger l'échantillon à 400 Gs pendant trois minutes à température ambiante et éliminer le tampon de lyse en rejetant le surnageant.Enfin, resuspendre le culot dans un millilitre de PBS supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal avant la coloration. Quantifier le nombre de cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion au bleu de trypan sur un hémo-cytomètre ou un compteur de cellules automatisé. Ensuite, diluer les cellules à un million de cellules par millilitre dans du PBS avec 10 % de SBF, et les placer sur de la glace pendant une heure.Pour bloquer la liaison non spécifique, répartir la suspension cellulaire dans deux tubes distincts. Étiqueter un tube pour les cellules témoins et un autre pour les cellules de coloration CD 45 dans le tube témoin. Ajouter l'IgG un Kappa Zi à une dilution de un sur 250 pour une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre.Dans le tube de marquage CD45, ajoutez l'anticorps primaire conjugué CD45 ZI à la même concentration de 10 nanogrammes par millilitre et incubez les suspensions cellulaires sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant.Laver les cellules deux fois en resuspendant chaque culot dans du PBS stérile supplémenté avec 10 % de FBS, puis en centrifugeant à 400 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après le lavage, resuspendre les cellules dans un millilitre de solution de PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de colorant DAPI. Filtrer la solution finale à travers des bouchons tamis de 35 micromètres vers des tubes en polystyrène de 12 millimètres par 75 millimètres afin d'éliminer les agrégats cellulaires ou les débris.Ensuite, exclure les cellules positives pour le CD 45 et les cellules mortes de la suspension à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence pour les éliminer, comme décrit dans le protocole accompagnant. Mélanger la suspension de cellules tumorales prostatiques triées avec des protéines de la matrice extracellulaire selon un rapport de un pour un et placer le mélange sur de la glace. Puis, anesthésier une souris mâle immunodéficiente âgée de huit à dix semaines conformément aux directives institutionnelles, à l’aide d’isoﬂurane inhalé à 5 % dans un litre par minute d’oxygène.Assurez-vous d'une anesthésie appropriée en vérifiant la disparition des réflexes cornéen et plantaire chez la souris. Aspirez 250 microlitres de la suspension cellulaire à l’aide d’une aiguille de calibre 25 et d’une seringue d’un millilitre. Ensuite, injectez l’intégralité du volume de la suspension cellulaire dans la matrice extracellulaire par voie sous-cutanée dans les deux flancs supérieurs de la souris. Surveillez les tumeurs en effectuant une palpation hebdomadaire des sites d’injection chez la souris afin de détecter la croissance de nodules sous-cutanés.Sur la base de la méthode de sélection négative utilisée dans ce protocole, il est nécessaire d'exclure les cellules mortes à l'aide de la coloration DAPI. Comme illustré ici, le pourcentage de cellules négatives pour le CD 45 parmi les cellules viables restantes est variable et dépend de la charge tumorale du patient, mais elles sont facilement séparables des cellules positives pour le CD 45. Lorsqu'un bon réglage des fenêtres d'analyse est appliqué, après l'implantation de la suspension de cellules tumorales prostatiques, des densités nodulaires sous-cutanées deviendront visibles de chaque côté de la souris.Chaque densité nodulaire représente une croissance de xénogreffe et peut être distinguée du tissu sain car elle fait saillie depuis la musculature dorsale de la souris et présente une texture plus ferme. Les modèles de xénogreffes dérivés de cellules tumorales circulantes reproduisent les tumeurs prostatiques humaines, comme le montrent les colorations à l'hématoxyline-éosine, ainsi que l'immunohistochimie pour des marqueurs cellulaires spécifiques de la prostate tels que le récepteur des androgènes et l'antigène membranaire spécifique de la prostate. Après la génération des xénogreffes, d'autres protocoles, tels que le profilage de l'expression génique ou protéique, peuvent être réalisés afin d'explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires contribuant à l'agressivité du cancer de la prostate.

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