Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

L'objectif général de l'injection de bleu d'Évans et de dextrine Fitzy dans la veine cardinale commune est d'observer l'intégrité de la membrane du muscle squelettique chez des zebrafish vivants afin de contribuer à la caractérisation des mécanismes responsables de maladies liées à divers sous-types de dystrophie musculaire. L'injection de bleu d'Évans peut aider à révéler les mécanismes biologiques impliqués dans la pathologie de la maladie lors de l'analyse de modèles animaux de dystrophie musculaire ; elle peut également enrichir notre compréhension des mécanismes thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être réalisée et analysée à l'aide de zebrafish vivants.

En outre, l'injection concomitante de Fitz Dextrin constitue un contrôle de qualité pour une injection réussie, ce qui améliore la rigueur et la quantification. Les implications de cette technique concernent l'utilité de la validation des modèles de zebrafish des maladies musculaires. Elles permettent également d'approfondir la compréhension de la manière dont certaines mutations conduisent à des phénotypes de maladies musculaires, tels que la dystrophie musculaire, ce qui est essentiel pour trouver des traitements et des guérisons.

Pour préparer les plaques d'injection d'agar, faire bouillir de 2 à 3 % d'aros dans le milieu E trois et laisser refroidir légèrement la solution sur la paillasse. Verser environ 35 millilitres de l'agar refroidi dans chaque boîte de 100 millimètres. Ensuite, placer une extrémité du moule d'injection choisi dans la solution avant de poser le reste du moule sur la solution d'agar.

Laisser la solution d'agarose se solidifier à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Ensuite, utiliser une spatule pour détacher une extrémité du moule de l'agarose solide et retirer lentement le reste du moule. Préparer une solution mère à 1 % de colorant bleu d'Évans ou EBD dans une solution de Ringer 1x.

Préparez ensuite une solution mère de Fitzy Dextrin dans une solution de Ringer 1x et conservez-la à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer le mélange d'injection, diluez l'EBD à 0,1 % directement dans la solution mère de Fitz Dextrin, vortexez soigneusement le mélange d'injection et protégez-le de la lumière directe en enveloppant le tube avec du papier d'aluminium avant l'injection. Préchauffez la plaque d'injection à température ambiante.

Placer le micromanipulateur sur une plaque métallique et le positionner à côté du microscope d'injection. Allumer le contrôleur d'injection microscopique à air comprimé. Ensuite, remplir la pipette d'injection en arrière avec environ deux à quatre microlitres du mélange EBD.

Ensuite, étalonnez le volume d'injection avec environ cinq nanolitres de mélange EBD. Puis utilisez une solution de Ringer à 1× pour humidifier la plaque d'injection et retirez l'excès de solution des puits. Prétraitez les larves avec 0,04 % de trica dilué dans une solution de Ringer à 1× afin d'immobiliser complètement les larves avant l'injection à l'aide d'une pipette en verre. Placez les larves anesthésiées dans les puits des plaques d'injection à vis sans fin, en veillant à ce qu'elles soient entièrement logées dans les puits et positionnées sur le côté.

Retirez l'excès de solution trica afin de minimiser les mouvements des larves dans le puits, mais laissez-en suffisamment pour éviter la déshydratation. Placez la plaque d'injection contenant les larves sous un microscope stéréoscopique et positionnez l'aiguille de la pipette d'injection contenant l'EBD. Mélangez au-dessus d'une larve de poisson zèbre près du cœur et selon un angle d'environ 45 degrés par rapport à l'axe antéro-postérieur.

Insérez l'aiguille d'injection dans la veine cardinale commune ou CCV, près de la partie antérieure du vitellus, là où la veine commence à s'incurver en direction dorsale. Ensuite, injectez cinq nanolitres du mélange EBD et maintenez l'aiguille d'injection en place pendant cinq à huit secondes. Pour minimiser la fuite immédiate du mélange EBD, une bonne injection doit montrer le colorant dans les cavités cardiaques, et elle peut être répétée.

Si le DMX EB n'est pas observé dans le cœur immédiatement après une injection réussie, l'embryon accumulera du dextran Fitz dans la vascularisation, comme illustré ici. Après avoir injecté le nombre souhaité de larves, remettez les larves dans une solution de Ringer 1 x sans trica dans des boîtes de 100 millimètres afin d'augmenter le taux de survie et de maintenir l'intensité du signal. Conservez les boîtes enveloppées dans du papier d'aluminium.

Incuber les larves à 28,5 degrés Celsius pendant quatre à six heures afin de garantir une absorption efficace du DSE. Pour visualiser le DSE dans le muscle, utiliser 0,04 % de trica afin d'anesthésier les larves avant d'observer celles-ci en fluorescence rouge. Le DSE a été injecté dans la VCC de mutants Sapia homozygotes et de leurs frères et sœurs de type sauvage à 3 DPF ; les injections qui ont rempli les cavités cardiaques, comme illustré ici, ont ensuite été analysées pour évaluer une perfusion réussie du colorant en visualisant la dextrine marquée en vert dans la vascularisation sous fluorescence verte.

Après une période d'incubation de quatre heures, la prise en charge de l'EBD a été examinée au niveau des myotomes, comme illustré sur cette figure. Les embryons frères de type sauvage n'ont montré aucune fluorescence au bleu d'Evans dans les fibres musculaires visibles, tandis que les mutants homozygotes pour sapia présentaient une incorporation de l'EBD, indiquant un dommage au niveau de la membrane musculaire. Une fois maîtrisée l'injection du bleu d'Evans dans la veine cardinale commune des poissons zèbres, les larves peuvent être traitées en 30 à 60 minutes, selon le nombre de larves injectées.

En outre, des résultats expérimentaux peuvent être obtenus en une seule journée afin d'assurer la maîtrise. Il est important de bien viser la veine cardinale afin d'obtenir des résultats cohérents et interprétables. Cela peut s'avérer difficile et nécessitera probablement de la pratique après avoir suivi cette procédure.

D'autres méthodes peuvent être réalisées, comme des cribles chimiques et génétiques, afin de déterminer les mécanismes moléculaires responsables des lésions membranaires associées aux dystrophies musculaires. Ces expériences peuvent aider à établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies musculaires après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les maladies musculaires pour explorer l'intégrité membranaire dans des modèles de zebrafish de dystrophie musculaire.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la méthode d'injection du colorant bleu d’Evan dans la veine cardinale commune des larves de poisson zèbre. Vous devriez également savoir identifier les fibres musculaires présentant des lésions membranaires en raison de la présence du colorant bleu d’Evan à l'intérieur des fibres.