Name: Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Apprenez à évaluer l'intégrité des muscles squelettiques chez les larves de poisson zèbre Danio rerio en utilisant le colorant bleu Evans. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de la dystrophie musculaire et de développer de nouvelles thérapeutiques.

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Nous tenons à remercier Trent Waugh pour son aide technique. Nous reconnaissons également le département de pédiatrie de l&#39;Hôpital pour enfants malades et Cure dystrophie musculaire congénitale (CMD) pour leur généreux financement de ce projet.

1. Préparation de plaques de gélose d&#39;injection (Durée: 45 min) <ol><li> Faire bouillir 2% à 3% d&#39;agarose dans les médias E3 et laisser la solution refroidir légèrement sur le banc. Note: Le nombre de plaques d&#39;injection en cours de préparation dicte la quantité d&#39;agarose requis. Chaque plaque d&#39;injection a besoin d&#39;environ 35 ml de la solution d&#39;agarose. </li><li> Après l&#39;ébullition, laisser refroidir l&#39;agarose jusqu&#39;à ce que la température désirée est atteinte (par ex., 45 ° C) selon les instructions du fabricant de moule d&#39;injection. </li><li> Verser environ 35 ml de la refroidies agarose dans un plat de 100 mm. </li><li> Placez une extrémité du moule d&#39;injection préférée dans la solution, puis posez reste de moule sur une solution d&#39;agarose (cela va aider à réduire l&#39;apparition de bulles d&#39;air). </li><li> Laisser la solution d&#39;agarose se solidifie soit à la température ambiante ou 4 ° C pendant environ 30 min. </li><li> Utiliser une spatule pour séparer une extrémité du moule à partir de l&#39;agarose solide. Retirez lentement le reste de la m<html> Agé de. </li></ol> 2. Préparation du colorant bleu Evans (EBD) Injection Mix (Durée: 30 min) <ol><li> Faire un 1% stock d&#39;EBD dans une solution de 1X Ringer (NaCl mM 155; KCl 5 mM, CaCl2 2 mM; 1 mM MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM, 10 mM de glucose; pH à 7,2), qui peuvent être stockées à température ambiante. </li><li> Faire une solution de réserve de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) -dextrane MW 10.000 kDa à 25 mg / ml dans la solution et magasin de 1X Ringer à -20 ° C </li><li> Préparer mélange d&#39;injection en diluant EBD à 0,1% directement dans la solution mère de stock FITC-dextran (ie, pour un volume de travail final de 100 pi. Mélanger 10 pi de 1% EBD dans 90 ul d&#39;actions dextran FITC). </li><li> Bien agiter au vortex mélange d&#39;injection (il doit devenir vert) et de garder hors de la lumière directe en enroulant tube de mélange d&#39;injection dans une feuille d&#39;aluminium. </li></ol> 3. Injection Préparation EBD (Durée: Environ 30 min) ent &quot;&gt; Remarque: Protocole fonctionne mieux avec des larves de 3-7 jours après la fécondation (DPF). <ol><li> Préchauffer plaque d&#39;injection à la température ambiante. </li><li> Mettre en place des appareils d&#39;injection en organisant micromanipulateur sur la plaque de métal et se tenir à côté du microscope étant utilisé pour l&#39;injection. Tournez sur le contrôleur de micro-injection d&#39;air entraîné. Remarque: Le système d&#39;injection préférée varie en laboratoire et ne devrait pas changer résultats de l&#39;analyse. </li><li> Retour combler aiguille d&#39;injection à environ 2-4 pi de EBD mix. </li><li> Calibrer volume d&#39;injection à environ 5 nl de EBD mix. Remarque: le calibrage de volume d&#39;injection dépendra de la méthode d&#39;étalonnage. Une injection à pistons entraînés peut être directement fixé à un volume d&#39;injection étant donné que les injecteurs à pression de gaz devront le volume d&#39;injection calibrée par le volume de bolus à l&#39;aide d&#39;un micromètre. </li><li> Plaque d&#39;injection humide avec une solution de Ringer 1X et enlever l&#39;excès de puits. </li><li> Larves pré-traitement avec 0,04% éthyl-3 benzoate méthanesulfonate salt (tricaïne) dilué dans une solution de Ringer pour immobiliser 1X larves avant le début de l&#39;injection. Remarque: Assurer larves sont complètement immobiles est important que l&#39;injection correcte est difficile avec un mouvement résiduel. </li><li> Placer les larves anesthésié dans des puits des plaques de gélose d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. Assurez-vous que les larves sont complètement à l&#39;intérieur du puits et couché sur le côté. Remarque: Le nombre de larves par puits est à l&#39;expérimentateur. </li><li> Après larves sont mis dans les puits, enlever la solution de Ringer excès pour minimiser le mouvement de larves dans le puits. Laissez une quantité résiduelle de solution pour que les larves ne déshydrate pas. </li></ol> 4. injection péricardique de poisson zèbre larves avec EBD (Durée: en fonction du nombre de larves injection, environ 1-3 h) <ol><li> Placer la plaque d&#39;injection contenant les larves sur un microscope à dissection où les injections seront réalisées. </li><li> Placez l&#39;aiguille de pipette d&#39;injection contenantl&#39;EBD mélanger sur une larves de poisson zèbre. </li><li> Repositionner la plaque d&#39;injection en le faisant tourner de sorte que l&#39;aiguille d&#39;injection se trouve à proximité du coeur du larves et environ 45 ° ventralement à partir de l&#39;axe antéro-postérieur. </li><li> Insérez l&#39;aiguille d&#39;injection dans la veine cardinale commune (CCV) dans la région de la veine à la partie antérieure du jaune où la veine est initialement tourne dans le sens de la dorsale (Figure 1). Remarque: Un grossissement de 40x jusqu&#39;à peut être utile de voir clairement la CCV. </li><li> Injecter 5 nl de EBD mélange et de garder aiguille d&#39;injection en position de 5-8 sec pour minimiser les fuites immédiate de EBD mix. Remarque: Une bonne injection aura coloration colorant vu dans les cavités cardiaques (figure 1). Si EBD mélange est pas observé dans le cœur, puis l&#39;injection d&#39;un 5 nl de EBD mélange supplémentaire peut être suffisante pour induire l&#39;absorption de colorant. En variante, l&#39;embryon peut être mis au rebut. Remarque: Dans certaines situations, le cœur peut s&#39;arrêter de battre. Si ce occurs, continuera à surveiller les larves pour les 20-40 sec. Typiquement, le cœur battant reprend le colorant se déplace à travers le système circulatoire. </li><li> Passer à la prochaine larves et répétez. </li><li> Identifier les embryons injectés avec succès par l&#39;observation de la présence de FITC-dextran dans le système vasculaire immédiatement après l&#39;injection (figure 2). </li></ol> 5. Incubation et EBD absorption (Durée: 4-6 h) <ol><li> Après le nombre désiré de larves sont injectés, retour injecté larves à la solution de Ringer 1X sans tricaïne en boîtes de 100 mm. </li><li> Gardez plats enveloppés dans une feuille d&#39;aluminium. Remarque: Garder larves injecté dans l&#39;obscurité augmente considérablement les taux de survie et assure la plus grande cohérence dans la force du signal. Emballage en feuille d&#39;aluminium est particulièrement important pour la période de temps que les larves sont à l&#39;extérieur de l&#39;incubateur. </li><li> Laisser larves à incuber à 28,5 ° C pendant 4-6 heures pour assurer l&#39;absorption d&#39;EBD suffisante. </li></ol&gt; 6. Visualisation de EBD dans le muscle (Durée: en fonction du nombre de larves injection et le type de microscopie, estimé 0,5-3 h) <ol><li> Avant imagerie, anesthésier les larves avec 0,04% tricaïne pour empêcher le mouvement. </li><li> Voir larves en fluorescence rouge pour déterminer si EBD absorption se produit dans le muscle squelettique (Figure 3). </li></ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrentes ou d&#39;autres conflits d&#39;intérêts.

Poisson zèbre sont en train de devenir un outil puissant pour l&#39;étude de 2,29 de maladie neuromusculaire. À ce jour, le système poisson-zèbre a été utilisé pour valider le nouveau muscle mutations pathogènes 16,17,30, d&#39;élucider de nouveaux mécanismes pathologiques 18, et d&#39;identifier de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques 12,24. Ces efforts collectifs ont établi l&#39;utilité du poisson zèbre pour modéliser les maladies neuromusculaires humaines. Cependant, malgré les progrès réalisés avec des modèles de poisson zèbre et de mammifères, il ya des options de traitement limitées pour les patients dans le large spectre de maladies neuromusculaires. Par conséquent, une forte demande existe pour le développement de la thérapie pour ce groupe de maladies dévastatrices. Parallèlement à cette demande de la thérapeutique est la nécessité correspondante de l&#39;innovation expérimentale en cours, ainsi que l&#39;analyse rigoureuse afin de vérifier de nouveaux modèles animaux et des stratégies thérapeutiques putatifs. Analyse EBD est couramment utilisé dans les modèles de souris dele tissu de l&#39;étude et des dommages cellulaires dans le cerveau, le cœur, et squelettique 27,31 musculaire. Plus particulièrement, EBD est largement utilisé dans des modèles murins de divers sous-types de dystrophie musculaire pour montrer la gravité de la membrane musculaire instabilité et endommager 8. L&#39;utilisation d&#39;EBD pour révéler dommages à la membrane musculaire est un paramètre de soutien à établir des similitudes du modèle animal à l&#39;état de la maladie humaine 9. La puissance de EBD chez la souris a dirigé plusieurs laboratoires, y compris notre propre, de développer et d&#39;appliquer EBD aux modèles de poisson zèbre de maladie neuromusculaire. En raison de l&#39;applicabilité de l&#39;analyse EBD, cette technique est activement mis en œuvre pour corroborer les modèles de poisson zèbre à l&#39;état de la maladie humaine 11,15,22,24,32. Les larves avec des membranes musculaires endommagées aura EBD l&#39;absorption et la fluorescence rouge par conséquent à l&#39;intérieur des fibres musculaires. Fluorescence observée dans l&#39;espace entre les fibres, mais pas à l&#39;intérieur des fibres musculaires individuelles peuvent également être informatif de fibres de détachement de la membrane basale en til absence de dommages de la membrane, fournissant des détails de diagnostic utile. Analyse EBD possède application potentielle au-delà de la validation de modèle animal. Les efforts de notre laboratoire ont récemment démontré que l&#39;analyse EBD est bénéfique dans la validation de nouveaux médicaments potentiellement thérapeutiques 24. Déterminer si les traitements thérapeutiques potentiels réduire ou supprimer EBD absorption dans les modèles de maladies neuromusculaires peut signifier action thérapeutique pertinente 8. Ce type d&#39;analyse peut aider à établir le mécanisme (s) de la thérapeutique et élargit l&#39;application de l&#39;analyse EBD. Comme avec de nombreuses techniques, l&#39;analyse n&#39;a EBD plusieurs mises en garde doivent être observées lors de la conception et de la pratique expérimentale. Par exemple, il peut être difficile d&#39;identifier la raison de la CCV épaississement du tissu avec l&#39;âge. En outre, il est facile d&#39;endommager les larves dans la préparation avant et pendant l&#39;injection péricardique, réduisant chiffres expérimentaux et l&#39;augmentation du besoin pour préparer un grand nombre de larves.En outre, les dégâts physiques que les larves lors de la manipulation et de l&#39;injection peut entraîner des faux positifs comme le muscle endommagé peut prendre jusqu&#39;à EBD. Afin de surmonter certains de ces obstacles, nous avons décrit une stratégie de co-injection dans cet article vidéo qui permet l&#39;identification fiable et facile des larves avec succès infusion de colorant immédiatement après injection et avant l&#39;analyse ultérieure. Le FITC-dextran contrôles de co-injection pour l&#39;injection de succès, en permettant de EBD confirmation dans le système vasculaire avant son absorption par les fibres musculaires. Cela peut être particulièrement utile comme EBD fluorescence devient très diffus dans les larves après plusieurs heures sinon recueillis dans les fibres musculaires; en tant que tel, il peut être difficile à détecter. En outre, à côté de la CCV et EBD injection dans la cavité du corps jaune ou peut, après incubation, la fluorescence rouge entraîner diffus semblable à contrôler embryons, mais avec le risque réduit d&#39;absorption par les fibres musculaires endommagées. Collectivement, ces grotteats suggèrent injection EBD exige de la patience et de la pratique afin de parvenir à des résultats cohérents et fiables. En tout, nous décrivons une méthode pratique et simple d&#39;effectuer des analyses sur EBD larves de poisson zèbre. À ce jour, l&#39;utilisation du poisson zèbre comme un système modèle, en particulier comme un modèle de la maladie humaine, a connu une expansion rapide. Cette expansion est due en partie à la poursuite du développement et la modification des techniques expérimentales qui améliorent les avantages sur le système actuel de poisson zèbre. La technique d&#39;injection EBD fournit un outil supplémentaire et puissant à l&#39;arsenal d&#39;un chercheur pour la validation et l&#39;étude des modèles de maladies du muscle de poisson zèbre. La mise en œuvre continue et la modification de cette technique a le potentiel d&#39;aider à découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que les mécanismes de la maladie causant.

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies musculaires humaines prévalentes et hétérogènes avec des caractéristiques histopathologiques spécifiques1,2. Les symptômes généralement associés à ce groupe dévastateur de maladies comprennent la faiblesse musculaire, la dégénérescence musculaire, la perte de motilité et la mortalité précoce1,3. Les principaux mécanismes pathologiques des dystrophies musculaires sont la perte de protéines qui stabilisent le sarcolemme, ancrent les complexes transmembranaires et médient la signalisation cellulaire à travers la membrane4-6. Par exemple, la perte complète de la protéine dystrophine, une protéine d’échafaudage primaire du complexe dystrophine-glycoprotéine, entraîne une déstabilisation de la membrane musculaire dans la dystrophie musculaire de Duchenne7. En raison du fait que la plupart des dystrophies musculaires résultent de mutations dans les protéines qui participent au lien entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette sarcolemmal, une observation courante au niveau cellulaire est la perte d’intégrité sacrolémique8,9. Cette compréhension du ou des mécanismes pathologiques primaires associés aux dystrophies musculaires est le produit de nombreuses années de recherche utilisant des systèmes modèles animaux2,10-15. Cependant, malgré les progrès dans le domaine, il existe encore peu d’options thérapeutiques pour le traitement ou la prise en charge de la gamme de sous-types de dystrophie. Cette limitation des thérapies viables est due à plusieurs facteurs clés : 1) la difficulté des stratégies de thérapie génique, 2) une fréquence élevée de cas de maladie de novo et le manque correspondant de modèles animaux traduisibles, et 3) l’absence de stratégies rigoureuses pour tester les conséquences physiologiques des agents thérapeutiques présumés avec des mesures de résultats claires et reproductibles.
Pour surmonter certaines de ces limitations, de nombreux laboratoires, dont le nôtre, utilisent le poisson-zèbre comme système pour modéliser et étudier les maladies neuromusculaires humaines2. À ce jour, le poisson-zèbre s’est avéré être un outil précieux dans la recherche sur les maladies. Le modèle du poisson-zèbre a été utilisé pour identifier et valider de nouvelles mutations causant des maladies humaines16,17, élucider des mécanismes non caractérisés causant des maladies17,18 et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques12,19. Ces progrès ont été réalisés, en partie, par les forces canoniques du système du poisson-zèbre telles que leur clarté optique, leur facilité de manipulation génétique et leur capacité à se reproduire en grand nombre20. Les poissons-zèbres se sont également révélés aptes aux criblages de médicaments à grande échelle21, une méthode précieuse pour l’identification de nouvelles thérapies22-24. En ce qui concerne la recherche sur les maladies musculaires, ces forces sont complétées par la capacité d’isoler les fibres musculaires squelettiques du poisson-zèbre par dissociation25 et par la capacité d’examiner l’organisation des myofibres in vivo à l’aide du phénomène optique appelé biréfringence26, qui permet collectivement de déterminer rapidement l’intégrité musculaire macroscopique. Indépendamment de ces utilitaires disponibles, le développement d’outils supplémentaires est continuellement nécessaire pour faire avancer l’enquête.
Nous, et d’autres, avons adapté un protocole d’injection et d’analyse de l’EBD dans le modèle du poisson-zèbre. L’EBD est un colorant vital perméable aux cellules qui est absorbé par les cellules endommagées, en dégénérescence ou apoptotiques, puis visualisé sous fluorescence27. À ce jour, l’analyse EBD a été largement utilisée pour analyser l’intégrité de la membrane musculaire dans des modèles murins de maladies musculaires et cardiaques8,9,27. Cependant, dans les préparations de mammifères, le muscle récolté nécessite généralement une section ou une dissection laborieuse avant l’analyse. Chez le poisson-zèbre, l’analyse directe est possible en grand nombre à partir d’animaux vivants et intacts. Dans cet article vidéo, nous allons démontrer la méthodologie pour effectuer l’injection et l’analyse de l’EBD dans les larves de poisson-zèbre vivantes, avec des images représentatives de l’absorption de l’EBD dans la lignée mutante de dystrophie du poisson-zèbre sapje15,28. De plus, nous présentons une stratégie de co-injection qui permet une quantification accrue des préparations d’EBD.

<table><tbody><tr><td>Fluorescéine isothiocyanate-dextran MW 10 000</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Evan’s Blue Dye</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>Fischerbrand</td><td>FB0875712</td><td>Base de moule d’injection</td></tr><tr><td>Capillaires en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Pour aiguille d’injection</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Moule d’injection</td></tr><tr><td>Moule de micro-injection</td><td>Outils de science adaptatifs</td><td>TU-1</td><td>Moule d’injection</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>Solution de Ringer</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>Solution de</td></tr><tr><td>Ringer Chlorure de magnessium hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>Solution de Ringer</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique monohydraté</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Solution de Ringer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Solution de Ringer</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Solution de Ringer</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C1061</td><td>Solution de Ringer</td></tr></tbody></table>

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Le modèle du poisson zèbre est un système émergent pour l’étude des troubles neuromusculaires. Dans l’étude des maladies neuromusculaires, l’intégrité de la membrane musculaire est un déterminant critique de la maladie. À ce jour, de nombreuses affections neuromusculaires présentent des fibres musculaires en dégénérescence avec une intégrité membranaire anormale ; Ceci est le plus souvent observé dans les dystrophies musculaires. Le colorant bleu Evans (EBD) est un colorant vital perméable aux cellules qui est rapidement absorbé dans les cellules en dégénérescence, endommagées ou apoptotiques ; En revanche, il n’est pas absorbé par les cellules dont la membrane est intacte. L’injection d’EBD est couramment utilisée pour vérifier l’intégrité musculaire dans des modèles murins de maladies neuromusculaires. Cependant, de telles expériences EBD nécessitent une dissection musculaire et/ou une section avant l’analyse. En revanche, l’absorption de l’EBD chez le poisson-zèbre est visualisée dans des préparations vivantes et intactes. Ici, nous démontrons une méthodologie simple et directe pour effectuer des injections et des analyses d’EBD chez des poissons-zèbres vivants. De plus, nous démontrons une stratégie de co-injection pour augmenter l’efficacité de l’analyse EBD. Dans l’ensemble, cet article vidéo fournit un aperçu de la réalisation de l’injection et de la caractérisation de l’EBD dans des modèles de poissons zèbres de maladies neuromusculaires.

Le mélange d&#39;injection EBD a été injecté dans la CCV de mutants homozygotes sapje frères et sœurs de type sauvage à 3 DPF. Les injections qui ont rempli les cavités cardiaques (figure 1B) ont ensuite été analysées pour l&#39;injection avec succès par la visualisation de FITC-dextran dans le système vasculaire sous fluorescence verte (figure 2). Après une période d&#39;incubation de 4 heures, EBD absorption a été examinée au niveau des somites utilisant la microscopie à fluorescence. Frères et sœurs de type sauvage ne ​​présentaient pas de fluorescence à l&#39;intérieur de EBD des fibres musculaires visibles (Figure 3A), tandis que les mutants homozygotes sapje EBD ont montré l&#39;absorption, ce qui indique des dommages à la membrane musculaire 15 (figure 3B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> Figure 1. Injecter EBD mélange d&#39;injection dans la veine cardinale commune (CCV) d&#39;un poisson zèbre Embryo. Embryon (A) non injectée. La flèche indique l&#39;emplacement idéal pour l&#39;injection de CCV. (B) d&#39;injection réussie dans la CCV. Le colorant pénètre dans les cavités cardiaques (flèche) et commence à être pompé à travers le système vasculaire. (C) Une injection de CCV échec se traduira par une partie ou tout le colorant entrant dans le sac vitellin de l&#39;embryon (flèche). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> Figure 2. Les embryons peuvent être triés pour injection réussie en observant la distribution de FITC-dextran sous fluorescence verte à travers le système vasculaire immédiatement après l&#39;injection et avant EBD absorption.S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> Figure 3: EBD sera repris par fibres avec des membranes endommagées fratrie (A) de type sauvage ne ​​présentant pas de fluorescence EBD dans les fibres musculaires.. (B) Sapje ​​mutant homozygote avec EBD fluorescence à l&#39;intérieur des fibres musculaires multiples (flèches). Toutes les larves ont été injectés avec le mélange d&#39;injection EBD et analysée après une période d&#39;incubation de 4 heures à 3 dpf. Frères et sœurs et mutants ont été classés par le détachement de la fibre musculaire avant l&#39;injection de CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Dans cette étude, nous décrivons une méthode simple pour effectuer une analyse Evans Blue Dye (EBD) sur des larves de poisson-zèbre. Cette technique est un outil puissant pour la caractérisation de l’intégrité des muscles squelettiques et la délimitation des modèles de dystrophie musculaire chez le poisson-zèbre, et constitue une méthode précieuse pour le développement de nouvelles thérapies.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

L'objectif général de l'injection de bleu d'Évans et de dextrine Fitzy dans la veine cardinale commune est d'observer l'intégrité de la membrane du muscle squelettique chez des zebrafish vivants afin de contribuer à la caractérisation des mécanismes responsables de maladies liées à divers sous-types de dystrophie musculaire. L'injection de bleu d'Évans peut aider à révéler les mécanismes biologiques impliqués dans la pathologie de la maladie lors de l'analyse de modèles animaux de dystrophie musculaire ; elle peut également enrichir notre compréhension des mécanismes thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être réalisée et analysée à l'aide de zebrafish vivants.En outre, l'injection concomitante de Fitz Dextrin constitue un contrôle de qualité pour une injection réussie, ce qui améliore la rigueur et la quantification. Les implications de cette technique concernent l'utilité de la validation des modèles de zebrafish des maladies musculaires. Elles permettent également d'approfondir la compréhension de la manière dont certaines mutations conduisent à des phénotypes de maladies musculaires, tels que la dystrophie musculaire, ce qui est essentiel pour trouver des traitements et des guérisons.Pour préparer les plaques d'injection d'agar, faire bouillir de 2 à 3 % d'aros dans le milieu E trois et laisser refroidir légèrement la solution sur la paillasse. Verser environ 35 millilitres de l'agar refroidi dans chaque boîte de 100 millimètres. Ensuite, placer une extrémité du moule d'injection choisi dans la solution avant de poser le reste du moule sur la solution d'agar.Laisser la solution d'agarose se solidifier à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Ensuite, utiliser une spatule pour détacher une extrémité du moule de l'agarose solide et retirer lentement le reste du moule. Préparer une solution mère à 1 % de colorant bleu d'Évans ou EBD dans une solution de Ringer 1x.Préparez ensuite une solution mère de Fitzy Dextrin dans une solution de Ringer 1x et conservez-la à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer le mélange d'injection, diluez l'EBD à 0,1 % directement dans la solution mère de Fitz Dextrin, vortexez soigneusement le mélange d'injection et protégez-le de la lumière directe en enveloppant le tube avec du papier d'aluminium avant l'injection. Préchauffez la plaque d'injection à température ambiante.Placer le micromanipulateur sur une plaque métallique et le positionner à côté du microscope d'injection. Allumer le contrôleur d'injection microscopique à air comprimé. Ensuite, remplir la pipette d'injection en arrière avec environ deux à quatre microlitres du mélange EBD.Ensuite, étalonnez le volume d'injection avec environ cinq nanolitres de mélange EBD. Puis utilisez une solution de Ringer à 1× pour humidifier la plaque d'injection et retirez l'excès de solution des puits. Prétraitez les larves avec 0,04 % de trica dilué dans une solution de Ringer à 1× afin d'immobiliser complètement les larves avant l'injection à l'aide d'une pipette en verre. Placez les larves anesthésiées dans les puits des plaques d'injection à vis sans fin, en veillant à ce qu'elles soient entièrement logées dans les puits et positionnées sur le côté.Retirez l'excès de solution trica afin de minimiser les mouvements des larves dans le puits, mais laissez-en suffisamment pour éviter la déshydratation. Placez la plaque d'injection contenant les larves sous un microscope stéréoscopique et positionnez l'aiguille de la pipette d'injection contenant l'EBD. Mélangez au-dessus d'une larve de poisson zèbre près du cœur et selon un angle d'environ 45 degrés par rapport à l'axe antéro-postérieur.Insérez l'aiguille d'injection dans la veine cardinale commune ou CCV, près de la partie antérieure du vitellus, là où la veine commence à s'incurver en direction dorsale. Ensuite, injectez cinq nanolitres du mélange EBD et maintenez l'aiguille d'injection en place pendant cinq à huit secondes. Pour minimiser la fuite immédiate du mélange EBD, une bonne injection doit montrer le colorant dans les cavités cardiaques, et elle peut être répétée.Si le DMX EB n'est pas observé dans le cœur immédiatement après une injection réussie, l'embryon accumulera du dextran Fitz dans la vascularisation, comme illustré ici. Après avoir injecté le nombre souhaité de larves, remettez les larves dans une solution de Ringer 1 x sans trica dans des boîtes de 100 millimètres afin d'augmenter le taux de survie et de maintenir l'intensité du signal. Conservez les boîtes enveloppées dans du papier d'aluminium.Incuber les larves à 28,5 degrés Celsius pendant quatre à six heures afin de garantir une absorption efficace du DSE. Pour visualiser le DSE dans le muscle, utiliser 0,04 % de trica afin d'anesthésier les larves avant d'observer celles-ci en fluorescence rouge. Le DSE a été injecté dans la VCC de mutants Sapia homozygotes et de leurs frères et sœurs de type sauvage à 3 DPF ; les injections qui ont rempli les cavités cardiaques, comme illustré ici, ont ensuite été analysées pour évaluer une perfusion réussie du colorant en visualisant la dextrine marquée en vert dans la vascularisation sous fluorescence verte.Après une période d'incubation de quatre heures, la prise en charge de l'EBD a été examinée au niveau des myotomes, comme illustré sur cette figure. Les embryons frères de type sauvage n'ont montré aucune fluorescence au bleu d'Evans dans les fibres musculaires visibles, tandis que les mutants homozygotes pour sapia présentaient une incorporation de l'EBD, indiquant un dommage au niveau de la membrane musculaire. Une fois maîtrisée l'injection du bleu d'Evans dans la veine cardinale commune des poissons zèbres, les larves peuvent être traitées en 30 à 60 minutes, selon le nombre de larves injectées.En outre, des résultats expérimentaux peuvent être obtenus en une seule journée afin d'assurer la maîtrise. Il est important de bien viser la veine cardinale afin d'obtenir des résultats cohérents et interprétables. Cela peut s'avérer difficile et nécessitera probablement de la pratique après avoir suivi cette procédure.D'autres méthodes peuvent être réalisées, comme des cribles chimiques et génétiques, afin de déterminer les mécanismes moléculaires responsables des lésions membranaires associées aux dystrophies musculaires. Ces expériences peuvent aider à établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies musculaires après leur mise au point. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les maladies musculaires pour explorer l'intégrité membranaire dans des modèles de zebrafish de dystrophie musculaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la méthode d'injection du colorant bleu d’Evan dans la veine cardinale commune des larves de poisson zèbre. Vous devriez également savoir identifier les fibres musculaires présentant des lésions membranaires en raison de la présence du colorant bleu d’Evan à l'intérieur des fibres.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Poisson zèbre sont d'un nouveau système pour la modélisation de maladies humaines du muscle squelettique. Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour isoler les fibres musculaires des muscles squelettiques de poisson zèbre embryonnaire et larvaire. Cette méthode produit une préparation de haute densité myofiber approprié pour l'étude de la morphologie unique de fibres de muscle squelettique, la localisation subcellulaire des protéines, et la physiologie des muscles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

mesures de force peuvent être utilisés pour démontrer les changements de la fonction musculaire en raison du développement, les blessures, la maladie, le traitement ou la toxicité chimique. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la force lors d'une contraction maximale du poisson zèbre muscles du tronc larvaire.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Le poisson-zèbre est maintenant un outil établi et puissant pour modéliser les dystrophies musculaires, les myopathies congénitales et les maladies neuromusculaires associées. La biréfringence et le comportement d’évasion évoqué par le toucher sont deux tests non invasifs courants utilisés pour déterminer le degré de désorganisation musculaire et de déficience locomotrice des embryons de poisson-zèbre au cours du développement précoce.

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques.

Méthodes d'évaluation de Subcellular compartiments de muscle en C. elegans

Les poissons-zèbres sont un excellent modèle pour étudier la fonction musculaire et les maladies. Au début de l’embryogenèse, le poisson-zèbre commence à contracter régulièrement ses muscles, produisant un comportement de nage rythmé, qui est modifié lorsque le muscle est perturbé. Nous décrivons ici un test de réponse et de locomotion évoquée par le toucher pour examiner les performances de natation comme mesure de la fonction musculaire.

Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish

L’analyse par éléments finis est un outil fréquemment utilisé pour étudier les performances mécaniques des structures sous charge. Ici, nous appliquons son utilisation à la modélisation de la biomécanique de la mâchoire du poisson-zèbre.

Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Ici, nous avons utilisé la coloration rouge alizarine pour montrer que l’exposition à l’acétate de plomb provoque un changement de masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cette méthode de coloration peut être adaptée à l’étude de la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre induite par d’autres substances toxiques dangereuses.

Utilisation de la coloration rouge Alizarin pour détecter la perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre

La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.

Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

Ce protocole décrit un modèle de cryoblessure pour induire des dommages profonds de plusieurs myomères caudales chez le poisson zèbre adulte. Cette méthode fournit une nouvelle approche pour étudier la régénération des muscles squelettiques après une perte importante de tissu chez les vertébrés non mammifères.

Un modèle de cryoblessure pour étudier la régénération des muscles squelettiques du pédoncule caudal chez le poisson-zèbre adulte

Apprenez à évaluer l'intégrité des muscles squelettiques chez les larves de poisson zèbre Danio rerio en utilisant le colorant bleu Evans. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de la dystrophie musculaire et de développer de nouvelles thérapeutiques.

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