L'étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

L'objectif général de l'expérience suivante est de visualiser la distribution et la stœchiométrie des récepteurs du facteur de croissance épidermique, ou EGFR, dans la membrane plasmique de cellules intactes et hydratées, à l'aide de la microscopie à fluorescence et de la microscopie électronique. Pour ce faire, on commence par cultiver des cellules exprimant l'EGFR, telles que les cellules COS-7, sur des micropuces comportant une membrane de nitrure de silicium d'une épaisseur de 50 nanomètres recouvrant une zone centrale en forme de fenêtre. Ensuite, les cellules sont incubées avec une version biotinylée du facteur de croissance épidermique qui se lie au récepteur et modifie la conformation de l'EGFR, entraînant sa dimérisation et son activation.

Ensuite, les cellules sont fixées afin d'immobiliser les récepteurs et incubées avec des points quantiques conjugués Hagen privés de leur revêtement, qui se lient aux récepteurs activés par l'EGF, puis les cellules sont observées. Enfin, une seconde fixation au glutaraldéhyde crée des liaisons croisées entre l'habitat dépouillé des points quantiques conjugués et le récepteur EGFR, stabilisant ainsi l'échantillon pour la microscopie électronique. Les résultats montrent une émission de fluorescence rouge par imagerie de points quantiques fluorescents, ainsi que la distribution du EGFR, son état stœchiométrique ou son regroupement via la microscopie électronique en transmission en balayage.

Cette méthode fournit des informations uniques sur la géométrie et la distribution des récepteurs membranaires dans des cellules intactes et peut être utilisée pour mieux comprendre l'activation du récepteur du facteur de croissance épidermique dans les cellules normales et cancéreuses. Elle peut également être appliquée à l'étude d'autres récepteurs membranaires, tels que les canaux ioniques. Commencez en travaillant sous une hotte chimique. Pour les premières étapes de préparation des micropuces en membrane de nitrure de silicium et après immersion dans de l'acétone conformément au protocole écrit, transférez directement les micropuces dans un bécher contenant de l'éthanol et attendez deux minutes, retirez les puces de l'éthanol et placez-les sur un tissu de salle propre.

Lorsque les puces sont sèches, transférez-les sur une lame de verre préalablement placée dans une boîte de Pétri. Ensuite, placez le couvercle sur la boîte. Puis, insérez la lame de verre avec les micropuces dans un nettoyeur à plasma.

Exécutez un programme de nettoyage standard de cinq minutes pour rendre la surface de la membrane de nitrure de silicium hydrophile. Ensuite, sous la hotte à flux laminaire, transférez les microplaquettes depuis le verre. Faites-les glisser sur un tissu de salle propre avant de les placer dans un puits d'une plaque de 24 puits remplie de solution de poly-L-lysine ou PLL, puis incubez pendant cinq minutes.

Ensuite, transférez un par un les micropuces dans un deuxième puits contenant de l'eau de qualité HPLC avant de les rincer dans un deuxième puits d'eau. Enfin, placez individuellement les micropuces dans des puits remplis de DM d'une plaque 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à dioxyde de carbone en utilisant une sous-culture de cellules COS sept. Préparez une suspension cellulaire monodispersée avec une concentration d'environ cinq fois dix puissance quatre.

Cinquième cellule par millilitre. Ajouter une goutte de suspension cellulaire à chaque micropuce de la plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant cinq minutes avec un microscope inversé. Commencer à examiner les zones des micropuces afin d’obtenir une densité approximative de 20 à 30 cellules cos sept par fenêtre de 150 par 400 micromètres.

Lorsque les cellules se sont suffisamment fixées, transférez délicatement les micropuces, avec l'espacement cellulaire vers le haut, dans de nouveaux puits contenant du dm. Lorsque suffisamment de cellules sont restées adhérentes, transférez les micropuces, avec les cellules orientées vers le haut, dans de nouveaux puits contenant du dmm sans sérum. Ensuite, incubez les micropuces à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant plusieurs heures, voire toute une nuit, avant les étapes suivantes.

À l’aide d’une plaque de 96 puits, remplir à nouveau les puits avec les solutions nécessaires et utiliser une rangée ou une colonne par micropuce. Rincer les micropuces en les plaçant dans un puits contenant du B-S-A-G-E-L-P-B-S frais et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer les micropuces dans une solution d’EGF biotine à 300 nanomolaire et les replacer dans l’incubateur pendant trois minutes, car les cellules commenceront à internaliser l’EGFR marqué par l’EGF.

Rincez rapidement les microplaquettes avec du PBS trois fois. Ensuite, rincez les échantillons avec du tampon au catéchol 0,1 M ou du CB. Ensuite, transférez les microplaquettes dans du PFA à 3 % et incubez pendant 10 minutes.

Après un rinçage avec CB et trois rinçages avec du PBS, transférez les puces dans du G-L-Y-P-B-S et incubez pendant deux minutes. Rincez ensuite deux fois avec du PBS. Placez ensuite les micropuces dans du S-T-R-Q-D 10 NANOMOLAIRE pendant 10 minutes, puis rincez quatre fois avec du B-S-A-P-B-S.

Ensuite, immergez une micropuce dans une boîte de culture de 35 millimètres à fond en verre préremplie de B-S-A-P-B-S à température ambiante pour observer les cellules en microscopie DIC et en microscopie de fluorescence. Utilisez un objectif à air de 40 x pour les images d'ensemble des cellules marquées avec des points quantiques 655. Utilisez un cube de filtres qui excite les points quantiques entre 340 et 380 nanomètres avec une émission supérieure à 420 nanomètres.

Minimisez l'intensité lumineuse afin d'éviter deux sources lumineuses intenses susceptibles d'endommager l'échantillon. Réglez le temps d'exposition à au moins 300 millisecondes afin que les signaux de tous les QD soient captés, car la fluorescence des QD clignote ; ajustez l'intensité lumineuse et l'amplification pour obtenir des images lumineuses sans bruit visible, tout en minimisant l'intensité lumineuse. Après l'acquisition d'images, replacez la puce microfluidique dans une plaque de 96 puits contenant du B-S-A-P-B-S.

Rincer une fois dans du CB, puis transférer dans du glutaraldéhyde à 2 % et incuber encore 10 minutes. Rincer et utiliser du PBS contenant de l'albumine sérique bovine (BSA) pour laver la puce trois fois ; conserver la puce dans des puits préremplis de PBS contenant de l'albumine sérique bovine (BSA) dans une nouvelle plaque de 96 puits, un puits par puce. Remplir une rangée de quatre puits avec de l'eau de qualité HPLC.

Après avoir configuré le MEBE selon le protocole décrit, chargez un échantillon dans le porte-objet STEM prérefroidi du MEBE en sortant la plaque 96 WAT du contenant réfrigérant et en la plaçant près du porte-objet ouvert. Placez un mouchoir de salle propre à côté. Rincez rapidement une micropuce en l'immergeant quatre fois, pendant une seconde à chaque fois, dans un puits rempli d'eau de qualité HPLC.

Épongez brièvement l'arrière du microcircuit sur le tissu et placez-le sur le plateau prérefroidi contenant trois microlitres d'eau de qualité HPLC refroidie. Humidifiez la surface de l'échantillon et fixez l'échantillon sur le plateau. Ajoutez ensuite trois gouttes supplémentaires d'eau de trois microlitres sur le plateau, à proximité de l'échantillon, puis fermez la chambre d'échantillonnage.

Après avoir identifié une cellule d'intérêt, conformément au protocole écrit, enregistrez une image d'aperçu STEM de la cellule, puis déplacez-vous vers une région périphérique de la cellule où la bordure cellulaire est visible et zoomez jusqu'à une magnification de 50 000 X. Enregistrez des images montrant les points quantiques individuels en utilisant des temps de séjour par pixel de 20 à 30 microsecondes. Les images présentées ici montrent des points quantiques QD 655 marquant l'EGFR liée à la membrane dans des cellules COS sept complètes et entièrement hydratées. L'image CIDI illustre ici la topographie de la membrane des cellules, et l'image de fluorescence correspondante montre la distribution de l'EGFR sur toute la surface de la cellule après trois minutes d'incubation avec l'EGF biotinylée.

Ces images STEM en MEB à faible grossissement révèlent des structures fines telles que des filopodes s'étendant depuis la cellule vers les cellules voisines, ainsi que certaines structures situées à l'intérieur des régions cellulaires plus minces. Les régions cellulaires centrales épaisses, notamment le noyau, apparaissent en blanc car la transmission à travers l'échantillon n'est pas possible pour les électrons dotés de l'énergie utilisée. Haute résolution.

Les images ESEM STEM des régions périphériques plus minces montrent des marqueurs QD sur un repli membranaire traversant diagonalement l'image. Cette structure membranaire présente une densité d'EGFR plus élevée que les régions membranaires environnantes à plusieurs endroits, deux marqueurs étant en proximité étroite. Deux exemples avec des distances de 20 et 24 nanomètres sont indiqués par des flèches.

Ces paires d'étiquettes sont interprétées comme appartenant à des EGFR. Cette image a été enregistrée dans une région présentant une densité et un signal fluorescent d'EGFR plus faibles. Néanmoins, des EGFR ont également été observés sous forme de dimères, et deux agrégats de 10 ou 11 EGFR étaient présents.

Une fois maîtrisée, la préparation des échantillons peut être réalisée en moins de deux heures, bien plus rapidement que les techniques couramment utilisées en microscopie électronique. L'imagerie STEM essem ultérieure peut fournir jusqu'à 100 images haute résolution en moins d'une demi-journée.