Name: Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez l'extraction automatisée d'ADN à partir de lignées cellulaires FFPE et la détection des mutations BRAF V600E par PCR en gouttelettes numériques. Cette méthode améliore la qualité et la fiabilité des analyses en oncologie moléculaire.

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Cette recherche a été financée par le Programme de R &amp; D pour la Société de la National Research Foundation (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. extraction d&#39;ADN à partir de la FFPE standard de référence des lignées cellulaires Remarque: Pour cette procédure, l&#39;extraction d&#39;ADN a été réalisée à partir de lignées de cellules standards de référence FFPE (HD598, HD593, HD617, HD273 et de type sauvage (WT)) en utilisant le kit d&#39;isolement d&#39;ADN de tissu FFPE de la manière décrite dans le protocole ci-dessous. Extraction de l&#39;ADN automatisé a été réalisé en suivant les instructions du fabricant pour l&#39;isolement de l&#39;ADN total. <ol><li> En utilisant un microtome et le bloc FFPE original, préparer de nouvelles sections manuellement avant l&#39;extraction et l&#39;analyse de l&#39;ADN, selon les procédures établies. Assurez-vous que l&#39;entrée d&#39;échantillon pour la section (s) de tissu analysé ne dépasse pas une épaisseur totale combinée de 10 um et que la surface spécifique ne dépasse pas 600 mm 2 pour un seul article. </li></ol> 1.2 protocole TPS Remarque: Les volumes indiqués dans le tableau 1 correspondent au minimum requis pour traiter les 48 échantillons, et la procédureindiqué est en conformité avec les lignes directrices de TPS. Avant de commencer l&#39;expérience installer les échantillons FFPE dans l&#39;e-tubes par centrifugation à 600 xg, pour éviter la perte des échantillons durant le programme automatisé. <ol><li> Allumez l&#39;instrument et l&#39;ordinateur automatisé d&#39;isolement d&#39;ADN. Ouvrez le logiciel de commande Exécuter et insérez un plateau de chargement automatique dans la zone pont de chargement TPS. </li><li> Distribuer des réactifs dans leurs creux correspondants comme représenté sur la figure 1. <ol><li> Placez les 4 échantillons (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% et 1%) dans les racks de support de l&#39;échantillon. </li><li> Placez les boîtes de pointe dans les creux des colonnes 2 et 3 et de vérifier les conseils de la présence de plus d&#39;un filtre par la pointe, ce qui annulerait la course. </li><li> Assurer le bon mélange du tampon de lyse et tampon de lavage en les inversant 3-5 fois et de les charger dans les creux respectifs de la colonne 4 (Figure 1). </li><li> Après avoir inversé pour quelques heures ou vort légèreExing, charger le tampon d&#39;élution, des billes magnétiques, et le tampon de la FFPE dans les petits creux dans la colonne 5, en laissant 1 emplacement vide où indiquée (Figure 1, Tableau 1). </li><li> Chargez une plaque de puits profond de 2 ml (DWP) sur le support de plaque (Figure 1). </li></ol></li><li> Effectuez les dernières étapes suivantes avant de commencer une course: <ol><li> Déboucher tous les tubes et les creux de réactifs. Assurez-vous que la capacité suffisante est disponible dans la bouteille de déchets liquides. Assurez-vous que la bouteille de déchets solides est vide et munie d&#39;un sac de Biohazard. Assurez-vous que la plaque pointe d&#39;éjection est centré dans l&#39;ensemble des déchets. </li><li> Fermez le capot avant. </li></ol></li><li> Démarrez le logiciel. Ouvrez le fichier NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. L&#39;état de l&#39;instrument passe du ralenti à la course. </li><li> Entrez le nombre d&#39;échantillons pour cette course. Choisissez la méthode souhaitée pour cette course (ADN = 0). Entrez la position du premier vol hauteume pointe, la sélection de &quot;1&quot; si tous les bacs sont pleins. Entrez la position de la première pointe de volume standard, sélectionner &quot;1&quot; si tous les bacs sont pleins. Remarque: L&#39;instrument sera alors courir à travers étapes automatisées, sans intervention de l&#39;utilisateur. Un flux de travail détaillé est présenté à la figure 2. Une fois que l&#39;expérience est terminée, les déchets de réactif et des conseils sont injectés dans l&#39;ensemble des déchets. </li><li> Quantifier l&#39;ADN génomique purifié à l&#39;aide d&#39;un procédé fluorimétrique. Note: Des échantillons d&#39;ADN qui contiennent une concentration minimale de 3,3 ng / ul sont soumis à une analyse ddPCR (section 2). </li></ol> 2. mutation de l&#39;ADN Profilage: Protocole ddPCR Remarque: Le protocole de mutation de l&#39;ADN profilage se compose de 3 grandes étapes: 1) la génération des gouttelettes, 2) l&#39;amplification par PCR conventionnelle, 3) la lecture des gouttelettes et 4) mutation de l&#39;ADN profilage. 2.1. Génération Droplet Remarque: ddPCR supermix estrecommandé pour ddPCR, que ce mélange contient les réactifs nécessaires pour la production de gouttelettes. <ol><li> Pour éviter la contamination, suivre les précautions standard, telles que le port de gants, en utilisant une hotte propre PCR, pipettes propres, et des tubes à faible liaison aux protéines. </li><li> Assurez-vous que la concentration minimale de l&#39;échantillon d&#39;ADN génomique humain est de 3,3 ng / ul. Note: La quantité de concentration de l&#39;échantillon d&#39;ADN purifiée varie en fonction de l&#39;analyse de détection de fréquence de mutation%. </li><li> Assembler mélanges de réaction dans des plaques de PCR à 96 puits. Décongeler et équilibrer les composants de la réaction à la température ambiante. Préparer les réactions PCR en combinant 2X ddPCR supermix (10 pi) et 20 amorces (avant et arrière, 900 nM) et d&#39;une sonde (250 nM) pour chaque échantillon d&#39;ADN purifié (66ng / 2 pi) faire jusqu&#39;à 20 pi avec de l&#39;eau distillée (comme par le protocole de générateur de gouttelettes) </li><li> Vortexer le mélange soigneusement pour assurer l&#39;homogénéité et centrifuger brièvement pour rassembler le contenu au fond du tube avant la distribution. Charge &amp; # 20181; l sur la cartouche pour la formation de gouttelettes. </li><li> Le fonctionnement du générateur de gouttelettes, selon le protocole recommandé par le fabricant <ol><li> Insérer la cartouche dans le support avec l&#39;encoche de la cartouche positionnée sur le côté supérieur gauche de la porte. Ajouter 20 pi de mélange réactionnel contenant des échantillons dans le milieu, et 70 ul d&#39;huile de générateur dans les puits de fond. </li><li> Attacher le joint d&#39;étanchéité dans la partie supérieure de la cartouche. Assurez-vous que le joint soit correctement accroché sur les deux extrémités du support; Sinon, la pression suffisante pour la génération de gouttelettes ne sera pas atteint. </li><li> Ouvrez le générateur de gouttelettes en appuyant sur le bouton vert sur le dessus de l&#39;appareil et insérez la cartouche. Lorsque le titulaire est dans la bonne position, à la fois la puissance (de gauche à droite) et titulaire (au milieu à droite) voyants sont au vert. </li><li> Appuyez sur le bouton en haut sur l&#39;instrument à nouveau pour fermer la porte et d&#39;initier la génération de gouttelettes. Remarque: Après avoir appuyé sur le button, a positions multiples se sur les puits de sortie, dessin pétrole et des échantillons à travers les canaux microfluidiques, où les gouttelettes sont créés. Gouttelettes se jettent dans la gouttelette bien, où ils accumulent. L&#39;indicateur de gouttelettes de lumière (à droite) clignote en vert après 10 secondes pour indiquer que la génération de gouttelettes est en cours. </li><li> Lorsque la génération des gouttelettes est terminée, tous les 3 voyants changent au vert solide; ouvrir la porte en appuyant sur le bouton, et retirez le support de l&#39;unité. Retirez le joint du support jetable et jetez-le. Remarque: Les meilleurs puits de la cartouche contiennent des gouttelettes, et les puits moyenne et inférieure sont presque vides, avec une petite quantité d&#39;huile résiduelle. </li></ol></li></ol> 2.2. Préparation pour la PCR <ol><li> Pour chaque échantillon, pipette à 40 ul du contenu de gouttelettes à partir du haut et les cartouches dans un seul puits d&#39;une plaque à 96 puits PCR recommandé comme indiqué dans le protocole de l&#39;instrument par le fabricant. Nonte: aide d&#39;une pipette multi-canal est idéal pour transférer les gouttelettes des émulsions. Aspiration lente et douce de gouttelettes est recommandée afin de minimiser le cisaillement de gouttelettes pendant les transferts. </li><li> Sceller la plaque PCR avec du papier immédiatement après le transfert de gouttelettes pour éviter l&#39;évaporation. Utilisation perforable joints de plaques de feuille qui sont compatibles avec la plaque PCR et scellant les aiguilles dans le lecteur de gouttelettes. Suivez les instructions dans le manuel d&#39;instruction de scellant pour plaques PCR. </li><li> Régler la température de la plaque de scellement à 180 ° C et le temps de 5 sec. </li><li> Appuyez sur la flèche pour ouvrir la porte du bac. Placez le bloc de support sur le plateau avec le côté 96 puits vers le haut. Placer la plaque à 96 puits sur le bloc de support et de sorte que tous les puits de la plaque sont alignés avec le bloc de support. </li><li> Recouvrir la plaque de 96 puits avec 1 feuille de papier d&#39;aluminium percé. Une fois la plaque 96 puits est fixé sur le bloc de support et couvert avec le papier d&#39;aluminium percé, appuyez sur le bouton d&#39;étanchéité. Le plateau se refermeet la chaleur étanchéité va initier. </li><li> Lorsque le thermoscellage est terminée, la porte ouvre automatiquement; retirer la plaque du bloc thermique pour le cyclage thermique, puis retirez le bloc thermique. </li><li> Veiller à ce que tous les puits de la plaque sont scellés en vérifiant que des dépressions dans la feuille sont facilement visibles sur chaque puits. Une fois scellé, la plaque est prêt pour le cyclage thermique. </li><li> Une fois gouttelettes sont supprimés, appuyez sur les loquets sur le support de la cartouche pour l&#39;ouvrir. Retirez la cartouche vide et le jeter. </li><li> Effectuer une amplification par PCR conventionnelle en suivant les paramètres détaillés dans le tableau 2. </li></ol> 2.3 lecture Droplet (selon le protocole recommandé par le fabricant) Note: Après amplification par PCR de la cible d&#39;acide nucléique dans les gouttelettes, l&#39;appareil de lecteur de gouttelettes analyse chaque gouttelette individuellement en utilisant un système de détection 2-couleur 13. Nous généralement configuré pour détecter un FAMd VIC fluorophores rapporteurs. <ol><li> Cliquez sur &quot;système de rinçage» pour amorcer le lecteur de gouttelettes et de le rendre prêt pour l&#39;analyse ddPCR. </li><li> Chargez la plaque dans le lecteur de gouttelettes et cliquez sur &quot;Démarrer&quot;. Le lecteur de gouttelettes aspire chaque échantillon, singulates les gouttelettes et les flux en file indienne devant un détecteur 2-couleur. Le détecteur lit les gouttelettes d&#39;énumérer les échantillons positifs et négatifs. </li><li> Lorsque gouttelettes lecture est terminée, ouvrez la porte et retirez le support de plaque de l&#39;unité. Retirer la plaque PCR 96 puits de la porte et le jeter. </li><li> Pour un bon entretien, remplacer l&#39;huile de lecteur de gouttelettes et vider la poubelle, au besoin. Ajouter 50 ml d&#39;eau de Javel à 10% à la bouteille de déchets pour empêcher la croissance microbienne. </li></ol> 2.4 mutation de l&#39;ADN profilage (selon le protocole recommandé par le fabricant) Remarque: gouttelettes PCR-positives et PCR-négatifs sont comptés pour fournir quantific absolueation des cibles mutations BRAF V600E ADN sous forme numérique, en utilisant un logiciel d&#39;analyse de données. <ol><li> Cliquez sur Configuration pour entrer des informations sur les échantillons, des essais et des expériences. </li><li> Dans la fenêtre de configuration, charger une plaque (filename.qlp), puis cliquez sur Analyser pour ouvrir et analyser les données. L&#39;interface d&#39;analyse de données est séparé en trois fenêtres: Résultats Tableau, le sélecteur de puits et des données traitées / affichage graphique. </li><li> Dans la fenêtre données traitées, les données de concentration pour chaque cible apparaissent dans les puits dans le plan de la plaque et sont indiquées dans le tableau des résultats. Cliquez Concentration de visualiser les données dans les parcelles de concentration. </li></ol>

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<li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li>
</ol>

Myung Ryuri Oh, Eun Kim Si, et Young Kim Deug sont des employés de ABION CRO.

Ici, nous mettons en évidence l&#39;applicabilité de ddPCR et l&#39;isolement de l&#39;ADN à partir d&#39;échantillons de lignées cellulaires standards de référence FFPE une évaluation spécifique de la mutation du gène. Dans cette étude, TPS méthode d&#39;isolement d&#39;ADN automatisé est utilisé qui peut être facilement adapté, automatisé, et peut accueillir jusqu&#39;à 48 échantillons différents simultanément, permettant de plus grandes expériences à grande échelle et une plus faible variabilité. Une des limites de l...

L&#39;accumulation de mutations génétiques dans les gènes régulateurs clés modifie la programmation de la cellule normale, comme la prolifération cellulaire, la différenciation et la survie, menant au cancer 1. La voie de RAS-RAF kinase-MAP médie la réponse cellulaire aux signaux de croissance. Mutations oncogènes BRAF peuvent résulter de mutations du pilote dans le gène BRAF, qui peuvent causer l&#39;oncoprotéine BRAF pour devenir hyperactive 2. Des mutations dans le gène BRAF se traduisent également par la signalisation en aval par l&#39;intermédiaire d&#39;hyperactivité de MEK et ERK 3, qui, à son tour, conduit à une croissance cellulaire excessive et la prolifération indépendamment de la régulation de la croissance médiée par le facteur 6/4. Plusieurs outils sont disponibles pour les mutations de l&#39;ADN profilage, tels que quantitatives en temps réel des mutations BRAF V600E dans de formol, inclus en paraffine (FFPE) référence des lignes de cellules standard par ddPCR. ddPCR est une méthode basée sur la PCR pour la quantification absolue-offrant une plus grande précision par rapport à quantitative en temps réel classique de PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fournit également une plus grande puissance et de la précision de la résolution de la détection des mutations rares dans des matrices d&#39;ADN, permettant recherche sur le cancer et le diagnostic plus informative 9. Des avantages supplémentaires de ddPCR sur qPCR conventionnelle incluent sa sensibilité accrue et la précision lors de l&#39;étude des nombres de copies bas de modèle 10-12. Ici, un protocole d&#39;extraction automatique d&#39;ADN à partir de lignées de cellules standards de référence FFPE, suivie par détermination de la présence ou de l&#39;absence de mutations BRAF V600E par ddPCR est démontrée. L&#39;utilisation du logiciel d&#39;analyse de données et une représentation graphique des résultats sont également décrits. L&#39;ensemble de la procédure est relativement simple et dépend du nombre d&#39;échantillons à être profilées et le nombre de machines PCR et ddPCR classiques disponibles totalement. Le protocole suivant décrit les procédures standard pour BR<html> Des lignées de cellules positives AF-V600E FFPE référence standards (HD598, HD593, HD617, HD273 et de type sauvage (WT)) est réalisée dans un instrument entièrement automatisé en utilisant le système de préparation tissulaire (TPS) protocole. Par la suite, des échantillons d&#39;ADN isolés sont analysés pour la présence de mutations BRAF V600E utilisant le système ddPCR. Analyse de mutation ciblée est réalisée après que tous les échantillons ont été profilée et les données ont été chargées dans le logiciel d&#39;analyse des données. Selon le nombre d&#39;échantillons / groupes étudiés, l&#39;analyse des données peut exiger d&#39;une à plusieurs heures. Le composant expérimentale de la méthode nécessite une précision dans la manipulation <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Isoler Nucleic Acids de levure, une vidéo Éducation JoVE science expliquant plus sur sur le contexte de l&#39;ARN">de l&#39;ADN</a> etrologique Pipettes et pipettes, une vidéo JoVE enseignement des sciences en expliquant plus sur sur le contexte de pipetage &quot;&gt; pipetage en plaques à 96 puits, tandis que l&#39;analyse des données est effectuée en utilisant le logiciel.

<table><tbody><tr><td>Hamilton MICROLAB STARlet IVD Instrument</td><td>automatisé d’isolement d’ADN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siemens 10701001 QX200 Droplet Generator&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>772BR1119</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lecteur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad</td><td>771BR1497</td><td></td></tr><tr><td>Machine PCR conventionnelle capable de réglage</td><td></td> du temps de rampe <td>621BR17718</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Scelleuse de plaques PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>770BR1575</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel QuantaSoft</td> Kit d’isolement d’ADN <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de préparation des tissus VERSANT Boîte 1</td><td>Siemens</td><td>10632398</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT Réactifs de préparation des tissus Boîte 1</td><td></td> Astuces Siemens <td>10632399</td><td></td></tr><tr><td>CO-RE Analyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>des mutations</td><td></td><td></td><td></td>ddPCR</tr><tr><td>ddPCR Supermix&nbsp ;</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>BR186-3010</td> Cartouche DG8 <td>à concentration 2X</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>BR186-4008</td><td></td></tr><tr><td>Huile pour générateur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>BR-186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Joint</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>BR186-3006</td><td></td></tr><tr><td>Huile de lecteur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>Réf. BR-186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

employant numérique droplet pcr pour détecter des mutations braf v600e dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR est une méthode de PCR très sensible qui utilise un système d’émulsion eau-huile. À l’aide d’un générateur de gouttelettes, un échantillon d’acide nucléique extrait est divisé en ~20 000 gouttelettes d’eau dans l’huile de taille nanométrique, et l’amplification par PCR se produit dans des gouttelettes individuelles. L’approche ddPCR consiste à identifier les mutations de séquence, les altérations du nombre de copies et les réarrangements structurels sélectionnés impliquant des gènes ciblés. Ici, nous démontrons l’utilisation de la ddPCR comme une technique puissante pour quantifier avec précision les mutations rares de BRAF V600E dans les lignées cellulaires standard de référence FFPE, ce qui est utile pour identifier les personnes atteintes de cancer. En conclusion, la technique ddPCR offre la possibilité de profiler avec précision les mutations rares spécifiques dans différents gènes dans divers types d’échantillons FFPE.

Pour notre analyse ddPCR, nous avons étudié les références mutation FFPE lignes de cellules standard V600E BRAF. Le lecteur de gouttelettes se connecte à un ordinateur portable un logiciel d&#39;analyse de données informatique de fonctionnement. Chaque gouttelette individuelle est définie sur la base de l&#39;amplitude de fluorescence comme étant soit positif ou négatif. Le logiciel fourni par le fabricant permet également à un seuil défini par l&#39;utilisateur à saisir pour définir le seuil entre les gouttele...

Le but de cette vidéo est de montrer comment effectuer une extraction d&#39;ADN automatisée à partir des lignes de formol paraffine (FFPE) référence standards cellulaires et gouttelettes numérique PCR (ddPCR) analyse pour détecter des mutations rares dans un cadre clinique. Détecter des mutations dans des échantillons FFPE démontre l&#39;utilité clinique de ddPCR dans les échantillons FFPE.

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

L'objectif général de cette expérience est d'isoler l'ADN génomique humain à partir de lignées cellulaires de référence standards en forme fixée dans du paraffine à l'aide d'un système de préparation tissulaire, suivi de l'analyse des mutations BRAF V600E dans l'ADN génomique par PCR en gouttelettes numériques. La PCR-ddPCR peut aider à répondre à des questions clés en oncologie moléculaire, telles que la présence et l'abondance de mutations dans la séquence BRAF, ainsi que la quantification des acides nucléiques à faible nombre de copies matricielles. Bien que cette méthode soit démontrée ici sur des lignées cellulaires standards, elle peut également être appliquée à d'autres échantillons biologiques, à condition d'optimiser les conditions d'isolement de l'ADN ciblé.Ce système de préparation tissulaire permet d'isoler jusqu'à 48 échantillons d'ADN génomique humain exempt de contaminants en moins de quatre heures, par comparaison avec d'autres procédures manuelles. Ce système est relativement coûteux pour la préparation en raison de l'utilisation de billes magnétiques. Toutefois, il est plus sûr et produit des échantillons de haute qualité. La démonstration sera assurée par un A et un technicien de notre laboratoire.L'extraction de l'ADN sera effectuée à l'aide d'un instrument d'isolement de l'ADN entièrement automatisé, en utilisant le système de préparation des tissus ou le protocole TPS. Commencez par allumer l'appareil et l'ordinateur. Ouvrez le logiciel de contrôle des analyses et insérez un plateau de chargement automatique dans la zone de chargement du plateau TPS.Ensuite, distribuez les réactifs dans leurs cuvettes respectives comme indiqué dans cette figure, puis placez les quatre échantillons dans la grille porte-échantillons. Assurez un mélange adéquat du tampon de lyse et des tampons de lavage en les retournant trois à cinq fois, puis chargez-les dans les cuvettes correspondantes de la colonne quatre. Après avoir retourné quelques fois ou après une vortexation douce, chargez le tampon d'élution, les billes magnétiques et le tampon FFPE dans les petites cuvettes de la colonne cinq, en laissant deux emplacements vides là où indiqué.Chargez une plaque profonde de deux millilitres sur le support de plaque. Avant de démarrer un cycle, bouchonnez toutes les tubes et les réservoirs de réactifs. Vérifiez qu'une capacité suffisante est disponible dans la bouteille de déchets liquides et que la bouteille de déchets solides est vide et doublée d'un sac de déchets biologiques.Vérifiez que le plateau d'éjection de la pointe est centré dans l'ensemble de déchets. Fermez le couvercle avant, démarrez le logiciel, ouvrez le starlet ML principal de préparation d'acides nucléiques. Exécutez le fichier med.Cliquez sur démarrer. Le statut de l'instrument passera de veille à en cours d'exécution. Saisissez le nombre d'échantillons pour cette exécution.Choisissez la méthode souhaitée pour cet essai. Indiquez la position de la première pipette à grand volume, en sélectionnant une. Si tous les supports sont pleins, indiquez la position de la première pipette à volume standard, en sélectionnant une.Si tous les plateaux sont pleins, l'appareil exécute les étapes automatisées sans intervention de l'utilisateur. Un flux de travail détaillé est indiqué ici afin d'éviter toute contamination. Suivez les précautions standard, telles que le port de gants et l'utilisation d'une hotte PCR propre.Nettoyez les pipettes et les tubes à faible liaison aux protéines. Préparez les mélanges réactionnels dans des bandes de tubes PCR, décongelez-les et laissez-les équilibrer à température ambiante. L'échantillon d'ADN génomique humain destiné à l'analyse par PCR en gouttelettes numériques, ou D-D-P-C-R, doit présenter une concentration minimale de 3,3 nanogrammes par microlitre.Préparez les réactions de PCR. Mélangez le super mélange X-D-D-P-C-R 20 x, les amorces sens et antisens et la sonde avec chaque échantillon d'ADN purifié, puis complétez à 20 microlitres avec de l'eau distillée. Vortexez le mélange soigneusement pour assurer son homogénéité, puis effectuez une courte centrifugation afin de rassembler le contenu au fond des tubes avant de distribuer.Utiliser le générateur de gouttelettes conformément au protocole recommandé par le fabricant. Insérer la cartouche dans le support en plaçant l'encoche de la cartouche du côté supérieur gauche du support. Ajouter 20 microlitres de mélange réactionnel contenant les échantillons dans les puits centraux et 70 microlitres d'huile de génération dans les puits inférieurs.Fixez le joint sur le dessus de la cartouche. Veillez à ce que le joint soit solidement accroché aux deux extrémités du support. Sinon, la pression suffisante pour la génération de gouttelettes ne sera pas atteinte.Ouvrez le générateur de gouttelettes en appuyant sur le bouton vert situé en haut de l'appareil. Insérez la cartouche lorsque le support est en position correcte. Les témoins lumineux d'alimentation et de support sont tous deux verts.Appuyez à nouveau sur le bouton supérieur de l'appareil pour fermer la porte et initier la génération de gouttelettes. Le témoin lumineux de gouttelettes clignote en vert après 10 secondes, indiquant que la génération de gouttelettes est en cours. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, les trois témoins lumineux passent au vert fixe.Ouvrez la porte en appuyant sur le bouton et retirez le support de l'appareil. Retirez le joint jetable du support et jetez-le. Notez que les puits supérieurs de la cartouche contiennent les gouttelettes, tandis que les puits moyens et inférieurs sont presque vides, avec une petite quantité d'huile résiduelle après la génération des gouttelettes.Préparer l'amplification par PCR conventionnelle. Pour chaque échantillon, prélever 40 microlitres du contenu des gouttelettes à partir du puits supérieur des cartouches et les transférer dans un seul puits d'une plaque PCR 96 puits recommandée, comme indiqué dans le protocole de l'instrument du fabricant ; aspirer lentement et délicatement la gouttelette afin de minimiser la fragmentation pendant le transfert. Immédiatement après le transfert des gouttelettes, la plaque PCR doit être scellée pour éviter l'évaporation.Régler la température du scelleur de plaque à 180 degrés Celsius et le temps à cinq secondes. Appuyer sur la flèche pour ouvrir la porte du plateau. Placer le bloc de support sur le plateau avec le côté 96 puits orienté vers le haut.Placez la plaque 96 puits sur le bloc de support et assurez-vous que tous les puits de la plaque sont alignés avec le couvercle du bloc de support. Utilisez une feuille de scellement en aluminium pour la plaque 96 puits. Utilisez des scellés en aluminium compatibles avec un scelleur de plaque PCR et les aiguilles du lecteur de gouttes. Une fois la plaque 96 puits fixée sur le bloc de support et recouverte d'un scellé en aluminium durcissable.Appuyez sur le bouton de scellage. Le plateau se fermera et le chauffage du plafond débutera. Une fois le scellage thermique terminé, la porte s'ouvrira automatiquement.Retirez la plaque du bloc chauffant, puis retirez le bloc chauffant. Vérifiez que tous les puits de la plaque sont bien scellés en examinant les empreintes. Le feuillet de papier d’aluminium est clairement visible au-dessus de chaque puit.Une fois scellé, le plateau est prêt pour le cyclage thermique. Réalisez une amplification PCR classique en suivant les paramètres détaillés dans le texte du protocole. Une fois l'amplification PCR de la cible d'acide nucléique dans les gouttelettes terminée.L'étape suivante consiste à analyser chaque goutte individuellement à l'aide d'un système de détection à deux couleurs. Généralement, l'appareil de lecture de gouttes est configuré pour détecter les fluorophores rapporteurs FAM et VIC. Cliquez sur « flush system » pour amorcer le lecteur de gouttes et le préparer à l'analyse D-D-P-C-R.Chargez la plaque dans le lecteur de gouttelettes et cliquez sur démarrer. Une fois la lecture des gouttelettes terminée, ouvrez la porte et retirez le support de plaque de l'appareil. Retirez la plaque 96 puits du support et jetez-la.Effectuez ensuite le profilage des mutations de l'ADN à l'aide d'un logiciel d'analyse de données, tel que décrit dans le texte du protocole. Dans cette analyse D-D-P-C-R, les mutations RAF V 600 E ont été étudiées. La fluorescence a été détectée et transformée en une représentation graphique sous forme de nuage de points bidimensionnel.Un logiciel personnalisé a été utilisé pour tracer les fenêtres appropriées et compter le nombre de gouttelettes dans chaque fenêtre. Les gouttelettes représentées par des points bleus au-dessus de la ligne seuil rose pour tous les échantillons sont positives. Pour les gouttelettes de type sauvage RAF V 600 E muté, elles sont représentées par des points verts sur les deux graphiques.Les points gris situés en bas sont considérés comme le fond de fluorescence. Les fréquences alléliques mutées globales ont ensuite été calculées en fonction des pourcentages relatifs des concentrations de matrices de type sauvage bra et brav V 600 E détectées. Une session. L’analyse HR avec l’analyse individuelle peut être réalisée dans les quatre heures suivant cette posture.D'autres échantillons, comme une biopsie liquide PPT, peuvent être analysés afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le suivi de la progression du cancer après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des diagnostics accompagnants pour explorer diverses détections de mutations dans le domaine de l'oncologie moléculaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le système de préparation des tissus et la PCR numérique en gouttelettes pour la détection spécifique d'une mutation ponctuelle de l'ADN.

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Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol (Vidéo) | JoVE Journal

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

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