Name: Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique laide dun Gaussia Luciférase SERCaMP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez comment surveiller l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à l'aide de la protéine rapporteuse SERCaMP Gaussia luciférase. Cette méthode permet un suivi in vivo peu invasif dans le foie.

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Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Institute on Drug Abuse. Nous remercions Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno et Josh Hinkle pour leurs contributions au développement de cette méthode.

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<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole met en évidence in vitro et in vivo de l&#39;utilité de Gluc-SERCaMP pour contrôler l&#39;épuisement de calcium ER. Bien que la modification de la protéine pour générer SERCaMP semble généraliser à d&#39;autres 12 protéines rapporteurs, nous avons choisi pour la luciférase de Gaussia son robuste (200-1,000 fois supérieure) bioluminescence par rapport aux autres luciférases 18. Nous démontrons détectable induite thapsigargine GLUC-SERCaMP libération à travers ...

Le réticulum endoplasmique (RE) des fonctions dans de nombreuses capacités cellulaires, y compris le repliement des protéines, la sécrétion de protéines, l&#39;homéostasie lipidique et de signalisation intracellulaire 1. Central à la fonction ER normale est de maintenir les concentrations de calcium luminal à ~ 5000 fois ceux trouvés dans le cytoplasme 2-4. Ce processus intensif d&#39;énergie est réglementée par la ATPase Sarco / réticulum endoplasmique de calcium (SERCA), une pompe qui déplace des ions calcium dans le RE. Efflux de calcium du RE est principalement médiée par la ryanodine (RyR) et l&#39;inositol triphosphate (IP3R) récepteurs. Parce que de nombreux processus de ER sont dépendantes du calcium, perturbant le magasin peut conduire à des stress du RE et la mort cellulaire éventuelle. ER dysrégulation de calcium a été observée dans les maladies y compris la cardiomyopathie, le diabète, la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson et 5. En raison de la nature progressive de ces maladies, il a été difficile de délimiter la nouvelle cause à effetlation entre la pathogenèse et les modifications dans le magasin ER de calcium. Un certain nombre de technologies ont permis des avancées significatives dans notre compréhension de la dynamique ER de calcium, y compris les colorants et les indicateurs de calcium génétiquement codés (GeCIS). Des colorants à faible affinité de calcium, ce qui augmente la fluorescence lorsqu&#39;il est lié à Ca2 +, peuvent être chargées dans les cellules à examiner compartiments subcellulaires avec des concentrations élevées de calcium 6. GeCIS, comme D1ER et le receveur permettre un suivi des fluctuations de calcium avec un contrôle plus précis de la localisation subcellulaire 7-9. Récemment, une autre classe de GECIS appelés indicateurs de protéines organelles piégée calcium de mesure (CEPIA) ont été décrits 10. Une troisième approche combinant la génétique et la chimie des petites molécules ciblé est-estérase charge de colorant (TED), qui utilise une carboxylestérase codé génétiquement (ciblé pour l&#39;ER) avec un colorant à base d&#39;ester de calcium-11. Bien que la aforementioned approches ont des forces et des faiblesses inhérentes, ils peuvent fournir des informations précieuses sur la dynamique de calcium ER par des mesures aigus de fluorescence. Ils sont, cependant, pas optimal pour les études longitudinales souvent nécessaires pour enquêter sur la progression de la maladie. Dans le but de mettre au point une méthode pour surveiller la dynamique de calcium sur des périodes de temps prolongées, nous avons identifié et développé une modification des protéines pour créer les protéines sécrétées de calcium ER surveillance (SERCaMPs) 12. SERCaMP contourne plusieurs limitations associées avec d&#39;autres méthodes, en fournissant une approche minimalement invasive pour interroger plusieurs reprises la boutique ER de calcium. Nous avons précédemment démontré que le peptide ASARTDL carboxy-terminale (alanine-sérine-arginine-alanine-thréonine-leucine-acide aspartique) est suffisante pour favoriser la rétention au ER; cependant, dans des conditions qui causent des diminutions de calcium ER, la séquence peptidique est plus en mesure de maintenir ER localization et la protéine est sécrétée 13. La base de la technologie de SERCaMP est l&#39;appendice de ASARTDL à l&#39;extrémité carboxy-terminale d&#39;une protéine sécrétée (par exemple, la luciférase de Gaussia, ou Gluc) de telle sorte que la sécrétion est déclenchée par épuisement ER de calcium, créant ainsi un journaliste robuste de ER dysrégulation de calcium 12. L&#39;expression de Gluc-SERCaMP par des méthodes transgéniques permet fluides biologiques, notamment milieu de culture de cellules et le plasma à analyser les changements dans l&#39;activité Gluc comme indicateur de l&#39;homéostasie de calcium ER. La méthode a des applications pour l&#39;étude longitudinale des modifications progressives dans le magasin de calcium ER la fois in vitro et in vivo. Le protocole suivant est écrit comme un cadre général pour l&#39;aide basée SERCaMP-GLUC pour étudier ER homéostasie du calcium, mais le protocole peut servir de guide pour SERCaMPs rapporteurs alternatives.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Solution NP-40 à 10 %&nbsp ;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>pour dosages GLuc intracellulaires</td></tr><tr><td>Seringues luer-lok</td><td>1 ml Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>Embouts filtrants 200 microlitres</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 sutures chirurgicales</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles 30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques d’étanchéité adhésives pour microplaques</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Système d’anesthésie automatique</td><td>E-Z Anesthésie</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de récupération animale</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bétadine</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de croissance bovine</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelentrazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs à embout en coton</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles coupantes Sutures circulaires 3/8</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur ultrasconique numérique</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Échelle de masse d’ADN</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (protéine recombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Gaussia luciferase (pour WB, ICC ou IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2 000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de dosage de gluc (96 puits, opaques)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Poudre styptique</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrifugeuse</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel et nettoyage PCR</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X kit de titrage rapide</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Scellé de film PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Charcoal Filter canister</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD rats 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Rats</td><td>rats commandés à 150-200 g.&nbsp ; Chirurgie 5 jours après l’arrivée</td></tr><tr><td>Étiquettes d’oreille pour petits animaux</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Champs chirurgicaux stériles</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>nocif pour santé humaine</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral packaging mix</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Réactif de transfection</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; gaussia</em&gt; luciférase sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Le réticulum endoplasmique (RE) contient le plus haut niveau de calcium intracellulaire, avec des concentrations d&#39;environ 5000 fois plus élevée que les niveaux cytoplasmiques. Un contrôle serré sur ER calcium est impératif pour le repliement des protéines, la modification et la traite. Les perturbations à ER calcium peuvent conduire à l&#39;activation de la réponse de la protéine dépliée, un mécanisme de réponse au stress du RE à trois broches, et contribuer à la pathogenèse d&#39;une variété de maladies. La capacité de surveiller les modifications de calcium ER apparition et la progression au cours de la maladie est important en principe, mais difficile en pratique. Méthodes actuellement disponibles pour ER de surveillance de calcium, tels que les colorants et les protéines fluorescentes calcium-dépendante, ont permis de mieux comprendre la dynamique ER de calcium dans les cellules, mais ces outils ne sont pas bien adaptés pour des études in vivo. Notre laboratoire a démontré qu&#39;une modification de l&#39;extrémité carboxy-terminale de la luciférase de Gaussia confère sécrétion du rapporteur en réponse àER appauvrissement de calcium. Les procédés d&#39;utilisation d&#39;une luciférase en fonction, la protéine de surveillance de calcium du RE sécrétée (SERCaMP) pour in vitro et in vivo dans des applications sont décrits ici. Cette vidéo met injections hépatiques, la manipulation pharmacologique de GLUC-SERCaMP, la collecte et le traitement du sang, et les paramètres de dosage pour le suivi longitudinal de ER calcium.

La méthode GLUC-SERCaMP permet pour l&#39;évaluation des ER homéostasie calcique en échantillonnant les liquides extracellulaires. Plusieurs contrôles peuvent être inclus dans la conception expérimentale pour améliorer l&#39;interprétation des résultats. Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation d&#39;un journaliste constitutivement sécrétée (par exemple GLUC sans ASARTDL C-terminale ou &quot;GLUC-Pas Tag&quot;) peut être utilisé pour évaluer les effets des traitements expérimentaux sur la voie de sécrétion (de sécré...

L’homéostasie calcique du réticulum endoplasmique est perturbée dans diverses pathologies. Un rapporteur de protéine de surveillance calcique du RE (SERCaMP) peut être utilisé pour détecter les perturbations dans le stockage du calcium du RE. Ce protocole décrit l’utilisation d’une SERCaMP de la gaussia luciférase pour examiner l’homéostasie calcique du RE in vitro et in vivo.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller dans le temps les troubles de la régulation calcique du réticulum endoplasmique à l'aide d'une protéine rapporteuse sécrétée. Cela est réalisé par transgénèse médiée par vecteur viral du tissu cible, spécifiquement le foie. Dans cet exemple utilisant le rapporteur Gai luciférase circa, un liquide biologique comme le sang est prélevé afin de mesurer la quantité de circa libérée par le tissu ; le substrat de la luciférase est ensuite ajouté aux échantillons de plasma et la luminescence est mesurée pour déterminer la déplétion en calcium du réticulum endoplasmique.Les résultats montrent une dysrégulation du calcium du réticulum endoplasmique, indiquée par une augmentation des concentrations de C-AMP plasmatique. L'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être surveillée pendant de longues durées par des prélèvements répétés de petits volumes de fluides biologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les colorants calciques de faible affinité ou les capteurs génétiquement codés du calcium, est que l'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

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Biology

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Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l'homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d'aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

Imagerie calcique spontanée pour la dynamique spécifique des compartiments dans les astrocytes

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité...

Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et ​​C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.

Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Ce protocole décrit une méthode simple pour analyser les signaux calciques chez les plantes générées en se nourrissant d’insectes hémiptères, comme les pucerons. Arabidopsis thaliana transformée avec le biocapteur de calcium GFP GCaMP3 permettant l’imagerie en temps réel en vivo de dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Enregistrement en temps réel In Vivo des signaux calciques Arabidopsis pendant la tétée insectes à l’aide d’un biocapteur Fluorescent

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

Découvrez comment surveiller l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à l'aide de la protéine rapporteuse SERCaMP Gaussia luciférase. Cette méthode permet un suivi in vivo peu invasif dans le foie.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l'aide d'un

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