Name: Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique laide dun Gaussia Luciférase SERCaMP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez comment surveiller l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à l'aide de la protéine rapporteuse SERCaMP Gaussia luciférase. Cette méthode permet un suivi in vivo peu invasif dans le foie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Institute on Drug Abuse. Nous remercions Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno et Josh Hinkle pour leurs contributions au développement de cette méthode.

<ol><li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li>
<li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li>
<li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li>
<li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2%2B+dynamics+in+high+Ca2%2B+concentration+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li>
<li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intraorganellar+Ca2%2B+at+subcellular+resolution+using+CEPIA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153(2014).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li>
<li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCaMP%3A+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li>
<li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+%28MANF%29+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li>
<li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+4-%282-hydroxyethyl%29-1-piperazine%C3%ABthanesulfonic+acid+%28HEPES%29+as+a+tissue+culture+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li>
<li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li>
<li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+7%2C+8%2C+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li>
<li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li>
<li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li>
<li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+in+gene+therapy%3A+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole met en évidence in vitro et in vivo de l&#39;utilité de Gluc-SERCaMP pour contrôler l&#39;épuisement de calcium ER. Bien que la modification de la protéine pour générer SERCaMP semble généraliser à d&#39;autres 12 protéines rapporteurs, nous avons choisi pour la luciférase de Gaussia son robuste (200-1,000 fois supérieure) bioluminescence par rapport aux autres luciférases 18. Nous démontrons détectable induite thapsigargine GLUC-SERCaMP libération à travers ...

Le réticulum endoplasmique (RE) des fonctions dans de nombreuses capacités cellulaires, y compris le repliement des protéines, la sécrétion de protéines, l&#39;homéostasie lipidique et de signalisation intracellulaire 1. Central à la fonction ER normale est de maintenir les concentrations de calcium luminal à ~ 5000 fois ceux trouvés dans le cytoplasme 2-4. Ce processus intensif d&#39;énergie est réglementée par la ATPase Sarco / réticulum endoplasmique de calcium (SERCA), une pompe qui déplace des ions calcium dans le RE. Efflux de calcium du RE est principalement médiée par la ryanodine (RyR) et l&#39;inositol triphosphate (IP3R) récepteurs. Parce que de nombreux processus de ER sont dépendantes du calcium, perturbant le magasin peut conduire à des stress du RE et la mort cellulaire éventuelle. ER dysrégulation de calcium a été observée dans les maladies y compris la cardiomyopathie, le diabète, la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson et 5. En raison de la nature progressive de ces maladies, il a été difficile de délimiter la nouvelle cause à effetlation entre la pathogenèse et les modifications dans le magasin ER de calcium. Un certain nombre de technologies ont permis des avancées significatives dans notre compréhension de la dynamique ER de calcium, y compris les colorants et les indicateurs de calcium génétiquement codés (GeCIS). Des colorants à faible affinité de calcium, ce qui augmente la fluorescence lorsqu&#39;il est lié à Ca2 +, peuvent être chargées dans les cellules à examiner compartiments subcellulaires avec des concentrations élevées de calcium 6. GeCIS, comme D1ER et le receveur permettre un suivi des fluctuations de calcium avec un contrôle plus précis de la localisation subcellulaire 7-9. Récemment, une autre classe de GECIS appelés indicateurs de protéines organelles piégée calcium de mesure (CEPIA) ont été décrits 10. Une troisième approche combinant la génétique et la chimie des petites molécules ciblé est-estérase charge de colorant (TED), qui utilise une carboxylestérase codé génétiquement (ciblé pour l&#39;ER) avec un colorant à base d&#39;ester de calcium-11. Bien que la aforementioned approches ont des forces et des faiblesses inhérentes, ils peuvent fournir des informations précieuses sur la dynamique de calcium ER par des mesures aigus de fluorescence. Ils sont, cependant, pas optimal pour les études longitudinales souvent nécessaires pour enquêter sur la progression de la maladie. Dans le but de mettre au point une méthode pour surveiller la dynamique de calcium sur des périodes de temps prolongées, nous avons identifié et développé une modification des protéines pour créer les protéines sécrétées de calcium ER surveillance (SERCaMPs) 12. SERCaMP contourne plusieurs limitations associées avec d&#39;autres méthodes, en fournissant une approche minimalement invasive pour interroger plusieurs reprises la boutique ER de calcium. Nous avons précédemment démontré que le peptide ASARTDL carboxy-terminale (alanine-sérine-arginine-alanine-thréonine-leucine-acide aspartique) est suffisante pour favoriser la rétention au ER; cependant, dans des conditions qui causent des diminutions de calcium ER, la séquence peptidique est plus en mesure de maintenir ER localization et la protéine est sécrétée 13. La base de la technologie de SERCaMP est l&#39;appendice de ASARTDL à l&#39;extrémité carboxy-terminale d&#39;une protéine sécrétée (par exemple, la luciférase de Gaussia, ou Gluc) de telle sorte que la sécrétion est déclenchée par épuisement ER de calcium, créant ainsi un journaliste robuste de ER dysrégulation de calcium 12. L&#39;expression de Gluc-SERCaMP par des méthodes transgéniques permet fluides biologiques, notamment milieu de culture de cellules et le plasma à analyser les changements dans l&#39;activité Gluc comme indicateur de l&#39;homéostasie de calcium ER. La méthode a des applications pour l&#39;étude longitudinale des modifications progressives dans le magasin de calcium ER la fois in vitro et in vivo. Le protocole suivant est écrit comme un cadre général pour l&#39;aide basée SERCaMP-GLUC pour étudier ER homéostasie du calcium, mais le protocole peut servir de guide pour SERCaMPs rapporteurs alternatives.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Solution NP-40 à 10 %&nbsp ;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>pour dosages GLuc intracellulaires</td></tr><tr><td>Seringues luer-lok</td><td>1 ml Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>Embouts filtrants 200 microlitres</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 sutures chirurgicales</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>aiguilles 30 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques d’étanchéité adhésives pour microplaques</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Système d’anesthésie automatique</td><td>E-Z Anesthésie</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de récupération animale</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bétadine</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de croissance bovine</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelentrazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs à embout en coton</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles coupantes Sutures circulaires 3/8</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur ultrasconique numérique</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM à haute teneur en glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Échelle de masse d’ADN</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (protéine recombinante)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Gaussia luciferase (pour WB, ICC ou IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2 000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de dosage de gluc (96 puits, opaques)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Poudre styptique</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrifugeuse</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel et nettoyage PCR</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X kit de titrage rapide</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Scellé de film PCR</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Charcoal Filter canister</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD rats 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Rats</td><td>rats commandés à 150-200 g.&nbsp ; Chirurgie 5 jours après l’arrivée</td></tr><tr><td>Étiquettes d’oreille pour petits animaux</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Champs chirurgicaux stériles</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 lecteur de plaques</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>nocif pour santé humaine</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral packaging mix</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Réactif de transfection</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; gaussia</em&gt; luciférase sercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Le réticulum endoplasmique (RE) contient le plus haut niveau de calcium intracellulaire, avec des concentrations d&#39;environ 5000 fois plus élevée que les niveaux cytoplasmiques. Un contrôle serré sur ER calcium est impératif pour le repliement des protéines, la modification et la traite. Les perturbations à ER calcium peuvent conduire à l&#39;activation de la réponse de la protéine dépliée, un mécanisme de réponse au stress du RE à trois broches, et contribuer à la pathogenèse d&#39;une variété de maladies. La capacité de surveiller les modifications de calcium ER apparition et la progression au cours de la maladie est important en principe, mais difficile en pratique. Méthodes actuellement disponibles pour ER de surveillance de calcium, tels que les colorants et les protéines fluorescentes calcium-dépendante, ont permis de mieux comprendre la dynamique ER de calcium dans les cellules, mais ces outils ne sont pas bien adaptés pour des études in vivo. Notre laboratoire a démontré qu&#39;une modification de l&#39;extrémité carboxy-terminale de la luciférase de Gaussia confère sécrétion du rapporteur en réponse àER appauvrissement de calcium. Les procédés d&#39;utilisation d&#39;une luciférase en fonction, la protéine de surveillance de calcium du RE sécrétée (SERCaMP) pour in vitro et in vivo dans des applications sont décrits ici. Cette vidéo met injections hépatiques, la manipulation pharmacologique de GLUC-SERCaMP, la collecte et le traitement du sang, et les paramètres de dosage pour le suivi longitudinal de ER calcium.

La méthode GLUC-SERCaMP permet pour l&#39;évaluation des ER homéostasie calcique en échantillonnant les liquides extracellulaires. Plusieurs contrôles peuvent être inclus dans la conception expérimentale pour améliorer l&#39;interprétation des résultats. Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation d&#39;un journaliste constitutivement sécrétée (par exemple GLUC sans ASARTDL C-terminale ou &quot;GLUC-Pas Tag&quot;) peut être utilisé pour évaluer les effets des traitements expérimentaux sur la voie de sécrétion (de sécré...

L’homéostasie calcique du réticulum endoplasmique est perturbée dans diverses pathologies. Un rapporteur de protéine de surveillance calcique du RE (SERCaMP) peut être utilisé pour détecter les perturbations dans le stockage du calcium du RE. Ce protocole décrit l’utilisation d’une SERCaMP de la gaussia luciférase pour examiner l’homéostasie calcique du RE in vitro et in vivo.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller dans le temps les troubles de la régulation calcique du réticulum endoplasmique à l'aide d'une protéine rapporteuse sécrétée. Cela est réalisé par transgénèse médiée par vecteur viral du tissu cible, spécifiquement le foie. Dans cet exemple utilisant le rapporteur Gai luciférase circa, un liquide biologique comme le sang est prélevé afin de mesurer la quantité de circa libérée par le tissu ; le substrat de la luciférase est ensuite ajouté aux échantillons de plasma et la luminescence est mesurée pour déterminer la déplétion en calcium du réticulum endoplasmique.Les résultats montrent une dysrégulation du calcium du réticulum endoplasmique, indiquée par une augmentation des concentrations de C-AMP plasmatique. L'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être surveillée pendant de longues durées par des prélèvements répétés de petits volumes de fluides biologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les colorants calciques de faible affinité ou les capteurs génétiquement codés du calcium, est que l'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être suivie in vivo dans le temps grâce à une procédure minimement invasive. Cette technique ouvre deux voies thérapeutiques.La première consiste à rechercher des médicaments capables de maintenir ou de rétablir l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à son état physiologique normal. La deuxième approche consiste à modifier une protéine thérapeutique pour la transformer en AMP thérapeutique, dont la sécrétion se produit en réponse à une diminution du calcium dans le réticulum endoplasmique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la dysrégulation calcique du réticulum endoplasmique dans le foie.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes organiques tels que le cerveau, le cœur, le muscle ou le pancréas. Après anesthésie d'un rat sprague dawley, conformément au protocole décrit, appliquer un onguent ophtalmique et effectuer une pression sur la queue afin de vérifier l'anesthésie, raser la région de l'abdomen légèrement en dessous des côtes jusqu'à la région abdominale médiane, puis nettoyer la zone chirurgicale trois fois en alternant le Bétadine et l'éthanol à 70 %. Ensuite, placer le rat en position supine sur une surface chirurgicale stérile, couvrir avec des champs opératoires stériles, et diluer un échantillon de gluc à la concentration optimisée par l'utilisateur.Dans ce cas, nous avons utilisé 7,6 fois 10 à la puissance 9 génomes viraux par millilitre et avons mélangé en retournant le tube. Ensuite, pipeter 105 microlitres de l'AAV dilué dans une boîte stérile et utiliser une aiguille de calibre 30 pour recueillir le virus dans une seringue. Marquer le site d'incision cible afin d'exposer le foie pour l'injection à l'aide d'un scalpel.Effectuez une incision horizontale d’environ deux à trois centimètres de longueur sous la cage thoracique. Réalisez une dissection émoussée pour séparer le tissu conjonctif de l’hypoderme. Coupez le muscle abdominal afin d’exposer le lobe médian droit du foie.Ensuite, placez l'animal sous un microscope chirurgical et effectuez le réglage pour visualiser le bon lobe médian du foie. Puis, à l’aide de la seringue, injectez un tiers du volume total de virus en trois sites distincts dans le parenchyme du lobe médian droit, en maintenant l’aiguille dans le tissu pendant cinq à dix secondes après chaque injection afin de garantir l’administration complète du volume injecté. Suturez le muscle abdominal et l’incision, puis appliquez du Neosporin à l’aide d’un applicateur en coton. Placez le rat dans une chambre de récupération jusqu’à ce qu’il reprenne connaissance et soit capable de maintenir une position debout avant de le replacer dans sa cage individuelle.Quatre à sept jours après l'injection. Préparez les tubes de prélèvement sanguin en les étiquetant et en les pesant préalablement. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 1000 unités par millilitre d'héparine à chaque tube.Après avoir anesthésié le rat conformément au protocole décrit dans le texte, effectuez une pression sur la queue pour vérifier la sédation et, à l'aide de ciseaux stériles, coupez l'extrémité de la queue à environ un à deux millimètres de l'extrémité. Recueillez plus de 100 microlitres de sang goutte à goutte dans un tube préalablement rempli d'héparine afin d'arrêter l'hémorragie.Utilisez un applicateur en coton humide pour appliquer la poudre STIC sur la queue. Utilisez un tampon imbibé d’éthanol pour nettoyer les ciseaux et effectuez une stérilisation par billes entre chaque prélèvement. Conservez les tubes de sang à quatre degrés Celsius.Si vous prélevez des échantillons ultérieurs, pesez les tubes de collecte et ajustez l'héparine afin d'obtenir un rapport de deux pour un entre le sang et l'héparine. Cette étape permettra de normaliser la quantité d'héparine dans chaque échantillon. Faites centrifuger les tubes à 2000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Transférez le surnageant plasmatique dans un tube neuf et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 72 heures ou à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme, en vue du dosage de la luciférase afin d'administrer thaa garin comme témoin positif. Diluez dans l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre. Ensuite, injectez à une dose de un milligramme par kilogramme par voie intrapéritonéale dans le bas de l'abdomen.Prélevez l'échantillon de sang initial 24 heures après l'injection, comme décrit ci-dessus. Pour mesurer la luminescence. Préparez le substrat travail de sélénazine selon le protocole indiqué dans le texte et incubez à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 30 minutes.Entre-temps, décongeler tous les échantillons sur de la glace et transférer 10 microlitres de plasma dans une plaque à parois opaques à l’aide d’un lecteur de plaques capable de mesurer la bioluminescence et équipé d’un injecteur de substrat. Amorcer les lignes avec le substrat. Injecter 100 microlitres de substrat dans un puits.Agiter à vitesse moyenne pendant cinq secondes et mesurer l'émission lumineuse pour les échantillons in vitro. Intégrer l'émission lumineuse sur 0,5 seconde pour l'étape de lecture et, pour les échantillons in vivo, intégrer sur cinq secondes lors de l'étape de lecture afin d'évaluer l'homéostasie calcique. À l'aide de la méthode Gluc SAR Camp, plusieurs contrôles peuvent être inclus, tels qu'un rapporteur sécrété de manière constitutive comme Gluc Noag dans ce cas.Une augmentation des niveaux extracellulaires de GLUC SAR camp et de Gluc noag en réponse à des conditions expérimentales serait considérée comme un résultat ambigu. Toutefois, une augmentation de la sécrétion de gluc SAR camp sans réponse de gluc noag soutient un événement dépendant du calcium du RE. Des modulateurs pharmacologiques des réserves de calcium du RE peuvent être utilisés afin de confirmer la contribution du calcium du RE à la libération de SAR camp dans de nouveaux paradigmes.Par exemple, comme le montre cette étude, la dantrolène, un antagoniste du récepteur INE qui stabilise le calcium du réticulum endoplasmique, inhibe la libération de l'AMPc SAR en réponse à l'argon thiocyanique. Pour les études in vitro utilisant l'AMPc SAR basé sur le glucose, la réponse induite par le traitement doit être évaluée de manière optimale au cours du temps. En suivant les variations de la réponse relative au sein d'une même plaque par rapport aux témoins, il n'est pas recommandé de comparer les valeurs brutes entre plusieurs plaques, car la dégradation du substrat peut entraîner des modifications des valeurs brutes. Pour les études in vivo, les données doivent être évaluées indépendamment pour chaque animal, chaque animal servant comme son propre témoin pré-traitement.Cela est nécessaire pour tenir compte de la variabilité de la livraison et de l'expression du transgène entre les animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser une technologie sircam pour étudier la régulation calcique du réticulum endoplasmique dans des modèles rongeurs de maladie hépatique. N'oubliez pas que le travail avec des vecteurs viraux peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adéquats doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l'homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d'aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

Imagerie calcique spontanée pour la dynamique spécifique des compartiments dans les astrocytes

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité...

Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et ​​C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.

Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Ce protocole décrit une méthode simple pour analyser les signaux calciques chez les plantes générées en se nourrissant d’insectes hémiptères, comme les pucerons. Arabidopsis thaliana transformée avec le biocapteur de calcium GFP GCaMP3 permettant l’imagerie en temps réel en vivo de dynamique du calcium avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Enregistrement en temps réel In Vivo des signaux calciques Arabidopsis pendant la tétée insectes à l’aide d’un biocapteur Fluorescent

Nous présentons ici un protocole pour Ca2 + l’imagerie dans les neurones et les cellules gliales, qui permet la dissection de Ca2 + signaux à résolution subcellulaire. Ce processus s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression des indicateurs génétiquement codés de Ca2 + .

Dissection des signaux locaux Ca2 + dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca2 + indicateurs

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

Nous avons mis au point un test de réassemblage de la luciférase fractionnée pour surveiller les contacts réticulum-mitochondrie endoplasmique dans les cellules vivantes. À l’aide de ce test, nous décrivons un protocole permettant de mesurer quantitativement le niveau de ces couplages inter-organites dans HEK293T cellules, dans des conditions de traitement chimique.

Essai de réassemblage de la luciférase fractionnée pour mesurer les contacts du réticulum endoplasmique et des mitochondries dans des cellules vivantes

Découvrez comment surveiller l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à l'aide de la protéine rapporteuse SERCaMP Gaussia luciférase. Cette méthode permet un suivi in vivo peu invasif dans le foie.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l'aide d'un

Explorer plus de vidéos