Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l'aide d'un

L'objectif général de l'expérience suivante est de surveiller dans le temps les troubles de la régulation calcique du réticulum endoplasmique à l'aide d'une protéine rapporteuse sécrétée. Cela est réalisé par transgénèse médiée par vecteur viral du tissu cible, spécifiquement le foie. Dans cet exemple utilisant le rapporteur Gai luciférase circa, un liquide biologique comme le sang est prélevé afin de mesurer la quantité de circa libérée par le tissu ; le substrat de la luciférase est ensuite ajouté aux échantillons de plasma et la luminescence est mesurée pour déterminer la déplétion en calcium du réticulum endoplasmique.

Les résultats montrent une dysrégulation du calcium du réticulum endoplasmique, indiquée par une augmentation des concentrations de C-AMP plasmatique. L'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être surveillée pendant de longues durées par des prélèvements répétés de petits volumes de fluides biologiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les colorants calciques de faible affinité ou les capteurs génétiquement codés du calcium, est que l'homéostasie du calcium du réticulum endoplasmique peut être suivie in vivo dans le temps grâce à une procédure minimement invasive. Cette technique ouvre deux voies thérapeutiques.

La première consiste à rechercher des médicaments capables de maintenir ou de rétablir l'homéostasie calcique du réticulum endoplasmique à son état physiologique normal. La deuxième approche consiste à modifier une protéine thérapeutique pour la transformer en AMP thérapeutique, dont la sécrétion se produit en réponse à une diminution du calcium dans le réticulum endoplasmique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la dysrégulation calcique du réticulum endoplasmique dans le foie.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes organiques tels que le cerveau, le cœur, le muscle ou le pancréas. Après anesthésie d'un rat sprague dawley, conformément au protocole décrit, appliquer un onguent ophtalmique et effectuer une pression sur la queue afin de vérifier l'anesthésie, raser la région de l'abdomen légèrement en dessous des côtes jusqu'à la région abdominale médiane, puis nettoyer la zone chirurgicale trois fois en alternant le Bétadine et l'éthanol à 70 %. Ensuite, placer le rat en position supine sur une surface chirurgicale stérile, couvrir avec des champs opératoires stériles, et diluer un échantillon de gluc à la concentration optimisée par l'utilisateur.

Dans ce cas, nous avons utilisé 7,6 fois 10 à la puissance 9 génomes viraux par millilitre et avons mélangé en retournant le tube. Ensuite, pipeter 105 microlitres de l'AAV dilué dans une boîte stérile et utiliser une aiguille de calibre 30 pour recueillir le virus dans une seringue. Marquer le site d'incision cible afin d'exposer le foie pour l'injection à l'aide d'un scalpel.

Effectuez une incision horizontale d’environ deux à trois centimètres de longueur sous la cage thoracique. Réalisez une dissection émoussée pour séparer le tissu conjonctif de l’hypoderme. Coupez le muscle abdominal afin d’exposer le lobe médian droit du foie.

Ensuite, placez l'animal sous un microscope chirurgical et effectuez le réglage pour visualiser le bon lobe médian du foie. Puis, à l’aide de la seringue, injectez un tiers du volume total de virus en trois sites distincts dans le parenchyme du lobe médian droit, en maintenant l’aiguille dans le tissu pendant cinq à dix secondes après chaque injection afin de garantir l’administration complète du volume injecté. Suturez le muscle abdominal et l’incision, puis appliquez du Neosporin à l’aide d’un applicateur en coton. Placez le rat dans une chambre de récupération jusqu’à ce qu’il reprenne connaissance et soit capable de maintenir une position debout avant de le replacer dans sa cage individuelle.

Quatre à sept jours après l'injection. Préparez les tubes de prélèvement sanguin en les étiquetant et en les pesant préalablement. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 1000 unités par millilitre d'héparine à chaque tube.

Après avoir anesthésié le rat conformément au protocole décrit dans le texte, effectuez une pression sur la queue pour vérifier la sédation et, à l'aide de ciseaux stériles, coupez l'extrémité de la queue à environ un à deux millimètres de l'extrémité. Recueillez plus de 100 microlitres de sang goutte à goutte dans un tube préalablement rempli d'héparine afin d'arrêter l'hémorragie.

Utilisez un applicateur en coton humide pour appliquer la poudre STIC sur la queue. Utilisez un tampon imbibé d’éthanol pour nettoyer les ciseaux et effectuez une stérilisation par billes entre chaque prélèvement. Conservez les tubes de sang à quatre degrés Celsius.

Si vous prélevez des échantillons ultérieurs, pesez les tubes de collecte et ajustez l'héparine afin d'obtenir un rapport de deux pour un entre le sang et l'héparine. Cette étape permettra de normaliser la quantité d'héparine dans chaque échantillon. Faites centrifuger les tubes à 2000 ×g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez le surnageant plasmatique dans un tube neuf et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant un maximum de 72 heures ou à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme, en vue du dosage de la luciférase afin d'administrer thaa garin comme témoin positif. Diluez dans l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre. Ensuite, injectez à une dose de un milligramme par kilogramme par voie intrapéritonéale dans le bas de l'abdomen.

Prélevez l'échantillon de sang initial 24 heures après l'injection, comme décrit ci-dessus. Pour mesurer la luminescence. Préparez le substrat travail de sélénazine selon le protocole indiqué dans le texte et incubez à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 30 minutes.

Entre-temps, décongeler tous les échantillons sur de la glace et transférer 10 microlitres de plasma dans une plaque à parois opaques à l’aide d’un lecteur de plaques capable de mesurer la bioluminescence et équipé d’un injecteur de substrat. Amorcer les lignes avec le substrat. Injecter 100 microlitres de substrat dans un puits.

Agiter à vitesse moyenne pendant cinq secondes et mesurer l'émission lumineuse pour les échantillons in vitro. Intégrer l'émission lumineuse sur 0,5 seconde pour l'étape de lecture et, pour les échantillons in vivo, intégrer sur cinq secondes lors de l'étape de lecture afin d'évaluer l'homéostasie calcique. À l'aide de la méthode Gluc SAR Camp, plusieurs contrôles peuvent être inclus, tels qu'un rapporteur sécrété de manière constitutive comme Gluc Noag dans ce cas.

Une augmentation des niveaux extracellulaires de GLUC SAR camp et de Gluc noag en réponse à des conditions expérimentales serait considérée comme un résultat ambigu. Toutefois, une augmentation de la sécrétion de gluc SAR camp sans réponse de gluc noag soutient un événement dépendant du calcium du RE. Des modulateurs pharmacologiques des réserves de calcium du RE peuvent être utilisés afin de confirmer la contribution du calcium du RE à la libération de SAR camp dans de nouveaux paradigmes.

Par exemple, comme le montre cette étude, la dantrolène, un antagoniste du récepteur INE qui stabilise le calcium du réticulum endoplasmique, inhibe la libération de l'AMPc SAR en réponse à l'argon thiocyanique. Pour les études in vitro utilisant l'AMPc SAR basé sur le glucose, la réponse induite par le traitement doit être évaluée de manière optimale au cours du temps. En suivant les variations de la réponse relative au sein d'une même plaque par rapport aux témoins, il n'est pas recommandé de comparer les valeurs brutes entre plusieurs plaques, car la dégradation du substrat peut entraîner des modifications des valeurs brutes. Pour les études in vivo, les données doivent être évaluées indépendamment pour chaque animal, chaque animal servant comme son propre témoin pré-traitement.

Cela est nécessaire pour tenir compte de la variabilité de la livraison et de l'expression du transgène entre les animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser une technologie sircam pour étudier la régulation calcique du réticulum endoplasmique dans des modèles rongeurs de maladie hépatique. N'oubliez pas que le travail avec des vecteurs viraux peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle adéquats doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.