Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

L'objectif général de cette procédure est de disséquer expérimentalement, de manipuler et de mettre en culture des greffons rétiniens entiers provenant d'embryons de poulet. Cette opération s'effectue tout d'abord en prélevant les deux yeux d'un embryon de poulet et en les plaçant dans une boîte de Pétri. La deuxième étape consiste à retirer la loge sclérale et l'épithélium pigmentaire à l'aide de fines pinces.

Ensuite, l’explant entier de rétine est soumis à une électroporation par ADN plasmidique à l’aide d’électrodes plates circulaires. La dernière étape consiste à incuber l’explant de rétine dans un milieu de culture, dans une plaque de 24 puits placée dans un incubateur.

En fin de compte, les implants rétiniens entiers sont fixés, cryosectionnés et analysés par microscopie en immunofluorescence afin de visualiser les neurones rétiniens. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les opérations électriques in OVO, est qu'elle est rapide, facile à réaliser et garantit des résultats reproductibles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement du système nerveux central, telles que l'impact de réactifs chimiques spécifiques, comme des inhibiteurs enzymatiques ou des produits géniques ciblant le cycle cellulaire, sur la neurogenèse après incubation.

Placer les œufs à l'âge embryonnaire souhaité dans la hotte à flux laminaire et essuyer les coquilles avec de l'éthanol à 70 % afin d'éviter toute contamination de l'embryon. Taper fermement le côté de l'œuf contre une surface dure pour l'ouvrir, puis verser le contenu dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Utiliser une petite cuillère pour transférer l'embryon dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius afin d'empêcher le tissu de se dessécher.

Ensuite, décapitez l'embryon et placez la boîte de Pétri de 35 millimètres contenant le tissu embryonnaire sous un microscope stéréoscopique binoculaire. Dans la hotte à flux laminaire, utilisez une pince fine pour pratiquer une incision par la bouche, sur la face ventrale de l'œil. À partir du site de l'incision, déchirez le tissu entourant complètement l'œil.

Ensuite, pincez le nerf optique et retirez l'œil intact de la cavité orbitaire. Prélèvez les deux yeux, droit et gauche, du même embryon pour les utiliser comme œil témoin ou œil traité. Utilisez une petite cuillère pour transférer les yeux vers une nouvelle boîte de Pétri de 35 millimètres contenant du PBS préchauffé à l’aide de pinces fines.

Retirer tous les tissus autour de l'œil, y compris le tissu scléral sur la paupière. Ensuite, pincer une petite incision dans l'épithélium pigmentaire à la partie dorsale de l'œil, en prenant soin de ne pas endommager la rétine neuronale. Puis déchirer doucement l'épithélium pigmentaire à partir du site de l'incision.

Laisser le cristallin et toute la rétine attachés au corps vitré. Retirer l'épithélium pigmentaire en faisant attention au niveau du corps ciliaire autour de la pupille dans la région antérieure de l'œil, ainsi qu'au niveau de la fissure choroïdienne, car il est difficile de l'enlever de ces emplacements. Allumer l'appareil électroporateur et régler la tension à 15 volts pour une rétine de stade hamburger et Hamilton 20 à 25, ou à 20 volts pour une rétine de stade 26 à 27.

Ensuite, réglez les impulsions répétées sur cinq impulsions de 50 millisecondes de durée, avec des intervalles d'une seconde. Utilisez un générateur d'impulsions pouvant être commandé par une pédale au sol, car les deux mains seront nécessaires pour maintenir les électrodes en place. Connectez deux électrodes en platine de forme palette, fabriquées sur mesure, à la prise de sortie du générateur d'impulsions.

Les électrodes illustrées ici ont été fabriquées à partir de plaques de platine de 0,1 millimètre d'épaisseur, et le fil conducteur de 0,8 millimètre était isolé. À l’aide d’un tube en plastique, transférez délicatement tout l’explant rétinien dans un récipient à l’aide d’une pipette Pasteur en polyéthylène dont l’extrémité a été coupée. Évitez d’utiliser des embouts de pipette, car la rétine a tendance à adhérer au plastique et à se déchirer.

Ensuite, utilisez une pipette de 100 microlitres pour retirer délicatement tout le PBS entourant l'explant rétinien. Veillez à ne pas toucher la rétine afin d'éviter de la déchirer. Ajoutez 100 microlitres de la solution de plasmide diluée dans le QVE et assurez-vous que tout l'explant rétinien soit recouvert de solution.

Appuyez doucement vers le bas sur l'explant rétinien avec des pinces s'il remonte à la surface. Utilisez des électrodes en forme de pince pour positionner le cristallin de façon à ce qu'il soit orienté vers un côté du puits, tout en dirigeant le nerf optique vers le fond du puits. Ensuite, placez l'électrode positive devant le cristallin et l'électrode négative derrière la rétine, sans toucher le tissu.

Appliquer le courant en appuyant sur la pédale du pied et vérifier la présence de bulles aux électrodes, indiquant une décharge réussie. Utiliser une pipette de 100 microlitres pour retirer tout le mélange de plasmide du qve sans endommager la rétine. Le mélange de plasmide peut être réutilisé de trois à cinq fois après avoir retiré le plasmide.

Remplir la chambre avec du PBS préalablement réchauffé. Utiliser des pinces pour détacher délicatement l’explant rétinien de la paroi de la chambre. Ensuite, utiliser la pipette en polyéthylène pour transférer l’ensemble de l’explant rétinien dans une plaque de 24 puits contenant un millilitre de milieu de culture préalablement réchauffé.

Incuber uniquement un explant rétinien par puits dans le milieu. Incuber l'explant rétinien à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 sur un agitateur rotatif avec une vitesse constante de 50 tr/min. La rotation assure une exposition maximale au milieu et empêche l'adhérence de la rétine au fond de la plaque de 24 puits.

Après 24 heures de culture, des cellules positives pour la GFP étaient visibles dans une grande partie de la rétine intacte, l'électroporation ayant permis à une vaste zone rétinienne d'incorporer le plasmide et d'exprimer le gène rapporteur. Après sectionnement, les cellules uniques positives pour la GFP ont été facilement détectées le long de l'axe basal ACO de la rétine. L'explant entier de rétine peut être cultivé environ 24 heures supplémentaires.

Les durées d'incubation peuvent entraîner un retard de développement, des malformations morphologiques, un apoptose et, éventuellement, une désintégration de la rétine. Une section provenant d'une explant rétinien entier cultivé pendant 24 heures a été immunomarquée avec l'anticorps anti-histone phosphorylée trois, apparaissant ici dans le canal rouge ; l'histone phosphorylée trois marque les cellules en fin de phase G2/métaphase. Les cellules positives pour le marqueur pH3 se trouvaient du côté apical de la rétine, ce qui est conforme au développement rétinien normal.

Comme illustré ici, ce développement peut être bloqué par l'ajout d'un inhibiteur de CDK1-2 ; l'incubation avec l'inhibiteur pendant quatre heures avant l'imagerie a réduit de façon significative le nombre de cellules positives pour pH3 dans la rétine après son développement. Cette technique a été utilisée avec succès pour étudier l'expression génique rapportée à partir de nouveaux plasmides d'ADN et pour traiter des explants rétiniens avec des réactifs chimiques, notamment des régulateurs de la voie de réponse aux dommages de l'ADN et du cycle cellulaire. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des électroporations in ovo, peuvent être réalisées afin de confirmer davantage les résultats.