Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

L’objectif global de cette procédure est de détecter l’activité d’ensemencement protio pathique à partir de sources recombinantes ou biologiques, ce qui permet la détection sensible de protéines, d’agrégats et d’un échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence. Par exemple, comment pourrions-nous évaluer quantitativement les changements dans l’activité d’ensemencement à la suite d’une intervention thérapeutique dans des modèles animaux de maladie ?

Les avantages de cette technique incluent sa grande spécificité envers de faibles niveaux d’agrégats de protéines. Sa spécificité exquise, sa facilité d’utilisation et son débit élevé. La démonstration de cette procédure aujourd’hui sera faite par moi-même, ainsi que par le co-auteur Brandon Holmes.

Pour préparer le matériel biologique de semences, commencez par peser le tissu cérébral congelé dans un bateau de lactosérum jetable. Ensuite, transférez le tissu dans un tube conique, ajoutez un tampon d’homogénéisation glacé, de sorte que la solution finale soit de 10 % pour attendre le volume et transférer les échantillons dans une chambre froide sur glace. Ensuite, ajustez un indicateur de sonde sur les réglages appropriés et rincez le côté et le bas de la sonde.

Donc, l’indicateur pointe trois fois comme indiqué, en essuyant la sonde entre chaque solution. Lorsque la sonde est prête, immergez l’extrémité dans le tampon d’homogénéisation d’un échantillon et démarrez le sonicate en délivrant 25 impulsions au total. Lorsque le tissu est complètement en suspension, faites tourner l’homogénat et transférez le supinate dans un tube propre.

En prenant soin de ne pas déranger le palais. Bien que de nombreuses autres techniques d’homogénéisation soient disponibles, la probation est supérieure pour isoler de petites quantités de graines protio pathiques à partir d’échantillons biologiques. La dissociation mécanique permet une décomposition cohérente et efficace des tissus et l’extraction ultérieure des graines.

Ensuite, aliquotez le décubitus dorsal et stockez les lysats à moins 80 degrés Celsius. Pour rejouer les cellules du biocapteur dans des conditions stériles, rincez chaque lignée cellulaire avec du PBS chaud suivi d’une incubation de trois minutes avec de la trypsine EDTA. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec un milieu de culture chaud et transférez immédiatement les cellules dans un tube conique.

Centrifugez les cellules en suspendant la pastille dans un milieu frais. Comptez ensuite les cellules et faites une dilution cellulaire de 3 500 000 cellules par 13 millilitres de milieu. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez lentement 130 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 96 puits traitée par culture tissulaire à fond plat en prenant soin de placer les pointes de pipette au centre des puits sans toucher le fond de la plaque.

Une fois que les cellules ont été plaquées, laissez-les reposer sans être dérangées pendant 10 minutes à température ambiante, puis incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et une humidité relative supérieure ou égale à 80 %. Le lendemain, lorsque les cellules du biocapteur sont confluentes à 60 à 65 %, combinez un milieu sérique réduit, un réactif liposomique et une source de graines biologique pour créer des complexes de transduction. Ensuite, pipette gly 20 microlitres de complexe de transduction sur le côté de chaque puits de biocapteur individuel et ramène les cellules traitées dans l’incubateur pendant encore 24 à 48 heures avant la récolte.

Les cellules non traitées ne présenteront qu’une fluorescence diffuse. Cependant, les cellules traitées avec du matériel de semence tau montreront des agrégats brillants Après un à deux jours de récolte des cellules, remplacez le milieu de culture cellulaire par 50 microlitres d’EDTA d’essai, arrêtant ainsi la réaction. Après cinq minutes avec 150 microlitres de culture réfrigérée, milieu, transférez immédiatement les cellules sur une plaque à fond rond de 96 puits et granulez les cellules, aspirez les surnageants S sans perturber les granulés, puis réhydratez doucement mais complètement, suspendez les cellules dans 50 microlitres de paraldéhyde à 2 % pendant 10 minutes.

Ensuite, faites tourner à nouveau les cellules et remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux réfrigéré dès que possible. Après la fixation, chargez la plaque sur un cytomètre en flux compatible avec les frettes et générez une zone de diffusion latérale par rapport à une zone de diffusion vers l’avant par un tracé de variante. Ensuite, avec la première ligne cellulaire en marche, ajustez une diffusion latérale et des tensions de diffusion directe jusqu’à ce que la population cellulaire se trouve dans le quadrant inférieur gauche.

Ensuite, à l’aide de l’outil polygone, définissez la population de cellules comme étant la démarche P un. Maintenant, faites une hauteur de diffusion vers l’avant en fonction de la zone de diffusion vers l’avant par un tracé de variante et appliquez la porte P un. Ensuite, définissez les cellules individuelles comme démarche P deux et générez un histogramme chacune.

Pour les filtres C-F-P-Y-F-P et frette, appliquez la porte P deux à trois histogrammes différents, un pour le C-F-P-Y-F-P et un pour les filtres de frettes pour la compensation. Injecter 30 microlitres de la lignée cellulaire une suspension dans 200 microlitres de la lignée cellulaire deux suspensions. Cliquez ensuite sur l’icône des paramètres de l’instrument puis sur l’onglet de compensation et cochez la matrice pour ouvrir le tableau de compensation.

Générez une surface de frette en fonction de la surface CFP par un tracé variable et appliquez la porte P deux. Ensuite, avec la première et la deuxième ligne cellulaire en cours d’exécution, cliquez sur l’icône du quadrant et dessinez des quadrants tels que les populations négatives et positives fluorescentes sont séparées par les deux quadrants inférieurs. Créez maintenant une table de statistiques qui affiche l’intensité de fluorescence médiane ou MFI de la frette pour les portes LL trois et LR trois et ajustez le paramètre de frette dans la matrice de compensation jusqu’à ce que la MFI du signal de frette soit approximativement égale entre LL trois et LR trois.

Ensuite, faites une aire YFP par rapport à une aire CFP par un tracé variable avec des quadrants. Ajustez le paramètre YFP dans la matrice de compensation jusqu’à ce que le MFI du signal YFP soit à peu près égal entre les quadrants. Similaire à celui montré précédemment Pour la cytométrie en flux fret.

Le débordement fluorescent primaire se produit à partir de CFP émis dans le canal de détection des frettes, qui peut être corrigé par compensation de fluorescence à l’aide des cellules de contrôle positives d’une seule couleur lorsque toutes les portes ont été réglées et que le signal CFP a été compensé. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt et analysez le reste de la plaque pour analyser les données. Tout d’abord, définissez les cellules et les cellules individuelles à l’aide des mêmes paramètres que ceux utilisés pour la configuration de l’analyse de flux.

Ensuite, à l’aide de la troisième lignée cellulaire, tracez les cellules positives simples YFP dans une frette par rapport à YFP par variante. Dessinez une porte polygonale qui longe et s’éloigne de la pente de la population de cellules positives à frettes pour définir une démarche à fausse frette, qui exclut le débordement YFP dans le filtre à frettes. Après avoir appliqué la démarche de faux frette à tous les échantillons, tracez les cellules C-F-P-Y-F-P traitées par liposome vides sur une frette en fonction de CFP par tracé variable et introduisez un ga polygonal le long de la pente de la population qui s’étend vers le haut et vers la gauche en s’éloignant de la population.

Tout événement qui se déplace vers cette porte est considéré comme positif et le pourcentage de cellules sera corrélé au titre de graines utilisé pendant le traitement. Enfin, notez les paramètres d’analyse d’intérêt, y compris le pourcentage de positivité de frette et l’intensité de fluorescence médiane des cellules positives à frette. Mesurez ensuite le produit du pourcentage de positivité et de l’IFM pour calculer manuellement la densité de frette intégrée.

En l’absence d’agrégats ou de graines de tau, la protéine tau est maintenue dans un état monomère soluble, représenté par un signal fluorescent diffus et négatif constant. Suite à l’introduction de graines de tau dans les cellules du biocapteur, la protéine tau endogène est convertie en une quantification agrégée et positive de l’état. L’analyse par cytométrie en flux suivante confirme que les concentrations femto-molaires de tau recombinante sont suffisantes pour la détection. Ici.

Le tissu du tronc cérébral de souris tauopathiques sacrifiées à différents âges sert de région cérébrale représentative, démontrant une détection cohérente de l’activité d’ensemencement chez les animaux dès l’âge de 1,5 mois. Dans cette expérience, le cerveau homogène des sujets atteints de la maladie d’Alzheimer a montré une activité d’ensemencement robuste, tandis que les sujets témoins appariés selon l’âge et atteints de la maladie de Huntington n’ont pas démontré la spécificité du test pour les agrégats de tau des cultures neuronales primaires non traitées transduites avec tau, CFP et tau. Les constructions lentivirales YFP ont montré un signal fluorescent diffus lors du traitement avec des graines tau recombinantes.

Cependant, la protéine tau endogène forme de grands agrégats détectables par cytométrie en flux frettaire, même en l’absence de transduction médiée par les liposomes. Lorsque les sources de graines sont pré-incubées avec des médicaments qui inhibent l’absorption de tau, tels que l’héparine, et sont traitées en l’absence de liposomes, l’activité d’ensemencement contenue dans les échantillons de cerveau de souris recombinantes et tauopathiques peut être bloquée. Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en trois jours, avec seulement une à deux heures de travail sur banc par jour. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler qu’une optimisation interne sera nécessaire pour certaines étapes. Par exemple, lors de la détermination des titres efficaces à partir de graines protio pathiques provenant de diverses sources biologiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer, d’exécuter et d’analyser des expériences de cytométrie en flux frettaire dans le but de détecter l’activité d’ensemencement protiopathique à partir de sources recombinantes et biologiques.