Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

L'objectif général de cette procédure est de détecter l'activité d'ensemencement protéique à partir de sources recombinantes ou biologiques, permettant ainsi la détection sensible d'agrégats protéiques et d'un échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence. Par exemple, comment pouvons-nous évaluer quantitativement les changements d'activité d'ensemencement après une intervention thérapeutique dans des modèles animaux de maladie ?

Les avantages de cette technique comprennent sa haute spécificité envers les faibles concentrations d'agrégats protéiques. Sa spécificité remarquable, sa facilité d'utilisation et son haut débit. J'illustrerai cette procédure aujourd'hui, en compagnie de mon coauteur Brandon Holmes.

Pour préparer le matériel biologique de départ, commencez par peser le tissu cérébral congelé dans un bateau en plastique jetable. Transférez ensuite le tissu dans un tube conique et ajoutez du tampon d'homogénéisation glacé de manière à obtenir une solution finale à 10 % par rapport au volume, puis transférez les échantillons dans une chambre froide sur de la glace. Réglez ensuite un dispositif de sonde sur les paramètres appropriés et rincez les côtés et le fond de la sonde.

Agiter donc l'indicateur trois fois comme indiqué, en essuyant la sonde entre chaque solution. Lorsque la sonde est prête, plonger la pointe dans le tampon d'homogénéisation d'un échantillon et commencer la sonication en appliquant 25 impulsions au total. Lorsque le tissu est complètement en suspension, centrifuger l'homogénat et transférer le surnageant dans un tube propre.

En prenant soin de ne pas perturber le palais. Bien que de nombreuses autres techniques d'homogénéisation soient disponibles, la probation est préférable pour isoler de faibles quantités de graines protio pathiques à partir d'échantillons biologiques. La dissociation mécanique permet une dégradation constante et efficace des tissus et une extraction ultérieure des graines.

Ensuite, aliquoter le surnageant et conserver les lysats à moins 80 degrés Celsius. Pour repiquer les cellules biosenseurs dans des conditions stériles, rincer chaque lignée cellulaire avec du PBS tiède, puis effectuer une incubation de trois minutes avec de la trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec du milieu de culture tiède et transférer immédiatement les cellules dans un tube conique.

Centrifuger les cellules en suspension, en resuspendant le culot dans un milieu frais. Ensuite, compter les cellules et préparer une dilution mère de cellules à 3 500 000 cellules par 13 millilitres de milieu. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer lentement 130 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 96 puits, à fond plat et traité, en prenant soin de placer les embouts de pipette au centre des puits sans toucher le fond de la plaque.

Une fois les cellules ensemencées, laissez-les se déposer sans perturbation pendant 10 minutes à température ambiante, puis incubez la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone et une humidité relative supérieure ou égale à 80 %. Le jour suivant, lorsque les cellules biosenseurs atteignent une confluence de 60 à 65 %, mélangez le milieu à faible teneur en sérum, le réactif liposomique et la source biologique d'ensemencement pour former des complexes de transduction. Ensuite, pipetez délicatement 20 microlitres de complexe de transduction le long de la paroi de chaque puits individuel contenant les cellules biosenseurs, puis replacez les cellules traitées dans l'incubateur pendant 24 à 48 heures supplémentaires avant la récolte.

Les cellules non traitées présenteront uniquement une fluorescence diffuse. Toutefois, les cellules traitées avec du matériel germe de protéine tau présenteront des agrégats brillants. Après un à deux jours, récoltez les cellules, remplacez le milieu de culture par 50 microlitres de trypsine EDTA afin d'arrêter la réaction. Après cinq minutes, ajoutez 150 microlitres de milieu de culture refroidi, transférez immédiatement les cellules dans une plaque de 96 puits à fond rond et faites tomber les cellules en centrifugeant. Aspirez les surnageants sans perturber les culots, puis remettez délicatement mais complètement en suspension les cellules dans 50 microlitres de paraformaldéhyde 2 % pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre les culots dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux refroidi le plus rapidement possible. Après fixation, placer la plaque sur un cytomètre en flux compatible fret et générer un graphique de la surface de dispersion latérale en fonction de la surface de dispersion avant par variante. Ensuite, avec la lignée cellulaire numéro un en cours d'exécution, ajuster les tensions de dispersion latérale et de dispersion avant jusqu'à ce que la population cellulaire se trouve dans le quadrant inférieur gauche.

Ensuite, à l'aide de l'outil polygone, délimitez la population cellulaire comme la porte P un. Créez maintenant un nuage de points de la diffusion directe hauteur contre la surface de la diffusion directe par variante, puis appliquez la porte P un. Définissez ensuite les cellules uniques comme la porte P deux et générez un histogramme chacun.

Pour les filtres C-F-P-Y-F-P et FRET, appliquez la porte P à deux ou trois histogrammes différents, un pour chaque filtre C-F-P-Y-F-P et FRET, afin de réaliser la compensation. Ajoutez 30 microlitres de la suspension de la lignée cellulaire un à 200 microlitres de la suspension de la lignée cellulaire deux. Cliquez ensuite sur l'icône des paramètres de l'appareil, puis sur l'onglet de compensation et cochez la case matrice pour ouvrir le tableau de compensation.

Générez un graphique de l'aire de fret en fonction de l'aire de CFP et appliquez la porte P deux. Ensuite, avec la lignée cellulaire un et la lignée cellulaire deux en cours d'exécution, cliquez sur l'icône de quadrant et tracez des quadrants de manière à ce que les populations négatives et positives pour la fluorescence soient séparées par les deux quadrants inférieurs. Créez maintenant un tableau statistique affichant l'intensité médiane de fluorescence ou IMF de fret pour les portes LL trois et LR trois, puis ajustez le paramètre fret dans la matrice de compensation jusqu'à ce que l'IMF du signal fret soit approximativement égale entre LL trois et LR trois.

Ensuite, créez un graphique de la zone YFP en fonction de la zone CFP par un tracé à variables multiples avec quadrants. Ajustez le paramètre YFP dans la matrice de compensation jusqu'à ce que l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) du signal YFP soit approximativement égale entre les quadrants. De manière similaire à ce qui a été montré précédemment pour la cytométrie en flux FRET.

Le débordement fluorescent principal provient du CFP émis dans le canal de détection FRET, qui peut être corrigé par compensation de fluorescence à l'aide de cellules contrôles positives monocolorées. Une fois tous les seuils définis et le signal CFP compensé, mettez en surbrillance les puits d'intérêt et exécutez le reste de la plaque pour analyser les données. Définissez d'abord les cellules et les cellules uniques en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour configurer l'analyse en cytométrie.

Ensuite, à l’aide de la lignée cellulaire trois, tracer les cellules uniforment positives pour YFP sur un graphique de type FRET en fonction de YFP par variante. Tracer une fenêtre polygonale qui suit et s’éloigne de la pente de la population de cellules positives pour FRET afin de définir une fenêtre FRET fausse, excluant ainsi le débordement de YFP dans le filtre FRET. Après avoir appliqué cette fenêtre FRET fausse à tous les échantillons, représenter les cellules C-F-P-Y-F-P traitées par des liposomes vides sur un graphique de type FRET en fonction de CFP par variante, puis tracer une fenêtre polygonale le long de la pente de la population, s’étendant vers le haut et vers la gauche en s’éloignant de la population.

Tous les événements qui pénètrent dans cette fenêtre sont considérés comme positifs pour le transfert d'énergie par résonance (FRET), et le pourcentage de cellules corrélera avec la concentration initiale utilisée pendant le traitement. Enfin, enregistrez les paramètres d'analyse d'intérêt, notamment le pourcentage de positivité au FRET et l'intensité médiane de fluorescence des cellules positives au FRET. Ensuite, mesurez le produit du pourcentage de positivité et de l'intensité médiane de fluorescence (MFI) pour calculer manuellement la densité intégrée de FRET.

En l'absence d'agrégats ou de « graines » de protéine tau, la protéine tau reste sous forme monomérique soluble, comme en témoigne un signal fluorescent diffus constant et négatif pour la FRET. Après l'introduction de « graines » de tau dans les cellules biosenseurs, la protéine tau endogène est convertie en un état agrégé positif pour la FRET, permettant la quantification par FRET. L'analyse par cytométrie en flux confirme que des concentrations de l'ordre du femtomolaire de la protéine tau recombinante sont suffisantes pour la détection. Ici.

Le tissu du tronc cérébral de souris modèles de tauopathie sacrifiées à différents âges sert de région cérébrale représentative démontrant une détection constante de l'activité de nucléation chez les animaux dès l'âge de 1,5 mois. Dans cette expérience, les homogénats cérébraux de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer ont montré une activité de nucléation importante, tandis que les sujets témoins appariés par âge et ceux atteints de la maladie de Huntington n'ont pas démontré de spécificité de dosage pour les agrégats de protéine Tau. Des cultures primaires de neurones non traités, transduits avec des constructions lentivirales codant pour la protéine Tau-CFP et la protéine Tau-YFP, ont présenté un signal fluorescent diffus après traitement avec des « seeds » de protéine Tau recombinante.

Cependant, la protéine tau endogène forme de grands agrégats détectables par cytométrie de flux FRET, même en l'absence de transduction médiée par des liposomes. Lorsque les sources d'ensemencement sont pré-incubées avec des médicaments qui inhibent l'absorption de la tau, tels que l'héparine, et traitées en l'absence de liposomes, l'activité d'ensemencement présente dans les échantillons de cerveau de souris modèles de tauopathie ainsi que dans les protéines tau recombinantes peut être bloquée. Une fois maîtrisée.

Cette technique peut être réalisée en trois jours, avec seulement une à deux heures de travail sur la paillasse par jour. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'une optimisation en interne sera nécessaire pour certaines étapes. Par exemple, lors de la détermination des titres efficaces à partir de graines protio pathiques provenant de diverses sources biologiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment configurer, réaliser et analyser des expériences de cytométrie en flux FRET afin de détecter l'activité d'amorçage protéopathique provenant de sources recombinantes et biologiques.