Name: Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux FRET pour détecter l'activité de semis protéopathique dans les échantillons biologiques. Cette technique hautement spécifique permet d'évaluer quantitativement les agrégats protéiques et les interventions thérapeutiques.

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Ce test a été licencié à Janssen Pharmaceuticals.

La cytométrie en flux système de FRET décrit ici est un outil puissant pour évaluer rapidement et quantitativement l&#39;activité de la protéine tau ensemencement. Elle exige seulement une expérience de culture cellulaire modérée et une connaissance pratique de FRET et cytométrie de flux. D&#39;autres essais de semis, comme Thioflavine T - qui présente une fluorescence améliorée lorsqu&#39;il est lié à la structure de feuillet bêta - sont laborieux et nécessitent un substrat de protéine pure, recombinant. En outre, ...

L&#39;accumulation intracellulaire de la protéine tau amyloïdes tauopathies définit comme la maladie d&#39;Alzheimer. Dans les stades précoces de la maladie, la pathologie est généralement localisée à des régions discrètes du cerveau, mais avec la progression de la maladie, la pathologie se propage le long de invariablement réseaux neuronaux distincts 1-5. L&#39;accumulation de preuves suggère transcellulaire propagation d&#39;agrégats de protéines toxiques à la base de cette pathologie (revue dans 10/06). Dans ce modèle, les graines proteopathic (par exemple, tau) sont libérés de cellules du donneur et pénètrent dans les cellules voisines, la transformation de la protéine tau natif dans le formulaire mal repliées via templated changement conformationnel 11-15. L&#39;essai décrit ici a été développé pour détecter sensibilité telle activité d&#39;ensemencement. Il est compatible avec la protéine recombinante et des échantillons biologiques et permet la quantification des niveaux d&#39;activité minute d&#39;ensemencement proteopathic 16. Des cellules HEK 293T qui expriment de manière stable la protéine tau répétition dOMAINE (RD) contenant le P301S mutation associée à la maladie soit fusionnée à PCP ou YFP (ci-après dénommé cellules tau-RD-CFP / YFP) servir un biocapteur stable de l&#39;activité d&#39;ensemencement. En l&#39;absence de graines proteopathic, maintenir les cellules tau en tant que monomère soluble, pas de fond et ont FRET appréciable. L&#39;absorption spontanée ou transduction médiée par des liposomes de graines de tau dans les cellules, cependant, conduit à RD-CFP et YFP-agrégation RD, qui produit un signal de FRET qui est mesurée dans des cellules individuelles par cytométrie en flux. De nombreux composants de cet essai ont été conçus pour améliorer la sensibilité et de réduire la variabilité. Une lignée cellulaire monoclonal avec un 1: RD-CFP / YFP 1 ratio d&#39;expression a été choisi, car il fournit un signal optimal: le bruit. Pour augmenter la sensibilité, les phospholipides sont utilisés pour introduire les graines directement dans les cellules (bien que d&#39;étudier les mécanismes biologiques de l&#39;absorption, cela peut être omise). Enfin, la cytométrie de flux moniteurs FRET au niveau de la population et une seule cellule<html> niveau, contrairement à d&#39;autres essais d&#39;agrégation des protéines. Le critère d&#39;évaluation finale, la densité de FRET intégré, est hautement quantitative et représente à la fois pour le nombre de cellules présentant l&#39;agrégation, et la mesure dans laquelle l&#39;agrégation a eu lieu au sein de chaque cellule. Tous ces paramètres optimisés améliorer la sensibilité et de garantir la reproductibilité. Ce système a été récemment utilisé dans une étude approfondie dans les souris transgéniques tauopathie P301S 17 qui a évalué l&#39;apparition temporelle et la progression de l&#39;activité d&#39;ensemencement de tau par rapport à d&#39;autres marqueurs pathologiques de la protéine tau couramment utilisés (par exemple, MC1, AT8, PG5, et thioflavines). L&#39;activité de semis est de loin le marqueur précoce et le plus robuste de la pathologie tau évalué, précédant la détection histologique par au moins 6 semaines. Semis activité apparaît à 1,5 mois et augmente progressivement avec l&#39;âge, ce qui suggère un rôle causal de graines proteopathic dans l&#39;apparition et / ou la progression de la neurodégénérescence 16. e_content &quot;&gt; quantification précise des niveaux infimes de matériel de semence à partir d&#39;échantillons biologiques peut faciliter les études qui surveillent la progression de la maladie au stade précoce. En raccourcissant la durée du procès et permettant l&#39;utilisation d&#39;animaux plus jeunes, ce qui pourrait accroître l&#39;efficacité et la précision des essais précliniques animales. Par exemple, dans P301S la souris décrit ci-dessus, les composés du plomb peuvent être fournis aussi tôt que 4-6 semaines (juste avant, ou au début de l&#39;activité d&#39;ensemencement), et pour surveiller l&#39;efficacité 2-4 semaines plus tard. Le dosage devrait quantifier avec précision toute réduction des semis activité. FRET cytométrie en flux a in vitro applications de criblage ainsi. Par exemple, des réactifs anti-tau (par exemple, des anticorps, de petites molécules, etc.) peut être testé rapidement pour leur capacité à bloquer l&#39;ensemencement induction directement dans la culture, en utilisant soit la protéine tau recombinante agrégats ou lysats dérivé du cerveau comme une source de graines (figure 5). Avec cette configuration, une fois matériel de semence est préparé, un exexpé- prend seulement trois jours pour compléter, y compris l&#39;analyse de données. La quantification rapide de l&#39;activité d&#39;ensemencement proteopathic peut donc faciliter de nombreuses études de la neurodégénérescence.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase cOmplete (sans EDTA)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-flacons</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Homogénéisateur à ultrasons</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pointe pour homogénéisateur à ultrasons</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Casque antibruit</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes coniques</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml réservoir de réactifs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond plat 96 puits</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 plaques à fond rond</td><td>bien rond Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall ST 40</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Rotor à godet oscillant</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Cytomètre en flux</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse Flow Jo</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu ; l pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; l pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; l pointes de pipette</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipette sérologique</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette sérologique</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipette sérologique</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

détection sensible de proteopathic semis activité fret avec la cytométrie en flux

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

De plus en plus de preuves soutiennent la propagation transcellulaire d’agrégats de protéines toxiques, ou graines protéopathiques, comme mécanisme d’initiation et de progression de la pathologie dans plusieurs maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer et les tauopathies associées. Le rôle potentiellement critique des graines de tau dans la progression de la maladie soutient fortement la nécessité d’un test sensible qui détecte facilement l’activité d’ensemencement dans les échantillons biologiques. 
En combinant la spécificité du transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), la sensibilité de la cytométrie en flux et la stabilité d’une lignée cellulaire monoclonale, un test d’ensemencement ultra-sensible a été mis au point et est compatible avec la détection de graines à partir d’échantillons recombinants ou biologiques, y compris des homogénats de cerveau humain et de souris. Le test utilise des cellules monoclonales HEK 293T qui expriment de manière stable le domaine répété (RD) sujet à l’agrégation de tau hébergeant la mutation P301S associée à la maladie fusionnée à CFP ou YFP, qui produisent un signal FRET lors de l’agrégation de protéines. L’absorption de graines tau protéopathiques (mais pas d’autres protéines) dans les cellules du biocapteur stimule l’agrégation de RD-CFP et de RD-YFP, et la cytométrie en flux surveille de manière sensible et quantitative cette FRET induite par l’agrégation. Le test détecte les concentrations femtomolaires (équivalent monomère) de graines de tau recombinantes, a une plage dynamique couvrant trois ordres de grandeur et est compatible avec les homogénats cérébraux de souris transgéniques tauopathiques et de sujets tauopathiques humains. Avec de légères modifications, le test peut également détecter l’activité d’ensemencement d’autres grains protéopathiques, tels que la α-synucléine, et est également compatible avec les cultures neuronales primaires. La facilité, la sensibilité et la large applicabilité de la cytométrie en flux FRET la rendent utile pour l’étude d’un large éventail de troubles de l’agrégation des protéines.

FRET cytométrie en flux permet sensible, quantitative, et la détection rapide de l&#39;activité de l&#39;ensemencement à partir d&#39;échantillons recombinantes ou biologiques. Configuration de test est facile: lignées cellulaires stables monoclonaux dérivés exprimant la protéine tau-RD-CFP / YFP sont transduites avec du matériel de semences, incubées pendant 24-48 h, et ​​soumis à l&#39;analyse par cytométrie de flux (figure 1A). En l&#39;absence de semences, les cellules de biocapteurs maintenir tau s...

Le transfert de cellule à cellule d’agrégats de protéines, ou de graines protéopathiques, peut être à l’origine de la progression de la pathologie dans les maladies neurodégénératives. Ici, un nouveau test de cytométrie en flux FRET est décrit qui permet une détection spécifique et sensible de l’activité d’ensemencement à partir d’échantillons recombinants ou biologiques.

Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter l'activité d'ensemencement protéique à partir de sources recombinantes ou biologiques, permettant ainsi la détection sensible d'agrégats protéiques et d'un échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurodégénérescence. Par exemple, comment pouvons-nous évaluer quantitativement les changements d'activité d'ensemencement après une intervention thérapeutique dans des modèles animaux de maladie ?Les avantages de cette technique comprennent sa haute spécificité envers les faibles concentrations d'agrégats protéiques. Sa spécificité remarquable, sa facilité d'utilisation et son haut débit. J'illustrerai cette procédure aujourd'hui, en compagnie de mon coauteur Brandon Holmes.Pour préparer le matériel biologique de départ, commencez par peser le tissu cérébral congelé dans un bateau en plastique jetable. Transférez ensuite le tissu dans un tube conique et ajoutez du tampon d'homogénéisation glacé de manière à obtenir une solution finale à 10 % par rapport au volume, puis transférez les échantillons dans une chambre froide sur de la glace. Réglez ensuite un dispositif de sonde sur les paramètres appropriés et rincez les côtés et le fond de la sonde.Agiter donc l'indicateur trois fois comme indiqué, en essuyant la sonde entre chaque solution. Lorsque la sonde est prête, plonger la pointe dans le tampon d'homogénéisation d'un échantillon et commencer la sonication en appliquant 25 impulsions au total. Lorsque le tissu est complètement en suspension, centrifuger l'homogénat et transférer le surnageant dans un tube propre.En prenant soin de ne pas perturber le palais. Bien que de nombreuses autres techniques d'homogénéisation soient disponibles, la probation est préférable pour isoler de faibles quantités de graines protio pathiques à partir d'échantillons biologiques. La dissociation mécanique permet une dégradation constante et efficace des tissus et une extraction ultérieure des graines.Ensuite, aliquoter le surnageant et conserver les lysats à moins 80 degrés Celsius. Pour repiquer les cellules biosenseurs dans des conditions stériles, rincer chaque lignée cellulaire avec du PBS tiède, puis effectuer une incubation de trois minutes avec de la trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec du milieu de culture tiède et transférer immédiatement les cellules dans un tube conique.Centrifuger les cellules en suspension, en resuspendant le culot dans un milieu frais. Ensuite, compter les cellules et préparer une dilution mère de cellules à 3 500 000 cellules par 13 millilitres de milieu. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer lentement 130 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 96 puits, à fond plat et traité, en prenant soin de placer les embouts de pipette au centre des puits sans toucher le fond de la plaque.Une fois les cellules ensemencées, laissez-les se déposer sans perturbation pendant 10 minutes à température ambiante, puis incubez la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone et une humidité relative supérieure ou égale à 80 %. Le jour suivant, lorsque les cellules biosenseurs atteignent une confluence de 60 à 65 %, mélangez le milieu à faible teneur en sérum, le réactif liposomique et la source biologique d'ensemencement pour former des complexes de transduction. Ensuite, pipetez délicatement 20 microlitres de complexe de transduction le long de la paroi de chaque puits individuel contenant les cellules biosenseurs, puis replacez les cellules traitées dans l'incubateur pendant 24 à 48 heures supplémentaires avant la récolte.Les cellules non traitées présenteront uniquement une fluorescence diffuse. Toutefois, les cellules traitées avec du matériel germe de protéine tau présenteront des agrégats brillants. Après un à deux jours, récoltez les cellules, remplacez le milieu de culture par 50 microlitres de trypsine EDTA afin d'arrêter la réaction. Après cinq minutes, ajoutez 150 microlitres de milieu de culture refroidi, transférez immédiatement les cellules dans une plaque de 96 puits à fond rond et faites tomber les cellules en centrifugeant. Aspirez les surnageants sans perturber les culots, puis remettez délicatement mais complètement en suspension les cellules dans 50 microlitres de paraformaldéhyde 2 % pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre les culots dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux refroidi le plus rapidement possible. Après fixation, placer la plaque sur un cytomètre en flux compatible fret et générer un graphique de la surface de dispersion latérale en fonction de la surface de dispersion avant par variante. Ensuite, avec la lignée cellulaire numéro un en cours d'exécution, ajuster les tensions de dispersion latérale et de dispersion avant jusqu'à ce que la population cellulaire se trouve dans le quadrant inférieur gauche.Ensuite, à l'aide de l'outil polygone, délimitez la population cellulaire comme la porte P un. Créez maintenant un nuage de points de la diffusion directe hauteur contre la surface de la diffusion directe par variante, puis appliquez la porte P un. Définissez ensuite les cellules uniques comme la porte P deux et générez un histogramme chacun.Pour les filtres C-F-P-Y-F-P et FRET, appliquez la porte P à deux ou trois histogrammes différents, un pour chaque filtre C-F-P-Y-F-P et FRET, afin de réaliser la compensation. Ajoutez 30 microlitres de la suspension de la lignée cellulaire un à 200 microlitres de la suspension de la lignée cellulaire deux. Cliquez ensuite sur l'icône des paramètres de l'appareil, puis sur l'onglet de compensation et cochez la case matrice pour ouvrir le tableau de compensation.Générez un graphique de l'aire de fret en fonction de l'aire de CFP et appliquez la porte P deux. Ensuite, avec la lignée cellulaire un et la lignée cellulaire deux en cours d'exécution, cliquez sur l'icône de quadrant et tracez des quadrants de manière à ce que les populations négatives et positives pour la fluorescence soient séparées par les deux quadrants inférieurs. Créez maintenant un tableau statistique affichant l'intensité médiane de fluorescence ou IMF de fret pour les portes LL trois et LR trois, puis ajustez le paramètre fret dans la matrice de compensation jusqu'à ce que l'IMF du signal fret soit approximativement égale entre LL trois et LR trois.Ensuite, créez un graphique de la zone YFP en fonction de la zone CFP par un tracé à variables multiples avec quadrants. Ajustez le paramètre YFP dans la matrice de compensation jusqu'à ce que l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) du signal YFP soit approximativement égale entre les quadrants. De manière similaire à ce qui a été montré précédemment pour la cytométrie en flux FRET.Le débordement fluorescent principal provient du CFP émis dans le canal de détection FRET, qui peut être corrigé par compensation de fluorescence à l'aide de cellules contrôles positives monocolorées. Une fois tous les seuils définis et le signal CFP compensé, mettez en surbrillance les puits d'intérêt et exécutez le reste de la plaque pour analyser les données. Définissez d'abord les cellules et les cellules uniques en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour configurer l'analyse en cytométrie.Ensuite, à l’aide de la lignée cellulaire trois, tracer les cellules uniforment positives pour YFP sur un graphique de type FRET en fonction de YFP par variante. Tracer une fenêtre polygonale qui suit et s’éloigne de la pente de la population de cellules positives pour FRET afin de définir une fenêtre FRET fausse, excluant ainsi le débordement de YFP dans le filtre FRET. Après avoir appliqué cette fenêtre FRET fausse à tous les échantillons, représenter les cellules C-F-P-Y-F-P traitées par des liposomes vides sur un graphique de type FRET en fonction de CFP par variante, puis tracer une fenêtre polygonale le long de la pente de la population, s’étendant vers le haut et vers la gauche en s’éloignant de la population.Tous les événements qui pénètrent dans cette fenêtre sont considérés comme positifs pour le transfert d'énergie par résonance (FRET), et le pourcentage de cellules corrélera avec la concentration initiale utilisée pendant le traitement. Enfin, enregistrez les paramètres d'analyse d'intérêt, notamment le pourcentage de positivité au FRET et l'intensité médiane de fluorescence des cellules positives au FRET. Ensuite, mesurez le produit du pourcentage de positivité et de l'intensité médiane de fluorescence (MFI) pour calculer manuellement la densité intégrée de FRET.En l'absence d'agrégats ou de « graines » de protéine tau, la protéine tau reste sous forme monomérique soluble, comme en témoigne un signal fluorescent diffus constant et négatif pour la FRET. Après l'introduction de « graines » de tau dans les cellules biosenseurs, la protéine tau endogène est convertie en un état agrégé positif pour la FRET, permettant la quantification par FRET. L'analyse par cytométrie en flux confirme que des concentrations de l'ordre du femtomolaire de la protéine tau recombinante sont suffisantes pour la détection. Ici.Le tissu du tronc cérébral de souris modèles de tauopathie sacrifiées à différents âges sert de région cérébrale représentative démontrant une détection constante de l'activité de nucléation chez les animaux dès l'âge de 1,5 mois. Dans cette expérience, les homogénats cérébraux de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer ont montré une activité de nucléation importante, tandis que les sujets témoins appariés par âge et ceux atteints de la maladie de Huntington n'ont pas démontré de spécificité de dosage pour les agrégats de protéine Tau. Des cultures primaires de neurones non traités, transduits avec des constructions lentivirales codant pour la protéine Tau-CFP et la protéine Tau-YFP, ont présenté un signal fluorescent diffus après traitement avec des « seeds » de protéine Tau recombinante.Cependant, la protéine tau endogène forme de grands agrégats détectables par cytométrie de flux FRET, même en l'absence de transduction médiée par des liposomes. Lorsque les sources d'ensemencement sont pré-incubées avec des médicaments qui inhibent l'absorption de la tau, tels que l'héparine, et traitées en l'absence de liposomes, l'activité d'ensemencement présente dans les échantillons de cerveau de souris modèles de tauopathie ainsi que dans les protéines tau recombinantes peut être bloquée. Une fois maîtrisée.Cette technique peut être réalisée en trois jours, avec seulement une à deux heures de travail sur la paillasse par jour. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'une optimisation en interne sera nécessaire pour certaines étapes. Par exemple, lors de la détermination des titres efficaces à partir de graines protio pathiques provenant de diverses sources biologiques.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment configurer, réaliser et analyser des expériences de cytométrie en flux FRET afin de détecter l'activité d'amorçage protéopathique provenant de sources recombinantes et biologiques.

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JoVE Journal

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Bioingénierie

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