Activité caspase-3 dans l'amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

L’infarctus du myocarde (IM) est non seulement suivi d’une altération de la fonction cardiaque, mais aussi d’une apoptose de l’amygdale, une région du cerveau impliquée dans les conséquences comportementales de l’IM. Ce protocole décrit comment induire l’IM, collecter le tissu amygdale et mesurer l’activité de la caspase-3, un marqueur de l’apoptose.

L’objectif global de cette procédure est de mesurer l’activité de la caspase-3 dans l’amygdale du rat après un infarctus du myocarde à l’aide de la spectrofluormétrie. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la science neuronale comportementale, telles que les conséquences d’un infarctus du myocarde sur les performances cognitives, la santé mentale, le processus de vieillissement et le sommeil. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rapide et fiable.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auraient du mal car elle nécessite la dextérité nécessaire pour la chirurgie et l’échantillonnage de tissus. Kim Gilbert, assistante de recherche dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir induit l’anesthésie conformément aux protocoles institutionnels approuvés, confirmez l’anesthésie appropriée par l’absence de réflexe de pincement de la patte.

Intubez le rat avec un tube endotrachéal et placez l’animal en position de décubitus ventral sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Connectez la tubulure endotrachéale à un appareil d’anesthésie distribuant 2 % d’isofluorane. Ensuite, préparez le site chirurgical avec du gluconate de chlorhexidine et de l’alcool isopropylique.

Et appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Placez un champ stérile sur l’animal pour créer un champ stérile autour du site chirurgical. Et placez les instruments chirurgicaux stériles requis sur un autre champ stérile à côté de l’animal.

Ensuite, incisez la peau avec une lame de scalpel numéro 10 ou des ciseaux. Utilisez des ciseaux ou une pince hémostatique pour décoller le tissu musculaire. Ensuite, à l’aide de ciseaux ou d’une pince hémostatique, ouvrez la paroi thoracique et positionnez l’écarteur thoracique, et ouvrez le péricarde avec la pince hémostatique.

Pour induire une occlusion coronaire, enroulez d’abord une suture en soie quatre zéros de 360 millimètres de long autour de l’artère coronaire descendante et à travers le tissu myocardique contigu. Insérez les deux extrémités de la suture en soie dans un tube en plastique de calibre 14 de 1,25 centimètre de long. Tirez les deux extrémités de la suture en soie et poussez le tube contre l’artère pour l’obstruer.

Fixez l’occlusion en serrant le tube en plastique à l’aide d’une pince hémostatique et maintenez l’occlusion pendant 40 minutes. Après 40 minutes, libérez l’occlusion en retirant la pince hémostatique, puis le tube flexible et la suture en soie. Fermez le thorax avec deux points de suture zéro et placez un cathéter flexible à travers la cavité thoracique et aspirez de l’air hors du thorax avec une seringue de 10 millilitres pour prévenir le pneumothorax.

Cousez le muscle avec quatre sutures en soie zéro et la peau avec trois sutures en soie zéro. Avant de fermer la dernière suture cutanée, aspirez à nouveau l’air du thorax à l’aide de la seringue de 10 millilitres et du cathéter. Terminez la fermeture de la peau puis arrêtez l’isofluorane.

Placez le rat dans une cage propre et surveillez-le pendant la récupération de l’anesthésie. Administrer l’analgésie avec une dose répétée toutes les huit heures. Après avoir décapité l’animal sans cruauté conformément aux procédures approuvées, placez la tête du rat sur un plat placé sur de la glace pilée.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir le crâne. Utilisez ensuite des rongeurs pour détacher les poulies osseuses sans mutiler le tissu sous-jacent en tirant vers le haut. Ensuite, placez la lame plate d’une spatule entre le bas du crâne et la surface ventrale postérieure du cerveau et détachez le cerveau du crâne en poussant doucement la lame vers l’avant, soulevant le cerveau hors du crâne.

Placez le cerveau sur sa surface dorsale. Identifiez l’hypothalamus devant le cervelet et coupez le cerveau coronalement devant l’extrémité postérieure de l’hypothalamus et également derrière l’extrémité antérieure. Identifiez l’amygdale bilatérale comme étant deux petites sphères sous les lobes temporaux juste à côté de l’hypothalamus.

Ensuite, retournez le cerveau à plat sur son extrémité frontale, la surface dorsale éloignée de l’expérimentateur. Ensuite, séparez les hémisphères et retirez le cortex de l’amygdale continue. Lorsque l’amygdale est révélée, coupez-la avec un scalpel.

Coupez le long de la suture sombre qui traverse l’amygdale pour séparer les parties basolatérale et médiale centrale, puis placez les deux parties dans des tubes étiquetés séparés sur de la glace. Cette étape doit être effectuée le plus rapidement possible pour éviter la détérioration des enzymes. Après avoir répété la procédure de dissection avec l’autre hémisphère, plongez les quatre flacons dans de l’azote liquide pendant une minute, puis conservez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Commencez par ajouter 150 microlitres de tampon de lyse à chaque cinq à 10 milligrammes d’échantillon sur glace. Sonicez chaque échantillon sur de la glace à l’intensité maximale pendant cinq secondes. Ensuite, incubez sur glace pendant 30 minutes.

Pendant l’incubation, agitez l’échantillon pendant cinq secondes toutes les cinq minutes. Ensuite, effectuez trois cycles de congélation-décongélation en plaçant les échantillons alternativement dans de l’azote liquide et sur une plaque chauffante thermostatisée réglée à 37 décrets Celsius. Après le dernier cycle de congélation-décongélation, centrifugez les échantillons de tissus à 1300 G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un tube frais sur de la glace. Après avoir quantifié les protéines selon les instructions du protocole écrit, ajoutez 25 microgrammes de protéines dans un tube de réaction contenant 0,8 microlitre d’Ac-DEVD-AMC de 10 millimolaires et un tampon de réaction pour un volume final de 200 microlitres. Pour les échantillons de réaction négative, combinez 25 microgrammes de protéines avec un microlitre de 800 micromolaires Ac-DEVD-CHO et 0,8 microlitre de 10 millimolaires Ac-DEVD-AMC.

Incuber tous les échantillons et les témoins dans l’obscurité pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Une fois le temps d’incubation écoulé, arrêtez la réaction avec 600 microlitres de glycine à 0,4 molaire et d’hydroxyde de sodium à 0,4 molaire à pH 10 dans chaque échantillon et contrôle. Ajoutez deux millilitres d’eau distillée à chaque réaction dans une cuvette en verre.

Quantifier la fluorescence par spectrofluormétrie. Lisez les commandes et les échantillons pendant 10 secondes, à raison d’une lecture toutes les secondes. Enfin, quantifiez l’activité spécifique de chaque échantillon selon la formule maintenant affichée à l’écran.

Cet histogramme montre l’activité de la caspase-3 dans l’amygdale de rats ayant subi un infarctus du myocarde. Les données sont exprimées en pourcentage de l’activité moyenne chez les témoins fictifs, fixé à 100 %. Chaque groupe était composé de huit rats. L’astérisque indique une différence significative entre les groupes avec une valeur p inférieure à 0,05.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures sans compter l’intervalle entre la chirurgie d’infarctus du myocarde et le prélèvement de tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire un infarctus du myocarde chez un rat et de mesurer l’activité de la caspase-3 dans l’amygdale du rat à l’aide de la spectrofluorométrie.