Activité caspase-3 dans l'amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale de rat après un infarctus du myocarde à l'aide de la spectrofluorométrie. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences comportementales, telles que les conséquences d'un infarctus du myocarde sur les performances cognitives, la santé mentale, le processus de vieillissement et le sommeil. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est simple, rapide et fiable.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveraient des difficultés car elle exige une habileté chirurgicale et pour le prélèvement tissulaire. La procédure sera démontrée par Kim Gilbert, une assistante de recherche dans notre laboratoire. Après avoir induit l'anesthésie selon les protocoles institutionnels approuvés, confirmez une anesthésie adéquate par l'absence du réflexe de pincement de la patte.

Intuber le rat avec un tube endotrachéal et placer l'animal en position décubitus ventral sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Connecter le tube endotrachéal à un appareil d'anesthésie délivrant 2 % d'isoflurane. Ensuite, préparer le site chirurgical avec du chlorhexidine gluconate et de l'alcool isopropylique.

Et appliquer un onguent ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement. Placer un champ stérile sur l'animal afin de créer un champ stérile autour du site chirurgical. Et disposer les instruments chirurgicaux stériles nécessaires sur un autre champ stérile à côté de l'animal.

Ensuite, incisez la peau avec une lame de scalpel n°10 ou des ciseaux. Utilisez des ciseaux ou une pince hémostatique pour détacher le tissu musculaire. Puis, utilisez des ciseaux ou une pince hémostatique pour ouvrir la paroi thoracique, positionner le rétracteur thoracique et ouvrir le péricarde à l’aide de la pince hémostatique.

Pour induire une occlusion coronaire, passez d'abord un fil de soie 4-0 de 360 millimètres de long autour de l'artère coronaire descendante et à travers le tissu myocardique contigu. Insérez les deux extrémités du fil de soie dans un tube en plastique de 14 gauge et de 1,25 centimètre de long. Tirez sur les deux extrémités du fil de soie et faites glisser le tube vers le bas contre l'artère pour l'occlure.

Fixer l'occlusion en pinçant le tube en plastique avec une pince hémostatique et maintenir l'occlusion pendant 40 minutes. Après 40 minutes, relâcher l'occlusion en retirant la pince hémostatique, puis le tube souple et le fil de soie. Fermer le thorax avec deux points de suture zéro et insérer un cathéter souple à travers la cavité thoracique, puis extraire l'air du thorax à l’aide d’une seringue de 10 millilitres afin de prévenir un pneumothorax.

Refermer le muscle avec un fil de soie 4-0 et la peau avec un fil de soie 3-0. Avant de fermer le dernier point de suture cutané, aspirer à nouveau l'air de la cavité thoracique à l'aide de la seringue de 10 millilitres et du cathéter. Terminer la fermeture de la peau, puis arrêter l'isoflurane.

Placer le rat dans une cage propre et surveiller son réveil de l'anesthésie. Administrer une analgésie avec des doses répétées toutes les huit heures. Après avoir décapité l'animal de manière euthanasique selon les procédures approuvées, placer la tête du rat sur une boîte de Pétri posée sur de la glace pilée.

Utilisez des ciseaux pour ouvrir le crâne. Ensuite, utilisez un rongeur pour détacher les lames osseuses sans mutiler le tissu sous-jacent en tirant vers le haut. Puis, placez le bord plat d'une spatule entre la base du crâne et la surface ventrale postérieure du cerveau et détachez le cerveau du crâne en poussant doucement la lame vers l'avant, soulevant ainsi le cerveau hors du crâne.

Placer le cerveau sur sa surface dorsale. Identifier l'hypothalamus situé devant le cervelet et sectionner le cerveau dans le plan coronal juste devant l'extrémité postérieure de l'hypothalamus, puis également derrière l'extrémité antérieure. Identifier l'amygdale bilatérale comme deux petites sphères situées sous les lobes temporaux, juste à côté de l'hypothalamus.

Ensuite, retourner le cerveau à plat sur son extrémit&201; frontale, la surface dorsale orientée vers l'expérimentateur. Puis, séparer les hémisph&232;res et retirer le cortex de l'amygdale continue. Une fois l'amygdale dégagée, la découper à l'aide d'un scalpel.

Couper le long de la suture sombre qui traverse l'amygdale afin de séparer les parties basolatérale et centromédiale, puis placer les deux parties dans des tubes étiquetés distincts placés sur de la glace. Cette étape doit être effectuée aussi rapidement que possible afin d'éviter la dégradation des enzymes. Après avoir répété la procédure de dissection avec l'autre hémisphère, plonger les quatre flacons dans l'azote liquide pendant une minute, puis les conserver dans un congélateur à -80 degrés Celsius.

Commencez par ajouter 150 microlitres de tampon de lyse à chaque échantillon de cinq à 10 milligrammes sur de la glace. Soniquez chaque échantillon sur de la glace à intensité maximale pendant cinq secondes. Incubez ensuite sur de la glace pendant 30 minutes.

Pendant l'incubation, vortexer l'échantillon pendant cinq secondes toutes les cinq minutes. Ensuite, effectuer trois cycles de congélation-décongélation en plaçant les échantillons alternativement dans de l'azote liquide et sur une plaque chauffante thermostatée à 37 degrés Celsius. Après le dernier cycle de congélation-décongélation, centrifuger les échantillons de tissu à 1300 Gs à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un tube neuf placé sur de la glace. Après avoir quantifié les protéines conformément aux instructions du protocole écrit, ajoutez 25 microgrammes de protéine dans un tube de réaction contenant 0,8 microlitre de Ac-DEVD-AMC 10 millimolaire et du tampon de réaction, pour un volume final de 200 microlitres. Pour les échantillons de réaction négative, mélangez 25 microgrammes de protéine avec un microlitre de Ac-DEVD-CHO 800 micromolaire et 0,8 microlitre de Ac-DEVD-AMC 10 millimolaire.

Incuber tous les échantillons et témoins à l’obscurité pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Une fois le temps d'incubation écoulé, arrêter la réaction par l'ajout de 600 microlitres de glycine 0,4 molaire et d'hydroxyde de sodium 0,4 molaire à pH 10 à chaque échantillon et témoin. Ajouter deux millilitres d’eau distillée à chaque réaction dans une cuvette en verre.

Quantifier la fluorescence par spectrofluorométrie. Lire les témoins et les échantillons pendant 10 secondes avec une mesure chaque seconde. Enfin, quantifier l'activité spécifique dans chaque échantillon selon la formule maintenant affichée à l'écran.

Cet histogramme montre l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale de rats ayant subi un infarctus du myocarde. Les données sont exprimées en pourcentage de l'activité moyenne observée chez les témoins sham, fixée à 100 %. Chaque groupe comprenait huit rats. L'astérisque indique une différence significative entre les groupes, avec une valeur p inférieure à 0,05.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures, hors l'intervalle entre la chirurgie d'infarctus du myocarde et le prélèvement tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'induire un infarctus du myocarde chez le rat et de mesurer l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale du rat à l'aide de la spectrofluorométrie.