Name: Activité caspase-3 dans lamygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez la mesure de l'activité caspase-3 dans l'amygdale du rat par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde. Cette méthode permet d'étudier l'apoptose neuronale et ses conséquences comportementales.

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. Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherches en génie du Canada Kim Gilbert sciences naturelles et en détient une bourse de Fonds de recherche du Québec - Santé.

Les animaux sont traités en conformité avec la réglementation du Comité de protection des animaux locale, en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Les rats sont logés individuellement dans des conditions constantes (température de 21-22 ° C et une humidité de 40-50%), y compris un cycle de lumière-obscurité de 12 heures, à partir de 08h00. Pastilles Chow et l&#39;eau du robinet sont disponibles ad libitum pendant toute l&#39;étude. Une période d&#39;acclimatation de 3 jours après la livraison par le fournisseur est autorisé avant l&#39;expérience. Des rats Sprague-Dawley pesant entre 300-800 g ont été systématiquement utilisés avec ce protocole. 1. Chirurgie MI <ol><li> Induire une anesthésie avec des injections intra-péritonéales de kétamine 60 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg. Confirmez anesthésie appropriée par l&#39;absence de réflexe lorsque les pattes sont pincés. </li><li> Rasez site chirurgical. Intuber rat avec un tube d&#39;intubation: le cathéter (16G 1,77 pouces) et placez animal en position de décubitus latéral. Placez les animaux sur un coussin chauffant pour maintenir la température autour de 37 ° C. Connectez le tube d&#39;intubation à l&#39;isoflurane 2%. </li><li> Préparer site chirurgical avec le gluconate de chlorhexidine et de l&#39;alcool isopropylique. Pendant l&#39;opération, utiliser des gants stériles et des instruments stérilisés. Appliquer une pommade ophtalmique à deux yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Mettez champ stérile sur animaux et les instruments sur un autre champ stérile à côté de l&#39;animal. </li><li> Inciser la peau avec une lame de bistouri n ° 10. Décoller le tissu musculaire avec une pince hémostatique. Placez l&#39;animal en décubitus ventral. Ouvrir paroi thoracique avec une pince et la position hémostatique poitrine écarteur. Ouvrir le péricarde avec une pince hémostatique. </li><li> Pour produire une occlusion coronarienne, une boucle 360 ​​mm de long autour de suture en soie 4-0 de l&#39;artère coronaire descendante, en passant par le tissu myocardique contiguë. Insérer les deux extrémités de la suture de soie dans un 14G, long tube de plastique de 1,25 cm. </li><li> Tirer les deux extrémités du fil de suture en soie et push le tube vers le bas contre l&#39;artère pour boucher ce, pendant 40 min. Occlusion sécurisé par serrage du tube en plastique avec une pince hémostatique. </li><li> Après 40 min, libérer l&#39;occlusion en libérant la pince hémostatique, puis en enlevant le tuyau et la soie suture flexible. Remarque: Les rats témoins Sham subissent le même mode opératoire chirurgical moins l&#39;occlusion de l&#39;artère coronaire. </li><li> Avant la fermeture de la paroi thoracique, placer un cathéter souple (18G, 4,5 cm) à travers la cavité thoracique pour aspirer l&#39;air sur le thorax avec une seringue de 5 ml pour empêcher un pneumothorax. </li><li> Fermer cavité thoracique avec 2-0 suture, point le muscle avec 4-0 suture de soie et de la peau avec une suture de soie 3-0. </li><li> Avant de fermer le dernier point de la peau, tirer à nouveau l&#39;air du thorax avec 5 ml seringue à travers le cathéter placé précédemment dans la cavité thoracique. </li><li> Suturer dernier point de la peau. Arrêtez la ventilation isoflurane. </li><li> Surveiller l&#39;éveil de rat. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait regained conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. </li><li> Traiter chaque rat 8 h pendant 24 heures avec un analgésique (buprénorphine, 0,05 mg / kg ip) et avec un antibiotique (une dose unique de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Après la chirurgie, les rats de maison individuelle jusqu&#39;au moment du sacrifice, soit 3 jours post-IM. </li><li> Taille de l&#39;infarctus, essentiellement la nécrose, est exprimé comme la proportion de tissu infarci dans la zone à risque du ventricule gauche. Cela peut coloration mesurée en utilisant 11 triphényltétrazolium. </li></ol> 2. Isolement amygdale <ol><li> Placer la première tête d&#39;animal dans un sac en forme de cône, avec son nez faisant saillie hors de l&#39;ouverture d&#39;extrémité étroite. Rat sécurisé pour éviter tout mouvement. Placez la tête de manière appropriée sur la guillotine, entre les lames de ciseaux. Décapitez animal. </li><li> Lieu la tête du rat dans un plat maintenu sur de la glace pilée. Effectuez toutes les procédures pour l&#39;isolement de tissu sur de la glace pilée (4 ° C). </li><li> Sk ouverte CouperULL avec des ciseaux, détacher soigneusement gaines osseuses avec rongeurs d&#39;os en tirant et en évitant mutiler le tissu en dessous. </li><li> Placer la lame plate d&#39;une spatule entre le fond de la boîte crânienne et la surface ventrale postérieure du cerveau et soigneusement détacher cerveau de crâne par doucement pousser la lame vers l&#39;avant le long du fond de la boîte crânienne jusqu&#39;à ce que le cerveau peut être lentement soulevé vers le haut hors de la crâne. Jeter le crâne. </li><li> Placer cerveau sur sa face dorsale. Identifier hypothalamus (structure avant du cervelet) et couper le cerveau coronaire devant son extrémité antérieure et derrière son extrémité postérieure; jetez les parties antérieure et postérieure du cerveau si non nécessaire pour d&#39;autres usages. </li><li> Visualisez les amygdalas que de petites sphères sous les lobes temporaux, bilatéralement, juste à côté de l&#39;hypothalamus. </li><li> Retournez le plat du cerveau sur son extrémité frontale, surface dorsale loin de l&#39;expérimentateur. </li><li> Commencez par le côté gauche ou droit du cerveau. Séparer l&#39;hémisphères et puis le cortex de l&#39;amygdale contigus. Couper façon d&#39;environ 8 mm de ce cortex lâche pour permettre l&#39;isolement de l&#39;amygdale. Coupez amygdale avec scalpel. </li><li> Isoler la partie basolatéral de l&#39;amygdale de sa partie centromedial en coupant le long de la suture sombre qui se retrouve à travers elle, presque moitié-moitié. Cette structure ne sont pas toujours facilement identifiable. </li><li> Mettez sous-parties de l&#39;amygdale dans des fioles distinctes identifiées et de garder sur la glace pilée. </li><li> Procédure de dissection Répétez avec l&#39;autre hémisphère. </li><li> Immerger les flacons dans l&#39;azote liquide pendant 1 minute. Conserver le flacon dans -80 ° C congélateur jusqu&#39;à nécessaire. </li></ol> 3. activité caspase-3 <ol><li> Préparer du tampon de lyse avec 0,32 M de saccharose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique, 2 mM de dithiothréitol, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 10 ug / ul de leupeptine , 10 ug / ul de la pepstatine A et de 10 pg / pl d&#39;aprotinine. </li><li>Ajouter 150 ul de tampon de lyse à chaque échantillon (5-10 mg). Garder sur la glace. Soniquer chaque échantillon sur la glace pendant 5 secondes à intensité maximale (40 W). Incuber les tissus dans du tampon de lyse sur de la glace pendant 30 min. Vortexer chaque échantillon pendant 5 min. </li><li> Effectuez 3 cycles de gel / dégel en plaçant des échantillons alternativement dans l&#39;azote liquide et sur une plaque de chauffage thermostaté réglé à 37 ° C. Tissu Centrifugeuse à 13000 g (4 ° C) pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant et de garder dans le tube sur la glace. </li><li> Préparer des concentrations de protéine standards entre 0 et 10 ug / ml avec de l&#39;albumine de sérum bovin. Préparer blancs avec tampon seulement. </li><li> Ajouter 200 pi de réactif de Bradford à chaque norme. Lire standard à 595 nm. Pour des niveaux de protéines, ajouter 5 pl d&#39;échantillon surnageant à 795 ul d&#39;eau distillée et 200 ul de réactif de Bradford. Lire chaque échantillon à 595 nm et de quantifier les protéines avec courbe standard. </li><li> Préparer du tampon de réaction avec 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM d&#39;éthylène glycol de l&#39;acide tétra-acétique, 0,1% de 3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate et 1 mM de dithiothréitol. </li><li> Ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et la caspase-3 pour obtenir des échantillons de substrats réactifs positifs et négatifs. Pour les échantillons négatifs, ajouter un tampon de réaction, 25 pg de protéines, 0,4 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM et 0,8 pi d&#39;Ac-DEVD-AMC 10 mM. Pour les échantillons positifs, ajouter 25 pg de protéine de tampon de réaction et 0,8 ul d&#39;Ac-DEVD-AMC 10 mM. Traiter tous les échantillons négatifs et positifs en trois exemplaires. Compléter le volume final de chaque échantillon jusqu&#39;à 200 pi en ajoutant un tampon de réaction. </li><li> Produire des témoins négatifs en ajoutant 188,7 pi de tampon de réaction de 0,5 pi de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse. Pour les témoins positifs, ajouter 189,2 pi de tampon de réaction, 0,8 pi d&#39;Ac-DEVD-AMC 10 mM et 10 pi de tampon de lyse. </li><li> Incuber les échantillons etcontrôles dans l&#39;obscurité pendant 3 heures à 37 o C. </li><li> Arrêter la réaction avec 600 ul de glycine 0,4 M et de NaOH 0,4 M (pH 10) à chaque échantillon et de contrôle. </li><li> Quantifier la fluorescence par spectrofluorométrie au excitation longueur d&#39;onde de 365 nm de longueur d&#39;onde et l&#39;émission de 465 nm. Ajouter 2 ml d&#39;eau distillée à une réaction dans la cuve de verre. Lire contrôles et les échantillons pendant 10 secondes avec 1 point à chaque sec. </li><li> Quantifier l&#39;activité spécifique dans chaque échantillon: ((fluorescence des échantillons négatifs moins de fluorescence d&#39;échantillons positifs) x volume de 2,8 ml) divisé par (le temps d&#39;incubation de 3 heures x quantité de protéine 25 mg). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Notre expérience avec ce protocole au cours des 10 dernières années a conduit à l&#39;identification des questions méthodologiques critiques. Tout d&#39;abord, la dissection rapide du cerveau dans une boîte de Pétri sur de la glace pilée est important de maintenir la qualité de la préparation. Deuxièmement, il faut être conscient que la sonication de tissu est plus court pour l&#39;amygdale cérébrale par rapport à d&#39;autres types de tissus, comme le cœur (10 sec) ou les reins (20 sec). Troisièmement, un grand soin doit être pris pour mélanger soigneusement le substrat avant de l&#39;ajouter aux échantillons. Nous avons rencontré des signaux variables lorsque la séquence de mélange était inadéquate. Quatrièmement, pas de bulles doivent être présents dans la cellule en quartz lors de la lecture des échantillons. Dans le cas contraire, le signal pourrait être modifiée. Nous avons fait un changement au cours des dernières années pour accroître la reproductibilité des résultats: l&#39;augmentation du volume de substrat pour éviter volume inférieur à 1 pl. Cependant, de petites variations peuvent se produire entre les essais successifs, et au moins 3 échantillons de contrôle doivent être utilisées pourle contrôle des variations. Mesures de fluorescence de ces contrôles sont en moyenne et la moyenne est fixée à 100%. Des mesures de fluorescence dans les échantillons expérimentaux sont transformées en pour cent des échantillons de contrôle. Une autre limite de cette technique est que seule une partie de tissu est utilisé et, par conséquent, l&#39;activité caspase-3 pourrait être sous-estimée. En effet, la fenêtre de temps de l&#39;apoptose est courte dans une cellule donnée et peut être manquée, même si elle se produit dans des zones voisines au moment de l&#39;échantillonnage 1,4,15. L&#39;inverse est également possible: l&#39;apoptose pourrait être particulièrement intense dans les parties de tissus, ce qui entraîne une surestimation de l&#39;activité caspase-3. Nous recommandons l&#39;utilisation de tissus restants (amygdale) pour des techniques complémentaires, tels que des essais TUNEL ou rapport Bax / Bcl-2 (voir Introduction). Spectrofluorométrie a au moins deux avantages sur Western blot. Tout d&#39;abord, il génère directement des données quantitatives. Deuxièmement, il mesure une enzymatiquectivité elle-même plutôt que la protéine ou l&#39;ARN expression, qui peut être sans rapport, et il est connu que l&#39;expression de protéine peut être accrue sans modification de l&#39;activité enzymatique. En outre, spectrofluorimétrie peut être effectuée sur d&#39;autres tissus ou d&#39;espèces différentes et peut être ajusté à d&#39;autres sous-types de caspases, avec différents substrats, de sorte que la comparaison peut être effectuée sans danger. En conclusion, ce document démontre l&#39;utilisation de spectrofluorométrie pour mesurer activité caspase-3 dans l&#39;amygdale, fournissant la preuve que l&#39;apoptose se produit dans cette région du système limbique 3 jours après un IM.

Caspases ou protéases aspartate-dirigé cystéine dépendante sont une famille d&#39;enzymes qui sont impliqués dans divers homéostasie processess 1. Caspases peuvent être classés en fonction de leurs rôles dans l&#39;apoptose ou une inflammation. Caspase-1, -4, -5 et -12 sont impliqués dans l&#39;inflammation alors que ceux qui sont engagés dans l&#39;apoptose peut être classé en tant que sous-caspases initiatrices (caspase-8 et -9) et les caspases effectrices (caspase-3, -6 et -7 ). Caspases jouent un rôle important dans de nombreuses pathologies, principalement dans les troubles où l&#39;apoptose peut être excessive, comme observé après un infarctus du myocarde (IM) ou l&#39;ischémie cérébrale. Dans le modèle de rat de syndrome post-MI utilisé dans notre laboratoire, il est établi que la caspase-3 est activé non seulement dans le myocarde, mais aussi deux dans le système limbique qui est impliquée dans la régulation de l&#39;humeur et les émotions 3-6. On voit également que la caspase-3 est activé dans différentes régionsdu système limbique, comme l&#39;amygdale et l&#39;hippocampe, et cette activation pics près de 3 jours après l&#39;agression ischémique 4. Fait intéressant, activité caspase-3 est en corrélation avec post-IM troubles de comportement, et de son atténuation par des interventions pharmacologiques et nutritionnelles réduit ces blessures, ce qui suggère un lien possible entre la caspase-3 et la dépression post-MI 7-12. Caspase-3 activation peut être mesurée par diverses techniques. Western blot détermine les propriétés enzymatiques des caspases et peut détecter des enzymes actives, ainsi que leurs formes pro-enzyme. Western blot, cependant, est semi-quantitatif, et de petites variations peuvent être perdues par signal-bruit faibles ratios 13. Une meilleure technique est basée sur le clivage d&#39;un substrat (DEVD-AMC) par la caspase-3 qui libère un composé fluorogène et peut être mesurée par spectrofluorimétrie. Caspase-3 activation est un marqueur fiable de l&#39;apoptose. Mesure de l&#39;apoptose can instable parce que la fenêtre de temps d&#39;apparition est courte, et les cellules voisines pourraient phagocyter des corps apoptotiques ou des cellules 14. L&#39;apoptose peut être confirmé par d&#39;autres techniques, telles que la désoxynucléotidyl transferase dUTP nick étiquetage d&#39;extrémité (TUNEL) dosage Terminal, qui détecte la fragmentation de l&#39;ADN résultant de cascades apoptotiques de signalisation 6, ou le rapport des protéines pro / anti-apoptotiques tels que Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectrofluromètre</td><td>Instrument à technologie photonique (maintenant Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>avec DeltaRAM&nbsp ; Monochromateur à accès aléatoire</td></tr><tr><td>Respirateur</td><td>Appareil Harvard</td><td>683</td><td>Ventilation pour petits animaux</td></tr><tr><td>Cuvette en verre</td><td>Cellules de précision NSG</td><td>3G10</td><td>Optique Verre (340-2 500 nm) Trajet de 10 mm</td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Cole Parmer</td><td>Série 4710</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

activité caspase-3 dans l&#39;amygdale rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

L&#39;infarctus du myocarde (MI) a moyen et long terme des conséquences dramatiques aux niveaux physiologiques et comportementaux, mais les mécanismes impliqués sont encore peu claires. Notre laboratoire a développé un modèle de rat de syndrome post-MI qui affiche les fonctions cardiaques douteux, la perte neuronale dans le système limbique, des déficits cognitifs et comportementaux de dépression signes. Au niveau neuronal, la caspase-3 activation médiateur post-MI apoptose dans différentes régions limbiques, comme l&#39;amygdale - culminant à 3 jours post-IM. Troubles cognitifs et comportementaux apparaissent 2-3 semaines post-IM et ceux-ci sont corrélés statistiquement avec des mesures d&#39;activité caspase-3. Le protocole décrit ici est utilisé pour induire MI, prélever des tissus de l&#39;amygdale et mesurer activité caspase-3 utilisant spectrofluorométrie. Pour induire MI, l&#39;artère coronaire est obstruée décroissant pendant 40 min. Le protocole d&#39;évaluation de la caspase-3 activation commence après 3 jours MI: les rats sont sacrifiés et l&#39;amygdale rapi isolédLY du cerveau. Les échantillons sont rapidement congelés dans de l&#39;azote liquide et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse proprement dite. La technique réalisées pour évaluer l&#39;activation de la caspase-3 est basé sur le clivage d&#39;un substrat (DEVD-AMC) par la caspase-3, ce qui libère un composé fluorogène qui peut être mesurée par spectrofluorimétrie. La méthode est quantitative et reproductible mais l&#39;équipement nécessaire est coûteux et la procédure de quantification des échantillons prend beaucoup de temps. Cette technique peut être appliquée à d&#39;autres tissus, tels que le cœur et les reins. DEVD-AMC peut être remplacé par d&#39;autres substrats pour mesurer l&#39;activité d&#39;autres caspases.

L&#39;amygdale a été isolé dans 8 imposture (contrôle) et 8 MI rats trois jours après l&#39;induction du protocole ischémie / reperfusion. Activité caspase-3 a été mesurée dans ce tissu au moyen d&#39;un fluorochrome qui peut être clivée par la caspase-3 active et détectée par spectrofluorimétrie. Des mesures positives et négatives (voir les étapes 3.11, 3.12 et 3.16) ont été effectuées en triple exemplaire et mesurés pendant 10 sec, avec 1 point à chaque sec. Les différences entre les témoins positifs et négatifs ont été calculées et la moyenne des différences pour tous les tissus factice exécuté lors de cette expérience a été fixé à 100%. Les résultats de rats ont été mis à l&#39;échelle MI selon cette référence et La Figure 1 illustre les résultats définitifs: il indique une activité significativement plus élevée chez le rat par rapport à MI fictive (p &lt;0,05). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figure 1. Caspase-3activité dans l&#39;amygdale des rats MI, exprimée en pourcentage de l&#39;activité moyenne dans les contrôles de Sham, réglé à 100% (8 rats par groupe). * Indique importante différence entre groupe (p &lt;0,05). Les données sont exprimées en moyenne ± SEM.

L’infarctus du myocarde (IM) est non seulement suivi d’une altération de la fonction cardiaque, mais aussi d’une apoptose de l’amygdale, une région du cerveau impliquée dans les conséquences comportementales de l’IM. Ce protocole décrit comment induire l’IM, collecter le tissu amygdale et mesurer l’activité de la caspase-3, un marqueur de l’apoptose.

Activité caspase-3 dans l&#39;amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale de rat après un infarctus du myocarde à l'aide de la spectrofluorométrie. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences comportementales, telles que les conséquences d'un infarctus du myocarde sur les performances cognitives, la santé mentale, le processus de vieillissement et le sommeil. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est simple, rapide et fiable.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveraient des difficultés car elle exige une habileté chirurgicale et pour le prélèvement tissulaire. La procédure sera démontrée par Kim Gilbert, une assistante de recherche dans notre laboratoire. Après avoir induit l'anesthésie selon les protocoles institutionnels approuvés, confirmez une anesthésie adéquate par l'absence du réflexe de pincement de la patte.Intuber le rat avec un tube endotrachéal et placer l'animal en position décubitus ventral sur un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle à 37 degrés Celsius. Connecter le tube endotrachéal à un appareil d'anesthésie délivrant 2 % d'isoflurane. Ensuite, préparer le site chirurgical avec du chlorhexidine gluconate et de l'alcool isopropylique.Et appliquer un onguent ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement. Placer un champ stérile sur l'animal afin de créer un champ stérile autour du site chirurgical. Et disposer les instruments chirurgicaux stériles nécessaires sur un autre champ stérile à côté de l'animal.Ensuite, incisez la peau avec une lame de scalpel n°10 ou des ciseaux. Utilisez des ciseaux ou une pince hémostatique pour détacher le tissu musculaire. Puis, utilisez des ciseaux ou une pince hémostatique pour ouvrir la paroi thoracique, positionner le rétracteur thoracique et ouvrir le péricarde à l’aide de la pince hémostatique.Pour induire une occlusion coronaire, passez d'abord un fil de soie 4-0 de 360 millimètres de long autour de l'artère coronaire descendante et à travers le tissu myocardique contigu. Insérez les deux extrémités du fil de soie dans un tube en plastique de 14 gauge et de 1,25 centimètre de long. Tirez sur les deux extrémités du fil de soie et faites glisser le tube vers le bas contre l'artère pour l'occlure.Fixer l'occlusion en pinçant le tube en plastique avec une pince hémostatique et maintenir l'occlusion pendant 40 minutes. Après 40 minutes, relâcher l'occlusion en retirant la pince hémostatique, puis le tube souple et le fil de soie. Fermer le thorax avec deux points de suture zéro et insérer un cathéter souple à travers la cavité thoracique, puis extraire l'air du thorax à l’aide d’une seringue de 10 millilitres afin de prévenir un pneumothorax.Refermer le muscle avec un fil de soie 4-0 et la peau avec un fil de soie 3-0. Avant de fermer le dernier point de suture cutané, aspirer à nouveau l'air de la cavité thoracique à l'aide de la seringue de 10 millilitres et du cathéter. Terminer la fermeture de la peau, puis arrêter l'isoflurane.Placer le rat dans une cage propre et surveiller son réveil de l'anesthésie. Administrer une analgésie avec des doses répétées toutes les huit heures. Après avoir décapité l'animal de manière euthanasique selon les procédures approuvées, placer la tête du rat sur une boîte de Pétri posée sur de la glace pilée.Utilisez des ciseaux pour ouvrir le crâne. Ensuite, utilisez un rongeur pour détacher les lames osseuses sans mutiler le tissu sous-jacent en tirant vers le haut. Puis, placez le bord plat d'une spatule entre la base du crâne et la surface ventrale postérieure du cerveau et détachez le cerveau du crâne en poussant doucement la lame vers l'avant, soulevant ainsi le cerveau hors du crâne.Placer le cerveau sur sa surface dorsale. Identifier l'hypothalamus situé devant le cervelet et sectionner le cerveau dans le plan coronal juste devant l'extrémité postérieure de l'hypothalamus, puis également derrière l'extrémité antérieure. Identifier l'amygdale bilatérale comme deux petites sphères situées sous les lobes temporaux, juste à côté de l'hypothalamus.Ensuite, retourner le cerveau à plat sur son extrémit&201; frontale, la surface dorsale orient&eacute;e vers l'exp&eacute;rimentateur. Puis, s&eacute;parer les h&eacute;misph&232;res et retirer le cortex de l'amygdale continue. Une fois l'amygdale d&eacute;gag&eacute;e, la d&eacute;couper &agrave; l'aide d'un scalpel.Couper le long de la suture sombre qui traverse l'amygdale afin de séparer les parties basolatérale et centromédiale, puis placer les deux parties dans des tubes étiquetés distincts placés sur de la glace. Cette étape doit être effectuée aussi rapidement que possible afin d'éviter la dégradation des enzymes. Après avoir répété la procédure de dissection avec l'autre hémisphère, plonger les quatre flacons dans l'azote liquide pendant une minute, puis les conserver dans un congélateur à -80 degrés Celsius.Commencez par ajouter 150 microlitres de tampon de lyse à chaque échantillon de cinq à 10 milligrammes sur de la glace. Soniquez chaque échantillon sur de la glace à intensité maximale pendant cinq secondes. Incubez ensuite sur de la glace pendant 30 minutes.Pendant l'incubation, vortexer l'échantillon pendant cinq secondes toutes les cinq minutes. Ensuite, effectuer trois cycles de congélation-décongélation en plaçant les échantillons alternativement dans de l'azote liquide et sur une plaque chauffante thermostatée à 37 degrés Celsius. Après le dernier cycle de congélation-décongélation, centrifuger les échantillons de tissu à 1300 Gs à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un tube neuf placé sur de la glace. Après avoir quantifié les protéines conformément aux instructions du protocole écrit, ajoutez 25 microgrammes de protéine dans un tube de réaction contenant 0,8 microlitre de Ac-DEVD-AMC 10 millimolaire et du tampon de réaction, pour un volume final de 200 microlitres. Pour les échantillons de réaction négative, mélangez 25 microgrammes de protéine avec un microlitre de Ac-DEVD-CHO 800 micromolaire et 0,8 microlitre de Ac-DEVD-AMC 10 millimolaire.Incuber tous les échantillons et témoins à l’obscurité pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Une fois le temps d'incubation écoulé, arrêter la réaction par l'ajout de 600 microlitres de glycine 0,4 molaire et d'hydroxyde de sodium 0,4 molaire à pH 10 à chaque échantillon et témoin. Ajouter deux millilitres d’eau distillée à chaque réaction dans une cuvette en verre.Quantifier la fluorescence par spectrofluorométrie. Lire les témoins et les échantillons pendant 10 secondes avec une mesure chaque seconde. Enfin, quantifier l'activité spécifique dans chaque échantillon selon la formule maintenant affichée à l'écran.Cet histogramme montre l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale de rats ayant subi un infarctus du myocarde. Les données sont exprimées en pourcentage de l'activité moyenne observée chez les témoins sham, fixée à 100 %. Chaque groupe comprenait huit rats. L'astérisque indique une différence significative entre les groupes, avec une valeur p inférieure à 0,05.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures, hors l'intervalle entre la chirurgie d'infarctus du myocarde et le prélèvement tissulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'induire un infarctus du myocarde chez le rat et de mesurer l'activité de la caspase-3 dans l'amygdale du rat à l'aide de la spectrofluorométrie.

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