Microperfusion Technique chargé d'enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

L'objectif général de l'expérience suivante est de permettre des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l'eau des parois des microvaisseaux urulaires dans le mésentère du rat dans des conditions expérimentales contrôlées. Ceci est réalisé en canulant les microvaisseaux urulaires afin de régler les pressions oncotique et hydrostatique dans la lumière et de permettre un contrôle précis de la composition chimique du fluide de perfusion et du milieu interstitiel. Ensuite, le vaisseau est occlus, et les globules rouges en suspension dans le fluide de perfusion, qui servent de marqueurs de débit, peuvent être observés en mouvement dans la lumière comme indicateurs d'échange transvasculaire de liquide.

Ensuite, la position et la vitesse des globules rouges marqués sont enregistrées soit vers le site d'occlusion, soit en s'éloignant du site d'occlusion. Enfin, l'occlusion est relâchée et répétée pour des mesures supplémentaires, ou le vaisseau est recanalisé. Le vaisseau est alors canulé à nouveau et les mesures sont répétées dans des conditions modifiées.

En fin de compte, des mesures appariées de conductivité hydraulique dans des conditions de contrôle et de test peuvent être effectuées afin de permettre l'investigation la plus directe des facteurs régulant la perméabilité des microvaisseaux. Un avantage de la technique de Landis modifiée pour étudier la régulation de la perméabilité capillaire réside dans l'étape de perfusion. La microperfusion permet de mesurer la perméabilité de la paroi des microvaisseaux dans des conditions où la composition du liquide de perfusion, la surface d'échange et la pression dans les microvaisseaux sont toutes contrôlées directement.

Cette méthode permet d'aborder des questions relatives aux mécanismes cellulaires et moléculaires de la régulation de la perméabilité dans les microvaisseaux, qui sont représentatifs d'organes intacts, et elle offre la possibilité de comparer ces résultats à ceux obtenus à partir de monocouches endothéliales en culture, souvent utilisées pour étudier en détail les mécanismes moléculaires. Notre protocole est démontré par Joyce Clark, notre responsable de laboratoire. Joyce a été à l'origine de nombreuses améliorations apportées à ce protocole au cours de son mandat en tant que responsable de laboratoire.

Pour commencer, utilisez un tireur électronique pour façonner plusieurs tubes capillaires en verre borosilicaté en pointes effilées, chacune ayant une longueur d'extrémité d'environ un centimètre, à l'aide d'une meule entraînée par air comprimé et d'un papier abrasif de 0,5 micron imbibé d'eau, ainsi que d'un support de micropipette réglé à un angle de 30 degrés par rapport au biseau horizontal, les micropipettes. Après avoir lavé et séché les micropipettes conformément au protocole décrit, sélectionnez celles dont l'ouverture mesure environ 50 microns de long et dont le rapport entre la longueur et la largeur du biseau se situe entre 3,1 et 3,5. Elles doivent également présenter une pointe fortement effilée, ce qui facilite la pénétration des fibres de collagène résistantes dans le mésentère.

Pour fabriquer des rétrécisseurs, faites brièvement tenir une capillaire en verre tirée non biseautée près d'une microflamme afin de former une extrémité émoussée. Répétez l'opération pour produire plusieurs rétrécisseurs et rangez-les dans une boîte sans poussière. Ensuite, fabriquez des micro-obturateurs en maintenant un tube capillaire tiré non biseauté en oblique sous une microflamme, puis utilisez un adaptateur de tube ou une micropipette cassée pour courber doucement le tube d’environ quatre millimètres de l’extrémité, selon un angle proche de 120 degrés.

En ce qui concerne la tige, il est important que la pointe ne soit ni scellée à la flamme ni cassée. Après avoir anesthésié un rat et disposé le tissu mésentérique et l'intestin conformément au protocole décrit, placer le plateau de l'animal sur la platine du microscope de manière à ce que le mésentère soit visible à travers les oculaires. Positionner une perfusion par gravité de solution de Ringer pour mammifères afin d'assurer une superfusion continue.

Le mésentère utilise ensuite des compresses de gaze pour maintenir l'intestin en place, aider à conserver l'humidité et absorber l'excès de liquide de Ringer à la surface ; ajustez le débit et aspirez l'effluent afin de maintenir une couche constante de suse huit, identifiez les microvaisseaux cibles flar, qui sont des segments non ramifiés en aval d'un flux convergent et situés à une ou deux branches en aval des vrais capillaires. Recherchez un vaisseau non ramifié présentant un débit sanguin rapide et dépourvu d'adhérence de cellules blanches sur la paroi du vaisseau. Placez les microvaisseaux à tester au centre du champ du microscope et positionnez le stabilisateur près du site de canulation choisi.

Pour remplir la micropipette, aspirez le milieu de perfusion et transférez huit globules rouges dans une seringue préparée conformément au protocole décrit, en veillant à ce qu'il n'y ait aucune bulle dans le tube. Introduisez le tube dans l'extrémité large de la micropipette jusqu'à ce qu'il bute contre la zone conique. Exercez une légère poussée rapide sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette.

Un minuscule filet ou goutte apparaîtra à l'extrémité lorsque celui-ci sera plein. Lors du retrait du tube, appuyez doucement sur le piston pour remplir le fût de la micropipette. Ensuite, éliminez les petites bulles d'air présentes dans le fût en le tapotant doucement.

Placez ensuite la micropipette dans un support de pipette doté d'un orifice latéral permettant une connexion fluide continue avec un manomètre à eau. Veillez à ce que le support, fixé à un système d'entraînement hydraulique et à un micromanipulateur, soit positionné selon un léger angle horizontal afin que le bord effilé de la micropipette n'entre pas en contact avec l'intestin ou le plateau. À l'aide d'une seringue ou d'une poire en caoutchouc remplie d'eau, ajustez la pression hydrostatique exercée sur le liquide contenu dans la micropipette en modifiant la hauteur du liquide dans la colonne d'eau du manomètre, jusqu'à environ 40 centimètres d'eau au-dessus du mésentère.

Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement le dispositif de maintien sur le tissu près des microvaisseaux, en exerçant une force suffisante pour saisir le tissu, puis ramenez légèrement le dispositif de maintien vers l'arrière afin d'étirer le tissu dans l'axe des microvaisseaux, de manière à aligner les contraintes mécaniques des fibres de collagène mésentériques avec celui du vaisseau. Alignez la micropipette avec le vaisseau et abaissez-la jusqu'à ce qu'elle soit visible à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de canulation choisi et abaissez-la sur le tissu de sorte qu'elle obstrue partiellement l'écoulement dans le vaisseau, sans toutefois l'occlure.

À l’aide de l’entraînement hydraulique, canuler le vaisseau en introduisant lentement la pointe de la pipette dans la lumière du vaisseau, en prenant soin de ne pas traverser l’autre paroi du vaisseau. Lorsque la micro-pipette pénètre dans la lumière, le fluide de perfusion chassera rapidement le sang de la lumière du vaisseau et entrera dans la circulation. Réduire la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu’à ce que les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau.

Ceci détermine la pression de compensation, qui mesure la pression hydrostatique dans les microvaisseaux ou PC à l'extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir la perfusion du vaisseau au-dessus de cette pression de compensation afin d'effectuer une micro-occlusion. Placer le bloqueur au-dessus du vaisseau perfusé, près du bord inférieur du champ du microscope, à l'aide de la vidéo et de l'audio.

Enregistrer oralement l'emplacement du site de blocage tel qu'observé dans le fragment I rouge. Le site de blocage se situe à 57. Placer la pointe du bloqueur juste au-dessus du microvaisseau. Utiliser la commande fine en Z du micromanipulateur pour abaisser délicatement le bloqueur jusqu'à ce que le flux dans le vaisseau soit occlus.

Utilisez un dispositif audio pour noter la pression du manomètre. La pression est de 50. Appliquez ensuite une occlusion pendant trois à dix secondes, puis relâchez-la.

Pour rétablir une perfusion libre, déplacez le site de blocage vers l'extrémité de la pipette en progressant de cinq à dix micromètres à chaque étape, en effectuant au maximum trois à cinq occlusions à chaque emplacement afin d'éviter d'endommager la paroi du vaisseau au site de blocage. Analysez les données conformément au protocole décrit dans le texte. Ce suivi temporel mesure les variations de conductivité hydraulique ou LP. Chez un rat, des microvaisseaux urinaires ont été cannelés avec succès à l'aide de quatre perfusions.

L'ampleur de la LP à pression constante a été utilisée pour mesurer les changements dans les microvaisseaux. Perméabilité pariétale lors de la perfusion avec 1 % BSA comme témoin par rapport à 10 molaire de l'agent inflammatoire Brady Kinin ou bk. Comme indiqué ici, le bk a provoqué une augmentation transitoire de la LP qui est revenue aux niveaux témoins en 10 à 15 minutes.

Après rétablissement des niveaux de base avec 1 % BSA à 10 nanomolaire, la bradykinine (BK) a été réperfusée en même temps qu'un micromolaire de pH sens un phosphate ou S1P. Les résultats indiquent que le S1P atténue significativement la réponse à la BK. Pour certaines conceptions expérimentales, il est important d'estimer à la fois le coefficient de réflexion du soluté pour une macromolécule et le lp.

Cela est réalisé de manière optimale en mesurant JV à plusieurs pressions sur chaque vaisseau microscopique individuel. Cette expérience a permis d'estimer à la fois LP et la pression oncotique effective de l'albumine à 5 % dans le PERFUSE huit lorsqu'aucune albumine n'était présente dans les tissus entourant les vaisseaux microscopiques. JV divisé par S a été mesuré à trois pressions différentes et représenté graphiquement ici.

Le LP est la pente de la relation entre JV divisé par S et la pression, et l'intersection avec l'axe de la pression correspond à la différence effective de pression oncotique à travers la paroi du vaisseau. Combinée à d'autres techniques telles que le marquage par immunofluorescence et la microscopie confocale, ou même la microscopie électronique en transmission, la microperfusion offre une analyse puissante de l'endothélium microvasculaire et de sa fonction, en utilisant des vaisseaux dont la perméabilité est connue. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l'eau des microvaisseaux capillaires dans le mésentère de rat, dans des conditions expérimentales contrôlées.

Vous pouvez utiliser cette approche dans les modèles de rat actuellement disponibles, mais je suis particulièrement intéressé par la possibilité de son utilisation dans de nouveaux rats génétiquement modifiés qui deviendront accessibles grâce à la technologie CRISPR Cas nine, et j'espère qu'elle sera étendue de cette manière.