Name: Microperfusion Technique chargé denquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Apprenez la technique de microperfusion modifiée de Landis pour mesurer la conductivité hydraulique des microvaisseaux dans le mésentère de rat. Cette méthode permet d'évaluer la perméabilité vasculaire dans des conditions expérimentales contrôlées.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé et des subventions HL44485 HL28607.

Déclaration éthique: Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle. 1. Fabrication préliminaire de Micropipettes, retardateurs, et bloqueurs <ol><li> Tirer plusieurs tubes capillaires en verre de borosilicate propres en utilisant un extracteur moitié électronique ajustée de sorte que, lorsqu&#39;il est tiré, la partie étirée du tube est d&#39;environ 1 cm de longueur et les deux moitiés sont quelque peu symétrique. Assurez-vous que le cône est compatible avec les dimensions à la figure 1. Utilisez les deux moitiés pour micropipettes, retardateurs et les bloqueurs. <ol><li> Bevel micropipettes utilisant un air entraîné meule 30 avec 0,5 um papier abrasif baigné avec de l&#39;eau. Régler l&#39;angle du support de micropipette de sorte qu&#39;il est d&#39;environ 30 degrés par rapport à l&#39;horizontale. </li><li> Bien laver et sécher les micropipettes en utilisant aspiration pour tirer l&#39;acétone propre à travers la pointe et jusqu&#39;à l&#39;arbre. Inspectez les micropipettes (Figure 1A) à l&#39;aide d&#39;un petit microscope droit avec 4 × 40 × et objectifs équipés d&#39;un support de micropipette pince crocodile et d&#39;un réticule de l&#39;oculaire. </li><li> Sélectionnez micropipettes avec embout ouverture d&#39;environ 50 um de long avec un biseau dont le rapport longueur / largeur est entre 3,1 et 3,5 et un point fortement conique qui aide à pénétrer les fibres de collagène difficiles dans le mésentère. </li><li> Stockez 15-20 micropipettes de légèrement différentes tailles dans une boîte sans poussière. </li></ol></li><li> Assurez retardateurs utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l&#39;étape 1.1). Tenez un tube capillaire en verre tiré brièvement près d&#39;un microflamme pour former une extrémité émoussée (figure 1B). Stocker plusieurs dans une boîte sans poussière. </li><li> Assurez microoccluders utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l&#39;étape 1.1). Tenez un tube capillaire tiré sous un microflamme et doucement plier (en utilisant un adaptateur de tube, par exemple., 23G) de la pointe fine (environ 4 mm de la pointe) pour faire un angle de près de 120 degrés à l&#39;arbre ( <strong&gt; Figure 1C). Marque et stocker plusieurs. </li></ol> 2. Préparation des animaux et de chirurgie <ol><li> Anesthetize mâle (350-450 g) ou des rats femelles Sprague-Dawley (200-300 g) avec du pentobarbital sodique (80 à 100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) par injection sous-cutanée; protéger le mésentère par ne pas utiliser l&#39;injection intrapéritonéale. </li><li> Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, de maintenir l&#39;anesthésie par des injections supplémentaires (30 mg / kg) selon le besoin. Déterminer profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil ou réflexe cornéen. Après achèvement de la procédure expérimentale, le rat euthanasie par surdose de pentobarbital ou injection intra-cardiaque de chlorure de potassium saturé sous anesthésie. </li></ol> 3. Préparer des solutions et des érythrocytes pour une utilisation comme Flow Markers <ol><li> Préparer la solution de Ringer mammifère pour superfusat et la solution de contrôle de perfusat (acide généralement le mammifère de solution de Ringer contenant 10 mg / ml grasalbumine libre de sérum bovin, BSA). <ol><li> Filtre de perfusion grâce à 0,2 um filtres seringue pour éliminer les particules minuscules qui pourraient bloquer la pointe de micropipette; filtrer dans un petit récipient propre. </li></ol></li><li> Préparer érythrocytes par étirage d&#39;environ 0,2 ml de sang de la veine de la queue du rat anesthésié dans une aiguille de 20G sur une petite seringue contenant 0,05 ml d&#39;héparine (1000 U / ml) et transférer dans un tube de 15 ml de centrifugeuse contenant environ 14 ml de mammifère solution une solution de Ringer . <ol><li> Centrifugeuse pour emballer en douceur les cellules rouges (environ max 200 g pendant 7 min). Dessinez le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans la solution de Ringer. </li><li> Après centrifugation et retrait du surnageant trois fois laisser les globules rouges concentrés dans le fond du tube pour une utilisation ultérieure. Notez que cette procédure permet de réduire les plaquettes dans perfusats finale à moins de 0,1% des niveaux normaux 31. </li></ol></li></ol> 4. Disposer les tissus de l&#39;animalPlateau <ol><li> Raser l&#39;abdomen du rat anesthésié par le dessous du nombril au processus xiphoïde. Assurez-vous que la zone rasée étend autour du côté droit (pour rat placé sur le côté droit) de sorte que les cheveux ne fait pas une mèche d&#39;attirer l&#39;superfusat hors du tissu ainsi. Enlever les poils coupés avec un tampon de gaze ou un tissu mouillé. <ol><li> Maintenez la peau avec un instrument contondant pince dentelées et faire une incision ligne médiane (2-3 cm de long) à travers la peau en utilisant une paire de ciseaux robustes. Utilisation d&#39;une amende (IRIS) ciseaux font une incision similaire, par la ligne blanche, soulever la paroi abdominale avec des pinces dentelées pour éviter d&#39;endommager l&#39;intestin. </li><li> Avec l&#39;animal sur le côté sur le plateau de l&#39;animal, tirez doucement l&#39;intestin de la cavité abdominale à l&#39;aide d&#39;applicateurs coton-tige (bâton de bois) trempés dans une solution de Ringer et une pince dentelées contondants. Disposer l&#39;intestin dans le tissu même de sorte que le mésentère est drapée sur le pilier pour la visualisation au microscope en prenant soin d&#39;éviter de toucher le mésentère (poteendommager ntially microvaisseaux) soit avec des forceps ou de coton. Remarque: Le plateau des animaux (figure 2A) peut être construite à partir de plexiglas et nécessite un tissu bien (environ 3 mm de profondeur), un pilier optiquement clair (par exemple, le quartz poli environ 2 cm de diamètre et 5 mm de haut.), Et un coussin chauffant ajustée pour maintenir la température de l&#39;animal. L&#39;épaisseur de la colonne ne doit pas dépasser la distance de travail de l&#39;objectif. </li></ol></li><li> Placez le bac animale sur la platine du microscope afin que le mésentère est visible à travers les oculaires. </li><li> Placez une ligne de goutte à goutte par gravité à superfuse permanence le mésentère avec la solution de Ringer mammifère maintenue à 35-37 ° C. Utilisez des tampons de gaze pour maintenir l&#39;intestin en place, pour conserver l&#39;humidité, et la mèche de la solution de Ringer excès de la surface. Régler le débit de l&#39;effluent et aspirer à maintenir une épaisseur de superfusat cohérente. </li><li> Identifier les cibles microvaisseaux veinules, qui sontsegments linéaires en aval de l&#39;écoulement convergente, une ou deux branches distales de vrais capillaires. Trouver un vaisseau non ramifié (idéalement, 600 à 1000 mm de longueur) ayant flux sanguin rapide et exempt de cellules blanches collées sur la paroi du vaisseau. </li><li> Placez le microvaisseaux de test dans le centre du champ de microscope et déplacer le dispositif de retenue en position à proximité du site de ponction choisi. </li></ol> 5. Remplissez Micropipette et Mount Holder <ol><li> Juste avant cannulating, suspendre les globules rouges dans le perfusat. Ajouter 7 pi de globules rouges à 0,5 ml de perfusion dans un tube à essai de borosilicate propre. Remarque: les hématocrites de 1-3% peuvent être utilisés, mais hématocrite cohérente seront conduire à des concentrations de perfusat cohérentes de toutes les substances libérées par les globules rouges. </li><li> Monter une seringue de 1 ml avec un adaptateur de tube de 23G et PE 50 tubes (5-15 cm de longueur). Dessinez le mélange de cellules de perfusion / rouge dans la seringue. Inversez la seringue de mélanger et d&#39;expulser toutes les bulles à partir de tubes etadaptateur. Pour une efficacité accrue, des tubes en forme à plusieurs seringues avant l&#39;expérience commence et les conserver dans une boîte sans poussière ou un sac plastique. </li><li> Remplir la micropipette en faisant avancer le tube dans la grande extrémité de la micropipette jusqu&#39;à venir en butée de la région conique. Appliquer une poussée rapide douce sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette. Remarque: Un petit ruisseau ou gouttelettes doivent être visibles à la pointe de mettre en évidence le remplissage complet. </li><li> Retirer le tube tout en poussant doucement sur le piston pour remplir la partie la plus large de l&#39;arbre de micropipette. Retirer petites bulles dans l&#39;arbre de large en feuilletant attentivement l&#39;arbre de micropipette. Remarque: Une procédure similaire a été illustrée 32. </li><li> Placer la micropipette dans un support de pipette avec un orifice latéral qui permet une connexion de fluide continu à un manomètre à eau. Veiller à ce que le titulaire, qui est attaché à un entraînement hydraulique utilisé pour contrôler très fine avancement de la micropipette, est à un léger angle (15-25 °)à l&#39;horizontale de sorte que le bord du cône de micropipette ne touche pas l&#39;intestin ou d&#39;un plateau. </li><li> Monter l&#39;entraînement hydraulique sur un micromanipulateur mobile, qui a x, y et z lecteurs pour permettre un alignement étroit de la cuve d&#39;essai (figure 2). </li><li> Régler la pression hydrostatique appliquée sur le fluide dans la seringue en utilisant une micropipette ou poire en caoutchouc rempli d&#39;eau pour modifier la hauteur de liquide dans la colonne d&#39;eau du manomètre à environ 40 cmH 2 O au-dessus du mésentère. </li><li> Cathétériser l&#39;microvaisseaux dès que possible après le remplissage de la pipette; globules rouges se déposent au fond de la pipette, de sorte que, après environ 40 min très peu de globules rouges seront versés dans le récipient. </li></ol> 6. Microcannulation et microvasculaire mesure de pression <ol><li> Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement sur le dispositif de retenue sur le tissu près de la microvaisseaux appliquer une force suffisante pour saisir le tissu. Dessinez lerestrainer à dos, légèrement en étirant le tissu conforme à l&#39;microvaisseaux de sorte que les contraintes dans les fibres de collagène mésentériques sont alignés avec le récipient. <ol><li> Aligner la micropipette avec le navire et l&#39;abaisser dans vue à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de ponction choisi et l&#39;abaisser sur le tissu afin qu&#39;il obstrue partiellement l&#39;écoulement dans le vaisseau, mais ne pas obstruer. </li></ol></li><li> Cathétériser la cuve par la conduite de la pointe de la pipette lentement dans la lumière du vaisseau à l&#39;aide de la commande hydraulique. Veillez à ne pas pousser à travers la partie inférieure de la cuve. Remarque: Comme la micropipette entre dans le lumen, le perfusat lave rapidement le sang dans le récipient hors de la lumière et perfusat librement flux en circulation de l&#39;distale de l&#39;animal à la microvaisseaux d&#39;essai, en déplaçant une partie de la perfusion sanguine normale dans les vaisseaux en aval. </li><li> Abaisser la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu&#39;à ce que le sang (comme indiquépar les globules rouges de l&#39;animal) est tiré en arrière dans le segment perfusé; ce qui détermine la pression d&#39;équilibre où les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau et mesure la pression hydrostatique des microvaisseaux (P c) à l&#39;extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir navire perfusion à toutes les pressions au-dessus de cette pression de l&#39;équilibre. </li></ol> 7. Microocclusion et collecte de données <ol><li> Etape facultative: Avant d&#39;utiliser le micro-dispositif d&#39;occlusion pour bloquer le navire, l&#39;enfoncer dans le tissu dans une zone non utilisée du mésentère loin de tout navire de telle sorte que la pointe accumule une amende pad de tissu qui protège le navire expérimental au cours micro répétée occlusions. </li><li> Placer le dispositif de blocage au-dessus du récipient perfusé à proximité du bord inférieur du champ de microscope. </li><li> Consigner les renseignements suivants avec la vidéo et l&#39;audio. <ol><li> Enregistrer verbalement l&#39;emplacement du site de bloc et le bord inférieur de l&#39;écran comme on le voit sur le réticule d&#39;oculaire. </li><li> Avec la pointedu bloqueur placé juste au-dessus de la microvaisseaux, utilisez le z contrôle fin de l&#39;micromanipulateur pour abaisser doucement le bloqueur jusqu&#39;à ce que le flux dans la cuve est obstruée. Notez la pression du manomètre (P c) sur audio. Appliquer occlusion typiquement pour 3-10 secondes, puis relâchez, la restauration de la perfusion libre. Déplacez le site de bloc le navire vers la pointe de la pipette en 5-10 pm étapes en fonction du temps (&gt; 5 min après le bloc initial à un site), le nombre d&#39;occlusions (3-5), pour empêcher navire dommages murale sur le site de bloc . </li></ol></li></ol> 8. Analyse des données et la mesure de L p (perméabilité à l&#39;eau) <ol><li> Pendant la lecture vidéo, déterminer la distance initiale (ℓ 0) à partir d&#39;un marqueur cellulaire rouge pour le site de l&#39;occlusion par l&#39;utilisation d&#39;une image d&#39;un micromètre et les positions connues sur les images. Déterminer la vitesse initiale (dl / dt) de la cellule de marqueur à partir de sa position en plusieurs trames au cours de la seconde 10.3 des images enregistrées. Dissuadermienne rayon de la cuve (r) à partir des images prises pendant l&#39;occlusion (Figure 3). </li><li> Calculer J v / S pour chaque occlusion (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calculer L p à une pression constante (J V / S) divisée par la pression de conduite (pression des microvaisseaux - pression osmotique colloïde efficace; voir Discussion). </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Détails de L calculs p. Bien que le mouvement du fluide transvasculaire se produit alors que le navire est librement perfusé, tel échange est trop petite pour être mesurée pendant la perfusion libre car elle est généralement moins de 0,01% du taux de perfusion de navire. Toutefois, lorsque la perfusion est temporairement arrêté par occlusion de la microvaisseaux, écoulement transvasculaire (par exemple, filtration) est mesurée à partir de la circulation des globules rouges de marquage dans l...

Microperfusion dans le système vasculaire consiste à établir un écoulement d&#39;un liquide de perfusion de composition connue artificielle commandé par l&#39;intermédiaire d&#39;une micropipette dans un vaisseau sanguin généralement inférieure à 40 um de diamètre. Le récipient perfusé reste dans son environnement normal et de tissu est perfusé avec du sang de l&#39;animal jusqu&#39;à l&#39;heure de canulation le. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec une gamme de l&#39;imagerie vidéo ou techniques fluorométriques, microperfusion in situ permet de mesurer des débits d&#39;eau et de solutés à travers les murs de microvaisseaux dans des conditions où les forces motrices de ces flux sont connus et les propriétés de perméabilité de la paroi vasculaire peuvent être directement évaluée. De plus, en contrôlant la composition du fluide entourant la microvaisseaux dans le tissu (perfusat et superfusat), la régulation de la perméabilité microvasculaire et l&#39;échange peut être étudiée en activant les cellules endothéliales qui forment la paroi de microvaisseaux à être exposée à une variété de econditions Xperimental (agonistes, conditions de perfusion modifiés, les indicateurs fluorescents pour mesurer la composition et la signalisation intracellulaire) pour des périodes mesurées précisément de temps (sec) à h. En outre, les évaluations ultrastructurales ou cytochimiques de structures moléculaires cellulaires clés régissant la barrière peuvent être étudiés dans les mêmes microvaisseaux dans lequel la perméabilité est mesurée directement. L&#39;approche forme ainsi un pont entre l&#39;enquête des mécanismes cellulaires et moléculaires de modifier la fonction de barrière endothéliale chez les monocouches de cellules endothéliales en culture et enquête microvaisseaux intactes. Voir les commentaires suivants pour une évaluation plus approfondie 1-6. Une limitation de microperfusion est qu&#39;il peut être utilisé que dans des lits microvasculaires qui sont minces, transparentes et ayant une intégrité structurelle suffisante pour permettre une canule avec une micropipette de verre. Alors que les premières enquêtes utilisées microvaisseaux de grenouilles dans mésentère et mince cutanée angine muscle 7,8, de loin la préparation la plus couramment utilisée dans les modèles de mammifères est le mésentère de rat 9-15. La plupart des enquêtes ont porté sur les changements aigus de la perméabilité vasculaire étudié sur des périodes de 1-4 heures, mais des études plus récentes ont été étendus à des mesures sur les navires individuels 24-72 h après une première perfusion 12,16. La technologie CRISPR récemment mis au point, qui promet de faire des modèles de rats plus génétiquement modifiés disponibles pour l&#39;étude de la régulation de la perméabilité vasculaire 17 devrait permettre aux méthodes décrites dans la présente communication à appliquer dans les microvaisseaux des veinules du mésentère dans ces nouveaux modèles importants de rat. La méthode nécessite un microscope inversé équipé d&#39;une platine de microscope construite sur mesure assez grand pour contenir à la fois la préparation des animaux et au moins trois micromanipulateurs utilisé pour positionner microtools à proximité de la cuve perfusé et d&#39;aligner une micropipette de perfusion avec le navirelumen. Par exemple, une plate-forme de commande pour un étage xy de microscope (environ 90 × 60 cm) peut être fabriqué à partir d&#39;une plaque d&#39;acier 1 cm d&#39;épaisseur avec un revêtement anti-rouille. La scène est attaché à une table d&#39;index d&#39;ingénierie ou deux diapositives en queue d&#39;aronde montés à angle droit et reposant sur des piliers en téflon ou les transferts de billes pour le déplacement dans le plan horizontal. Une installation typique (voir la figure 2) a beaucoup en commun avec l&#39;équipement de microscope et micropositionnement utilisée pour toute une gamme d&#39;expériences de la microcirculation intravitale tels que ceux de mesurer seul flux sanguin du navire et de l&#39;hématocrite, la livraison d&#39;oxygène locale par le sang perfusé microvaisseaux, réglementation des lisses vasculaires le tonus musculaire, et l&#39;accumulation de micro-vasculaire local des traceurs fluorescents injectés dans l&#39;ensemble de la circulation. 18-26 L&#39;aspect fondamental de la technique est la mesure de débit volumique (J v) sur une zone de surface définie (S) de la paroi de microvaisseaux. Accomplirce par la technique de Landis modifié décrit ici un microscope inversé simple, est adéquat. Une petite caméra vidéo est montée sur l&#39;orifice de l&#39;image et le signal vidéo, avec une base de temps supplémentaire, est affichée sur un moniteur vidéo et enregistrés soit sous forme numérique sur un ordinateur ou sous forme de signal numérique ou analogique sur un enregistreur vidéo. Une fois que la canule microvaisseaux est la partie de la microvaisseaux visible par la caméra peut être modifiée par déplacement de la platine et les manipulateurs en tant qu&#39;unité sans perturber la canulation. Mesure des flux de transvasculaires peut également être combiné avec des études plus détaillées à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence avec filtres appropriés sophistiqués tels que les plates utilisées pour les mesures de perméabilité soluté, la surveillance de la fluorescence du calcium cytoplasmique rapport ou d&#39;autres mécanismes cellulaires, et l&#39;imagerie confocale 6,12,13, 27. Un avantage clé de toutes les approches de microperfusion est la capacité de faire des mesures répétées, sur le même navire, Sous changement contrôlé de la force motrice telles que des pressions hydrostatiques et oncotiques, ou changement induit dans les réponses des navires à des conditions inflammatoires. La conception la plus commune est une comparaison par paires de la conductivité hydraulique mesurée (L p) sur le même navire avec le premier récipient perfusées via une micropipette remplie d&#39;un liquide de perfusion de contrôle et la suspension de globules rouges à établir un état ​​de référence de perméabilité, puis avec un second pipette avec l&#39;agent de test ajouté au perfusat. Canulations multiples sont possibles avec le cycle répété après reperfusion avec la pipette de commande. Le présent protocole démontre la canule et microperfusion d&#39;un navire veinulaire dans mésentère de rat pour enregistrer les flux d&#39;eau à travers la paroi des microvaisseaux et mesurer la L p de la paroi de la cuve, un indice utile de la perméabilité de la voie commune pour l&#39;eau et de solutés à travers le intacte barrière endothéliale. La procédure est appelée la techniq modifié Landisue parce que le principe Landis originale d&#39;utiliser le mouvement relatif des globules rouges comme une mesure de l&#39;échange fluide transvasculaire après perfusion est bloqué est préservée 28, mais l&#39;éventail des conditions expérimentales (par exemple, les différences de pression oncotiques hydrostatiques et de l&#39;albumine à travers la paroi des microvaisseaux) disponible après microperfusion est beaucoup plus grande que dans le sang perfusé microvaisseaux uncannulated 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE ET PLATINE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope inversé (type métallurgique) avec tête trinoculaire pour la vidéo : exemple</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>essayez de placer les oculaires plus haut par rapport à la platine - vous devez regarder à travers les oculaires tout en atteignant le haut de la platine au-dessus des micromanipulateurs intermédiaires microscope</td></tr><tr><td>inversé (type métallurgique) avec tête trinoculaire pour la vidéo : exemple</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>essayez de placer les oculaires plus haut par rapport à la platine - vous devez regarder à travers les oculaires tout en atteignant le haut de la scène sur les micromanipulateurs intermédiaires</td></tr><tr><td>diamètre étroit, longue distance de travail objectif : exemple</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10 & times ; / 0.25 LWD</td> plate-forme de scène - 1/2 pouce ou 1 cm atelier de soudage de tôle d’acier <td></td></tr><tr><td></td><td>cela devrait être lourd pour réduire les vibrations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table Unislide x-y : glissières en queue d’aronde</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra vidéo CCD : exemple</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (n’est plus disponible)</td><td>pas besoin de couleur système</td></tr> de <tr><td>capture vidéo avec audio--système de lecture vidéo générique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(image complètement fixe, mouvement d’une seule image)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petit microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATEURS, SUPPORTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (n’est plus disponible)</td><td></td><td>recherchez un Z fin, et une plus grande plage de course dans les entraînements grossiers pour faciliter le positionnement entraînement</td></tr><tr><td>de sonde hydraulique, unidirectionnel</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>besoin d’acheter soit un entraînement manuel, soit un entraînement électronique</td></tr> entraînement <tr><td>manuel du tambour&nbsp ;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>ou entraînement hydraulique, 3 voies</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1 voie) ou MX630 (3 voies)</td> <td>idéal pour les bras courts, rempli d’eau et doit être renvoyé pour recharge ~ tous les 2 ans</td></tr><tr><td>connecteurs/tiges/supports</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>étau à goupille</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>pour maintenir le support de pipette de retenue</td></tr><tr><td></td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>manomètre à eau ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLATEAU DE</td><td></td><td></td><td></td>MICROSCOPE</tr><tr><td>Plexiglas transparent pour plateau de microscope pour animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 pouce disque de quartz poli ~1/4 pouce de hauteur</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>personnalisé</td><td>&nbsp ;( ou plexiglas poli, verre) ; assurez-vous que la hauteur est inférieure à la distance de travail de la</td></tr><tr><td>colle plexiglas de l’objectif (Weld-on 4 : ATTENTION CANCÉRIGÈNE)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>adhésif médical pour puits de tissu</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>Tapis chauffant tout usage en caoutchouc de silicone, 5 « L x 2 » W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>chauffage pour plateau de microscope - nécessite un cordon et un contrôleur--Version 240V disponible</td></tr><tr><td>Adaptateur de cordon d’alimentation pour radiateurs et kits Kapton, 6 pi, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Contrôleur à tension variable, 10 A ; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>extracteur de pipette vertical</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 avec filament</td><td></td>nichrome</tr><tr><td>Tube capillaire à paroi mince de 1,5 mm de diamètre extérieur</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>meuleuse de pipette pierre à air et microscope de dissection--voir la référence dans le texte</td><td></td><td></td><td>ou achetez un paquet de Sutter Instruments ou World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Machine de rodage, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative pour la pierre à air, à utiliser avec un microscope de dissection monté à un angle</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; avec disque d’affûtage en céramique</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>utiliser « tel quel » ou fixer</td></tr> des <tr><td>feuilles de film de rodage de film de rodage, 0,3 ou 0,5 um</td><td>3M</td><td>n° de pièce 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film feuilles avec dos adhésif - peut être acheté sur Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au rat mesentery

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Expériences pour mesurer les propriétés de perméabilité des microvaisseaux perfusés individuellement fournissent un pont entre l&#39;enquête des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant la perméabilité vasculaire dans des monocouches de cellules endothéliales en culture et les propriétés des lits microvasculaires entiers de change fonctionnels. Une méthode pour canuler et perfuser microvaisseaux des veinules de mésentère de rat et de mesurer la conductivité hydraulique de la paroi des microvaisseaux est décrite. L&#39;équipement principal nécessaire comprend un microscope intravitale avec une grande scène modifiée qui prend en charge micromanipulateurs de positionner trois microtools différents: (1) une micro-pipette de verre biseauté à Cathétériser et perfuser l&#39;microvaisseaux; (2) un verre de micro-obturateur pour bloquer temporairement la perfusion et permet la mesure de mouvement d&#39;écoulement d&#39;eau transvasculaire à une pression hydrostatique mesurée, et (3) une tige de verre émoussé pour stabiliser le tissu mésentérique au niveau du site de ponction. La Landis micro-occlusion techniq modifiéeue utilise les globules rouges en suspension dans le liquide de perfusion artificielle comme marqueurs de mouvement fluide transvasculaire, et permet également des mesures répétées de ces flux conditions expérimentales sont modifiées et de la différence de pression osmotique colloïde hydrostatique et à travers les microvaisseaux sont soigneusement contrôlées. Les mesures de conductivité hydraulique première aide d&#39;un liquide de perfusion de commande, puis après une nouvelle ponction de même avec les microvaisseaux perfusats de test permettre des comparaisons de la réponse des microvaisseaux dans ces conditions bien contrôlées jumelés. Les tentatives visant à étendre la méthode de micro-vaisseaux dans le mésentère des souris avec des modifications génétiques prévus pour modifier la perméabilité vasculaire ont été sévèrement limitée à cause de l&#39;absence de longs microvaisseaux droites et non ramifiées dans le mésentère des souris, mais la disponibilité récente des rats avec des modifications génétiques similaires en utilisant la technologie / cas9 CRISPR est prévu d&#39;ouvrir de nouveaux domaines de recherche où les méthodes décrites ici peuvent être appliquées. </p&gt;

La figure 4 montre les résultats de la mesure de l&#39;évolution dans le temps des changements de L p dans un rat veinulaire microvaisseaux canule successivement avec quatre perfusats. 33 L&#39;amplitude de L p calculée à une pression constante a été utilisée comme mesure de l&#39;évolution des microvaisseaux paroi perméabilité, d&#39;une part dans l&#39;état de commande avec un liquide de perfusion contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin, puis lorsque le navire a été...

La technique Landis modifiée permet de mesurer par appariement la conductivité hydraulique de microvaisseaux individuels dans le mésentère de rats normaux et génétiquement modifiés dans des conditions de contrôle et d’essai à l’aide de techniques de microperfusion. Il s’agit d’une méthode pratique pour évaluer les mécanismes qui régulent la perméabilité des microvaisseaux et les échanges transvasculaires dans des conditions physiologiques.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de permettre des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l'eau des parois des microvaisseaux urulaires dans le mésentère du rat dans des conditions expérimentales contrôlées. Ceci est réalisé en canulant les microvaisseaux urulaires afin de régler les pressions oncotique et hydrostatique dans la lumière et de permettre un contrôle précis de la composition chimique du fluide de perfusion et du milieu interstitiel. Ensuite, le vaisseau est occlus, et les globules rouges en suspension dans le fluide de perfusion, qui servent de marqueurs de débit, peuvent être observés en mouvement dans la lumière comme indicateurs d'échange transvasculaire de liquide.Ensuite, la position et la vitesse des globules rouges marqués sont enregistrées soit vers le site d'occlusion, soit en s'éloignant du site d'occlusion. Enfin, l'occlusion est relâchée et répétée pour des mesures supplémentaires, ou le vaisseau est recanalisé. Le vaisseau est alors canulé à nouveau et les mesures sont répétées dans des conditions modifiées.En fin de compte, des mesures appariées de conductivité hydraulique dans des conditions de contrôle et de test peuvent être effectuées afin de permettre l'investigation la plus directe des facteurs régulant la perméabilité des microvaisseaux. Un avantage de la technique de Landis modifiée pour étudier la régulation de la perméabilité capillaire réside dans l'étape de perfusion. La microperfusion permet de mesurer la perméabilité de la paroi des microvaisseaux dans des conditions où la composition du liquide de perfusion, la surface d'échange et la pression dans les microvaisseaux sont toutes contrôlées directement.Cette méthode permet d'aborder des questions relatives aux mécanismes cellulaires et moléculaires de la régulation de la perméabilité dans les microvaisseaux, qui sont représentatifs d'organes intacts, et elle offre la possibilité de comparer ces résultats à ceux obtenus à partir de monocouches endothéliales en culture, souvent utilisées pour étudier en détail les mécanismes moléculaires. Notre protocole est démontré par Joyce Clark, notre responsable de laboratoire. Joyce a été à l'origine de nombreuses améliorations apportées à ce protocole au cours de son mandat en tant que responsable de laboratoire.Pour commencer, utilisez un tireur électronique pour façonner plusieurs tubes capillaires en verre borosilicaté en pointes effilées, chacune ayant une longueur d'extrémité d'environ un centimètre, à l'aide d'une meule entraînée par air comprimé et d'un papier abrasif de 0,5 micron imbibé d'eau, ainsi que d'un support de micropipette réglé à un angle de 30 degrés par rapport au biseau horizontal, les micropipettes. Après avoir lavé et séché les micropipettes conformément au protocole décrit, sélectionnez celles dont l'ouverture mesure environ 50 microns de long et dont le rapport entre la longueur et la largeur du biseau se situe entre 3,1 et 3,5. Elles doivent également présenter une pointe fortement effilée, ce qui facilite la pénétration des fibres de collagène résistantes dans le mésentère.Pour fabriquer des rétrécisseurs, faites brièvement tenir une capillaire en verre tirée non biseautée près d'une microflamme afin de former une extrémité émoussée. Répétez l'opération pour produire plusieurs rétrécisseurs et rangez-les dans une boîte sans poussière. Ensuite, fabriquez des micro-obturateurs en maintenant un tube capillaire tiré non biseauté en oblique sous une microflamme, puis utilisez un adaptateur de tube ou une micropipette cassée pour courber doucement le tube d’environ quatre millimètres de l’extrémité, selon un angle proche de 120 degrés.En ce qui concerne la tige, il est important que la pointe ne soit ni scellée à la flamme ni cassée. Après avoir anesthésié un rat et disposé le tissu mésentérique et l'intestin conformément au protocole décrit, placer le plateau de l'animal sur la platine du microscope de manière à ce que le mésentère soit visible à travers les oculaires. Positionner une perfusion par gravité de solution de Ringer pour mammifères afin d'assurer une superfusion continue.Le mésentère utilise ensuite des compresses de gaze pour maintenir l'intestin en place, aider à conserver l'humidité et absorber l'excès de liquide de Ringer à la surface ; ajustez le débit et aspirez l'effluent afin de maintenir une couche constante de suse huit, identifiez les microvaisseaux cibles flar, qui sont des segments non ramifiés en aval d'un flux convergent et situés à une ou deux branches en aval des vrais capillaires. Recherchez un vaisseau non ramifié présentant un débit sanguin rapide et dépourvu d'adhérence de cellules blanches sur la paroi du vaisseau. Placez les microvaisseaux à tester au centre du champ du microscope et positionnez le stabilisateur près du site de canulation choisi.Pour remplir la micropipette, aspirez le milieu de perfusion et transférez huit globules rouges dans une seringue préparée conformément au protocole décrit, en veillant à ce qu'il n'y ait aucune bulle dans le tube. Introduisez le tube dans l'extrémité large de la micropipette jusqu'à ce qu'il bute contre la zone conique. Exercez une légère poussée rapide sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette.Un minuscule filet ou goutte apparaîtra à l'extrémité lorsque celui-ci sera plein. Lors du retrait du tube, appuyez doucement sur le piston pour remplir le fût de la micropipette. Ensuite, éliminez les petites bulles d'air présentes dans le fût en le tapotant doucement.Placez ensuite la micropipette dans un support de pipette doté d'un orifice latéral permettant une connexion fluide continue avec un manomètre à eau. Veillez à ce que le support, fixé à un système d'entraînement hydraulique et à un micromanipulateur, soit positionné selon un léger angle horizontal afin que le bord effilé de la micropipette n'entre pas en contact avec l'intestin ou le plateau. À l'aide d'une seringue ou d'une poire en caoutchouc remplie d'eau, ajustez la pression hydrostatique exercée sur le liquide contenu dans la micropipette en modifiant la hauteur du liquide dans la colonne d'eau du manomètre, jusqu'à environ 40 centimètres d'eau au-dessus du mésentère.Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement le dispositif de maintien sur le tissu près des microvaisseaux, en exerçant une force suffisante pour saisir le tissu, puis ramenez légèrement le dispositif de maintien vers l'arrière afin d'étirer le tissu dans l'axe des microvaisseaux, de manière à aligner les contraintes mécaniques des fibres de collagène mésentériques avec celui du vaisseau. Alignez la micropipette avec le vaisseau et abaissez-la jusqu'à ce qu'elle soit visible à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de canulation choisi et abaissez-la sur le tissu de sorte qu'elle obstrue partiellement l'écoulement dans le vaisseau, sans toutefois l'occlure.À l’aide de l’entraînement hydraulique, canuler le vaisseau en introduisant lentement la pointe de la pipette dans la lumière du vaisseau, en prenant soin de ne pas traverser l’autre paroi du vaisseau. Lorsque la micro-pipette pénètre dans la lumière, le fluide de perfusion chassera rapidement le sang de la lumière du vaisseau et entrera dans la circulation. Réduire la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu’à ce que les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau.Ceci détermine la pression de compensation, qui mesure la pression hydrostatique dans les microvaisseaux ou PC à l'extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir la perfusion du vaisseau au-dessus de cette pression de compensation afin d'effectuer une micro-occlusion. Placer le bloqueur au-dessus du vaisseau perfusé, près du bord inférieur du champ du microscope, à l'aide de la vidéo et de l'audio.Enregistrer oralement l'emplacement du site de blocage tel qu'observé dans le fragment I rouge. Le site de blocage se situe à 57. Placer la pointe du bloqueur juste au-dessus du microvaisseau. Utiliser la commande fine en Z du micromanipulateur pour abaisser délicatement le bloqueur jusqu'à ce que le flux dans le vaisseau soit occlus.Utilisez un dispositif audio pour noter la pression du manomètre. La pression est de 50. Appliquez ensuite une occlusion pendant trois à dix secondes, puis relâchez-la.Pour rétablir une perfusion libre, déplacez le site de blocage vers l'extrémité de la pipette en progressant de cinq à dix micromètres à chaque étape, en effectuant au maximum trois à cinq occlusions à chaque emplacement afin d'éviter d'endommager la paroi du vaisseau au site de blocage. Analysez les données conformément au protocole décrit dans le texte. Ce suivi temporel mesure les variations de conductivité hydraulique ou LP. Chez un rat, des microvaisseaux urinaires ont été cannelés avec succès à l'aide de quatre perfusions.L'ampleur de la LP à pression constante a été utilisée pour mesurer les changements dans les microvaisseaux. Perméabilité pariétale lors de la perfusion avec 1 % BSA comme témoin par rapport à 10 molaire de l'agent inflammatoire Brady Kinin ou bk. Comme indiqué ici, le bk a provoqué une augmentation transitoire de la LP qui est revenue aux niveaux témoins en 10 à 15 minutes.Après rétablissement des niveaux de base avec 1 % BSA à 10 nanomolaire, la bradykinine (BK) a été réperfusée en même temps qu'un micromolaire de pH sens un phosphate ou S1P. Les résultats indiquent que le S1P atténue significativement la réponse à la BK. Pour certaines conceptions expérimentales, il est important d'estimer à la fois le coefficient de réflexion du soluté pour une macromolécule et le lp.Cela est réalisé de manière optimale en mesurant JV à plusieurs pressions sur chaque vaisseau microscopique individuel. Cette expérience a permis d'estimer à la fois LP et la pression oncotique effective de l'albumine à 5 % dans le PERFUSE huit lorsqu'aucune albumine n'était présente dans les tissus entourant les vaisseaux microscopiques. JV divisé par S a été mesuré à trois pressions différentes et représenté graphiquement ici.Le LP est la pente de la relation entre JV divisé par S et la pression, et l'intersection avec l'axe de la pression correspond à la différence effective de pression oncotique à travers la paroi du vaisseau. Combinée à d'autres techniques telles que le marquage par immunofluorescence et la microscopie confocale, ou même la microscopie électronique en transmission, la microperfusion offre une analyse puissante de l'endothélium microvasculaire et de sa fonction, en utilisant des vaisseaux dont la perméabilité est connue. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l'eau des microvaisseaux capillaires dans le mésentère de rat, dans des conditions expérimentales contrôlées.Vous pouvez utiliser cette approche dans les modèles de rat actuellement disponibles, mais je suis particulièrement intéressé par la possibilité de son utilisation dans de nouveaux rats génétiquement modifiés qui deviendront accessibles grâce à la technologie CRISPR Cas nine, et j'espère qu'elle sera étendue de cette manière.

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Biologie

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