Microperfusion Technique chargé d'enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

L’objectif général de l’expérience suivante est de permettre des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l’eau des parois des microvaisseaux Ular chez le rat mésentaire dans des conditions expérimentales contrôlées. Ceci est réalisé en canulant un micro-vaisseau ulaire pour permettre de régler les pressions oncotiques et hydrostatiques dans la lumière et de contrôler avec précision la composition chimique du huit profuse et du huit de Suses. Ensuite, le vaisseau est occlus et les globules rouges en suspension dans le huit de PERFUSE, qui agissent comme des marqueurs de flux, peuvent être observés se déplacer dans la lumière comme indicateurs d’échange de liquide transvasculaire.

Ensuite, la position et la vitesse des globules rouges marqueurs sont enregistrées soit vers le site d’occlusion, soit loin du site d’occlusion. Enfin, l’occlusion est relâchée et répétée pour des mesures supplémentaires ou pour que le vaisseau soit rec. Canulation et les mesures sont répétées dans des conditions modifiées.

En fin de compte, des mesures appariées de la conductivité hydraulique dans des conditions de contrôle et d’essai peuvent être effectuées pour permettre l’étude la plus directe des facteurs régulant les micro-récipients. Perméabilité. L’un des avantages de la technique de Landis modifié pour étudier la régulation de la perméabilité capillaire est l’étape de perfusion. La micro-perfusion permet de mesurer la perméabilité de la paroi des micro-vaisseaux dans des conditions où la composition en huit PERFUSE, la surface d’échange et la pression des microvaisseaux sont toutes directement contrôlées.

Cette méthode peut répondre à des questions concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires de régulation de la perméabilité dans des microvaisseaux représentatifs d’organes intacts, et elle peut fournir une comparaison avec les résultats des monocouches endothéliales cultivées, qui sont souvent utilisées pour étudier les détails des mécanismes moléculaires. Joyce Clark, notre responsable de laboratoire, fait la démonstration de notre protocole. Joyce a été responsable de nombreuses améliorations de ce protocole pendant son séjour ici en tant que directrice de laboratoire.

Pour commencer, utilisez un extracteur électronique pour former plusieurs tubes capillaires en verre boro silicate propre en moitiés coniques, chacune avec une longueur de pointe d’environ un centimètre, à l’aide d’une meule pneumatique et d’un papier abrasif de 0,5 micron baigné d’eau et d’un porte-micro-pipette placé à un angle de 30 degrés par rapport au biseau horizontal, les micro pipettes. Après avoir lavé et séché les micro-pipettes selon le protocole de texte, sélectionnez des micro-pipettes avec une ouverture d’environ 50 microns de long et un rapport longueur/largeur de biseau compris entre 3,1 et 3,5. Ils doivent également avoir une pointe fortement effilée, qui aide à pénétrer les fibres de collagène dures dans le mésentère.

Pour faire des contenteurs brièvement, tenez un capillaire en verre tiré non biseauté près d’une micro-flamme pour former une extrémité émoussée. Répétez l’opération pour fabriquer plusieurs dispositifs de contention et rangez-les dans une boîte sans poussière. Ensuite, faites des micro-occlusions en tenant un tube capillaire tiré non biseauté à un angle sous une micro-flamme et utilisez un adaptateur de tube ou une micro-pipette cassée pour plier doucement le tube à environ quatre millimètres de la pointe à un angle proche de 120 degrés.

En ce qui concerne l’arbre, il est important que la pointe ne soit ni scellée dans la flamme ni cassée. Après avoir anesthésié un rat et disposé le tissu mésentaire et l’intestin selon le protocole de texte, placez le plateau de l’animal sur la platine du microscope de manière à ce que le mésentaire soit visible à travers les oculaires. Positionnez une ligne d’égouttement alimentée par gravité d’une solution de sonnerie de mammifère pour super fusionner en continu.

Le mésentaire utilise ensuite des tampons de gaze pour maintenir l’intestin en place, aider à retenir l’humidité et évacuer les anneaux en excès de la surface, ajuster le débit et aspirer l’effluent pour maintenir une couche constante de huit cylindres, identifier les microvaisseaux cibles du flar, qui sont des segments non ramifiés en aval de l’écoulement convergent et une ou deux branches distales aux vrais capillaires. Trouvez un vaisseau non ramifié ayant un flux sanguin rapide et exempt de globules blancs collés sur la paroi du vaisseau. Posséder. Placez les micro-récipients d’essai au centre du champ du microscope et déplacez le dispositif de contention en position près du site de canulation choisi.

Pour remplir la micro-pipette, prélevez huit perfuses et lavez les érythrocytes dans une seringue préparée selon le protocole de texte, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube. Avancez le tube dans la grande extrémité de la micropipette jusqu’à ce qu’il atteigne la région effilée. Appliquez une légère pression rapide sur le piston de la seringue pour remplir l’embout de la micro-pipette.

Un petit ruisseau ou une goutte apparaîtra à l’extrémité lorsqu’il sera plein. Tout en retirant le tube, appuyez doucement sur le piston pour remplir l’arbre de la micro-pipette. Ensuite, retirez les petites bulles dans la tige en la tapotant doucement.

Placez ensuite la micro-pipette dans un porte-pipette doté d’un orifice latéral qui permet une connexion continue du fluide à un manomètre d’eau. Assurez-vous que le support, qui est fixé à un entraînement hydraulique et à un micromanipulateur, est réglé à un léger angle horizontal afin que le bord du cône de la micropipette ne heurte pas l’intestin ou le plateau. À l’aide d’une seringue ou d’une poire en caoutchouc remplie d’eau, ajustez la pression hydrostatique appliquée au fluide dans la micropipette en modifiant la hauteur du fluide dans la colonne d’eau du manomètre à environ 40 centimètres d’eau au-dessus du mésentère.

Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement sur le dispositif de retenue sur le tissu près des micro-vaisseaux, en appliquant une force suffisante pour saisir le tissu, tirez légèrement le dispositif de retenue vers l’arrière, en étirant le tissu dans l’alignement des micro-vaisseaux de sorte que les contraintes dans les fibres de collagène mésentériques soient alignées avec le vaisseau. Alignez la micropipette avec le récipient et abaissez-la à travers les oculaires. Placez l’embout juste en amont du site de canulation choisi et abaissez-le sur le tissu de manière à ce qu’il obstrue partiellement l’écoulement à l’intérieur du vaisseau, mais ne l’obstrue pas.

À l’aide de l’entraînement hydraulique, canulez le récipient en enfonçant lentement la pointe de la pipette dans la lumière du récipient, en prenant soin de ne pas pousser la pointe de l’autre côté du récipient. Lorsque la micro-pipette pénètre dans la lumière, la perfuser huit lave rapidement le sang de la lumière du vaisseau et entre dans la circulation. Abaissez la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu’à ce que les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau.

Celle-ci détermine la pression d’équilibre, qui mesure la pression hydrostatique des micro-récipients ou PC à l’extrémité distale du segment des micro-récipients. Maintenez la perfusion du vaisseau au-dessus de cette pression d’équilibre pour effectuer la micro-occlusion. Placez le bloqueur au-dessus du vaisseau perfusé, près du bord inférieur du champ du microscope, à l’aide de la vidéo et de l’audio.

Enregistrez verbalement l’emplacement du site du bloc tel qu’il est vu dans la pièce rouge I. Le site du bloc est de 57 avec la pointe du bloqueur placée juste au-dessus du micro-vaisseau. Utilisez la commande fine Z du micromanipulateur pour abaisser doucement le bloqueur jusqu’à ce que le flux dans le récipient soit obstrué.

Utilisez l’audio pour noter la pression du manomètre. La pression est de 50. Appliquez ensuite l’occlusion pendant trois à 10 secondes et relâchez.

Pour rétablir la perfusion libre, déplacez le site du bloc vers le haut du récipient vers la pointe de la pipette par pas de cinq à 10 microns, en n’effectuant pas plus de trois à cinq occlusions à chaque endroit pour éviter d’endommager la paroi du vaisseau au site du bloc. Analysez les données selon le protocole texte. Ce parcours temporel mesure les changements de conductivité hydraulique ou LP.In un micro-vaisseau ratulaire canulé avec succès avec quatre huit perfusés.

L’amplitude du LP à pression constante a été utilisée pour mesurer les changements dans les micro-récipients. Perméabilité de la paroi lorsqu’elle est perfusée avec 1 % de BSA comme témoin contre 10 molaires de l’agent inflammatoire Brady Kinin ou bk. Comme le montre ici, BK a provoqué une augmentation transitoire des LP qui sont revenus aux niveaux de contrôle en 10 à 15 minutes.

Après avoir rétabli les niveaux de base avec 1 % BSA 10 nanomolaires. BK a été reperfusé avec une scène de pH micromolaire, un phosphate ou S un P. Les résultats indiquent que le S un P a considérablement atténué la réponse à bk. Pour certains plans expérimentaux, il est important d’estimer à la fois le coefficient de réflexion du solout pour une macromolécule et la LP.

La meilleure façon d’y parvenir est de mesurer l’effet JV à plusieurs pressions sur chaque micro-récipient individuel. Cette expérience a estimé à la fois la LP et la pression oncotique effective de 5 % d’albumine dans le huit PERFUSE lorsqu’il n’y avait pas d’albumine dans le tissu entourant les micro-vaisseaux. JV sur S a été mesurée à trois pressions différentes et tracée. Ici.

Le LP est la pente de la relation entre JV sur S et la pression, et l’ordonnée à l’origine sur l’axe de pression est la différence de pression oncotique effective à travers la paroi du récipient. Lorsqu’elle est combinée à d’autres techniques telles que le marquage immunofluorescent et la microscopie confocale, ou même la microscopie électronique à transmission, la micro-profusion fournit une analyse puissante de l’endothélium et de la fonction microvasculaires à l’aide de vaisseaux de perméabilité connue. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des mesures répétées de la conductivité hydraulique ou de la perméabilité à l’eau des microvaisseaux ular dans le mesentry du rat dans des conditions expérimentales contrôlées.

Vous pouvez utiliser cette approche dans les modèles de rats actuellement disponibles, mais je suis particulièrement intéressé par la possibilité qu’elle puisse être utilisée dans les nouveaux rats génétiquement modifiés qui deviendront disponibles avec la technologie CRISPR Cas neuf, et j’espère qu’elle sera étendue de cette manière.