Name: VDJ-Seq: Analyse en profondeur de séquençage de Rearranged immunoglobuline chaîne lourde Gene à révéler des modèles clonale évolution de B Lymphome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Découvrez l'analyse VDJ-Seq pour caractériser l'évolution clonale des lymphomes B par séquençage profond des régions VDJ des immunoglobulines. Cette méthode permet d'étudier l'hétérogénéité tumorale et la résistance thérapeutique.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Rita Shaknovich et les membres du laboratoire Elemento, du laboratoire Melnick et du laboratoire Tam pour leurs discussions réfléchies. Nous tenons également à remercier la plateforme de ressources génomiques du Weill Cornell Medical College pour avoir effectué le séquençage VDJ. YJ a été soutenu par l’ASH Scholar Award. WT et OE sont soutenus par la subvention pilote du Weill Cornell Cancer Center. OE est soutenu par le prix NSF CAREER, le Starr Cancer Consortium et le Hirschl Trust. Nous tenons également à remercier Katherine Benesch, JD, MPH pour son généreux soutien à ce projet.

1. Amplification VDJ 1.1) Extraction d&#39;ADN des échantillons de tumeurs <ol><li> Extraire l&#39;ADN des sections minces (10-20 um) de PTOM tissus normaux ou malignes embarqués gelés. <ol><li> Digest 10-30 coupes minces de tissu enrobé par une coupe au microtome de cryostat dans 4 ml de tampon de lyse nucléique (Tris-HCl 0,0075 M, pH 8,2; 0,3 M de NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) avec de la proteinase K (0,5 mg / ml, concentration finale ) et 0,625% de SDS dans un tube de centrifugation de 15 ml dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant une nuit. </li><li> Ajouter 1 ml de NaCl saturé (5 M) au mélange de digestion et agiter vigoureusement pendant 15 sec. </li><li> Centrifuger à 1100 g pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 15 ml et ajouter deux volumes d&#39;éthanol à 100%. </li><li> Mélanger en retournant le tube 6-8 fois. Centrifuger à 5000 xg pendant 60 min à 4 ° C pour recueillir le précipité d&#39;ADN. </li><li> Laver le culot d&#39;ADN à deux reprises avec 70% d&#39;éthanol. Centrifuge à 5000 g pendant 15 min à chaque fois pour recueillir le culot. </li><li> Dissoudre l&#39;ADN dans un tampon TE 100-400 pi à la température ambiante sur une nuit d&#39;agitation. Le rendement en ADN est de 5 à 200 ug (de concentration finale comprise entre 50 à 500 ng / ul) en fonction de la taille du tissu </li></ol></li><li> Extraire l&#39;ADN à partir de sections minces (10 à 20 um) d&#39;fixés à la formaline, noyés (FFPE) un tissu normal ou maligne paraffin-. <ol><li> Incuber les coupes de paraffine dans 1 ml de xylène deux fois à la température ambiante pendant 10 min à chaque fois dans un tube de 1,5 ml à De-paraffinize. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Incuber les coupes dans 1 ml d&#39;éthanol à 100% deux fois à la température ambiante, 10 min à chaque fois pour éliminer les xylènes de résidus. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante. La paraffine est complètement dissous à ce point et que la section de tissu est restants. </li><li> Air-sécher les sections de chambre température pendant 10-15 min. </li><li> Faire une solution à 0,5 mg / ml protéinase K avec un tampon 1x PCR (dilué à partir du tampon 10x PCR avec de l&#39;eau sans nucléase). Ajouter la solution de Proteinase K échantillons dans un volume final de 50 à 100 ul et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la proteinase K. Remarque: Lors de cette étape, l&#39;ADN de l&#39;échantillon est dissous dans le tampon de PCR et peut être utilisé dans les étapes 1.2 et 1.3 directement. Le rendement en ADN est de 0,5 à 20 ug (de concentration finale comprise entre 10 à 200 ng / ul) en fonction de la taille du tissu. </li></ol></li></ol> 1.2) d&#39;évaluation de la qualité de l&#39;ADN <ol><li> Mélanger 0,25 ul ADN polymérase Taq avec 45 pi de mélange maître de la trousse de l&#39;échelle commerciale dans un tube PCR. </li><li> Ajouter 5 ul ADN préparé à partir de 1.1.1.7 ou 1.1.2.5 dans le tube PCR et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C. </li><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose à 2% dans du TBE (Tris / Borate / EDTA). </li><li> Mélanger réaction de PCR de 20 pi avec 4 ul de colorant de charge 6x, et charger sur un gel d&#39;agarose à 2%. </li><li> Colorer le gel d&#39;agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système de gel de l&#39;imagination. Remarque: les échantillons qui donnent des 5 produits de PCR à des tailles de 100, 200, 300, 400 et 600 pb sera continué à générer des amplicons VDJ. ATTENTION: Le bromure d&#39;éthidium est un mutagène puissant. S&#39;il vous plaît manipuler avec une extrême prudence en portant des équipements de protection, gants à savoir, et d&#39;en disposer dans des conteneurs spécifiques par les directives de l&#39;institution. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify recombiné IgH VDJ segment de la Région cadre 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mélanger 45 ul mélange maître de l&#39;étiquette du tubeed comme &quot;Mix 2&quot; d&#39;une hypermutation somatique IGH dosage pour la détection Gel kit commercial, 0,25 ul de l&#39;ADN polymerase Taq, l&#39;ADN de l&#39;échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR. </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C. </li><li> Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse. </li><li> Colorer le gel d&#39;agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système d&#39;imagerie de gel. Un amplicon monoclonal est prévu avec la gamme de taille de 310 à 380 pb. </li><li> Exciser la partie de gel contenant l&#39;amplicon monoclonal entre 310-380 pb. </li><li> Purifier l&#39;ADN excisé à partir du gel en utilisant un kit d&#39;extraction de gel norme selon le protocole du fabricant. Remarque: pour les échantillons qui FR1 fragments ont pu être obtenus, il n&#39;y a pas besoin de amplement IgVHFR2 et IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify recombiné IgH VDJ segment de cadre Région 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mélanger 45 ul de mélange-maître à partir du tube appelée &quot;Tube B&quot; d&#39;un commercial IGH Gene Clonality Assay kit de détection de gel, 0,25 ul de l&#39;ADN polymerase Taq, l&#39;ADN de l&#39;échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR . </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et laisser à 15 ° C. </li><li> Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse. </li><li> Visualiser le produit (s) PCR de 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium coloration. Un amplicon monoclonal peut être observé dans la plage de taille de 250 à 295 pb. </li><li> Exciser la partie de gel contenant l&#39;amplicon monoclonal entre 250 à 295 pb. </li><li> Purifier l&#39;ADN à partir de gel excisée en utilisant un extrait de normale GelKit ion selon le protocole du fabricant. </li></ol> 1.4) Optimiser VDJ PCR <ol><li> Les conditions de PCR modifiés suivants pour amplifier IgVHFR1 et IgVHFR2 utilisant de l&#39;ADN sous-optimale: 95 ° C pendant 7 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 60 sec, 60 ° C pendant 60 sec, et 72 ° C pendant 90 sec, extension finale à 72 ° C pendant 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Bibliothèque Préparation et séquençage 2.1) Préparation Bibliothèque 2.1.1) Fin de réparation <ol><li> Transférer le produit PCR VDJ de 1,3 dans un tube PCR et ajouter Resuspension tampon de l&#39;ADN échantillon trousse de préparation pour élever le volume à 60 pi. </li><li> Ajouter 40 pi de réparation de Fin Mix de Kit de préparation de l&#39;ADN de l&#39;échantillon et bien mélanger. </li><li> Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C. </li><li> Mélanger 136 pi billes magnétiques et 24 ul g PCRl&#39;eau rade d&#39;abord dans un tube de 1,5 ml, puis transférer la totalité de la réaction en fin de réparation à 2.1.1.3 dans le tube de 1,5 ml et bien mélanger avec la solution de perles. </li><li> Placer les tubes sur un support magnétique pendant 2 min pour permettre la séparation des billes de la solution. Aspirer le surnageant et laver les perles avec 80% EtOH frais préparé deux fois tandis que le tube est sur le support magnétique. </li><li> Aspirer la solution d&#39;éthanol complètement et permettre aux billes sécher à l&#39;air pendant 15 min à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Prenez le tube de la béquille et remettre les billes magnétiques dans 17,5 ul Resuspension tampon. </li><li> Placer les tubes de retour sur le support magnétique pendant 2 min à des billes distinctes de la mémoire tampon de remise en suspension. Retirer le tampon de remise en suspension (produit Fin de réparation est remis en suspension dans le tampon Resuspension maintenant) dans un tube de PCR clean. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Ajouter 12,5 pi A-tailing mélange dans le tube PCR contenant le produit Fin de réparation et mélanger soigneusement. </li&gt; <li> Incuber le tube PCR à 37 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (37 ° C) avec un couvercle pré-chauffé à 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptateur ligature <ol><li> Ajouter 2,5 pi de tampon de remise en suspension, 2,5 pi de mélange de ligature, et 2,5 pi Index adaptateur ADN dans la réaction de A-tailing. </li><li> Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minG dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C. </li><li> Ajouter 5 ul arrêt Tampon ligature dans chaque réaction et mélanger soigneusement. </li><li> Mélanger 42,5 billes magnétiques ul bien mélangés pour nettoyer la réaction suivante étapes 2.1.1.5 à 2.1.1.8. Ajouter 50 ul Resuspension tampon pour éluer le produit de l&#39;adaptateur ligaturé. </li><li> Nettoyez le produit de l&#39;adaptateur ligaturé pour une deuxième fois en utilisant 50 ul bien mélangés perles AMPure XP, et on élue le produit en 25 tampon Resuspension ul dans un tube propre PCR. </li></ol> 2.1.4) Fragments amplifier l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 5 ul PCR Primer Cocktail et 25 pi PCR Master Mix au tube PCR contenant le produit de l&#39;adaptateur ligaturé et bien mélanger. </li><li> Effectuer une amplification dans un thermocycleur préprogrammée avec les conditions suivantes: 98 ° C pendant 30 s; 10 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s; puis 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 10 ° C. </li><li> Nettoyer la réaction en utilisant 50 pi de billes magnétiques bien mélangés, et éluer le produit final dans 30 ul de tampon de remise en suspension. </li></ol> 2.1.5) Bibliothèque de validation <ol><li> Quantifier le produit final avec un fluoromètre en utilisant le protocole du fabricant. Concentration finale de bibliothèque est comprise entre 2,5 à 20 ng / ul. </li><li> Évaluer la qualité du produit final en utilisant un instrument d&#39;analyse de l&#39;ADN avec puce haute sensibilité selon le protocole du fabricant. Attendez-vous à une seule bande avec la taille attendue pour soit IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected taille de la bibliothèque produit correspond à la taille de l&#39;amplicon de VDJ original et de la taille des adaptateurs (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR et séquençage Bibliothèque Pooling <ol><li> Calculer la molarité de chaque fraction bibliothèque en utilisant la formule suivante: nM = [(ng / 1,000) / 660 pb *] x 10 9 où ng est la concentration de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l&#39;étape 2.1.5.1 pb et est le pic taille de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l&#39;étape 2.1.5.2. </li><li> Diluer la bibliothèque à 2 nM (10 pi au total) avec de l&#39;eau exempte de DNase. </li><li> On combine les 10 ul de 2 nM de bibliothèques dilué ensemble dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter un volume égal de contrôle de pointe dans PhiX dans le tube de 1,5 ml. </li><li> Chargez la piscine à une concentration de 7 pM sur une cuve à circulation. </li><li> Séquencer les bibliothèques en utilisant un séquenceur couplé à cycle de gamme 150 selon le protocole du fabricant. </li></ol> Analyse des données 3. Remarque: Un summAry des scripts de bioinformatique utilisés dans cette section peut être trouvé comme un fichier de code supplémentaire. 3.1) Alignement et QC <ol><li> Carte jumelé fin séquençage lit contre un IGH V humaine, D et base de données de région J téléchargé à partir du site web de IMGT 11 en utilisant un algorithme BLAST nucléotidique adaptée basée sur &#39;blastn&#39; disponibles à partir de NCBI avec écart pénalité d&#39;ouverture de 2, l&#39;écart pénalité d&#39;extension de 1, longueur de mot de 7, et le seuil de 10 -4 e-valeur. Jeter la paire lu ne correspond pas à la fois un IGH V et une région J. </li><li> Comptez le nombre de paires de lire restants qui ont IGH V et J correspondances pour obtenir les fréquences de correspondant combinaisons de VJ travers tous lu paires obtenues à partir de la course de séquençage sur l&#39;échantillon. Comptez une lecture paire si elle est mappée à la fois un IGH V et J gène, puis ajouter son allèle le compte correspondant pour la combinaison de VJ particulier. </li><li> Classez les chiffres pour chaque région VDJ recombiné obtenu à partir de 3.1.2 de la hauteEst au plus bas. La région VDJ a le plus haut lectures comptage est définie comme la combinaison majeure de réarrangement. </li><li> Jeter séquences alignées qui couvrent moins de 35% du domaine réarrangement majeur identifié dans 3.1.3. </li></ol> 3.2) Profil SHM identification <ol><li> Comptez tous les modèles SHM à travers le lit de l&#39;étape 3.1.3. Définissez chaque modèle SHM comme un sous-clone. </li><li> Comptez le nombre de sous-clones qui sont correspondant à différents modèles uniques SHM, et le nombre de lectures qui sont mis en correspondance avec des sous-clones individuels. </li></ol> 3.3) représentation graphique des résultats <ol><li> Effectuer l&#39;analyse phylogénétique sur les sous-clones en utilisant leurs modèles SHM correspondants en utilisant un quartier méthode de package R &quot;singe&quot; d&#39;assemblage selon le protocole du fabricant. Calculer une matrice de distances à partir des alignements distincts individuels pour recréer la phylogénie de sous-clone ancrée à la séquence de la lignée germinale du VJ combinaison en question pour chaque ensemble de l&#39;échantillon apparié. </li><li> Utilisation de la séquence nucléotidique de chaque sous-clone en tant que vecteur de caractères et de calculer la distance de chaîne approximative entre tous les sous-clones dans la majeure réarrangement VJ à la fois pour le diagnostic et des échantillons de rechute correspondants en utilisant une mesure de distance de Levenshtein où mathématiquement la distance entre deux alignements est donné par d x, y (i, j) où d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j et 0 sinon, puis additionner cette fonction sur la longueur de la chaîne correspondant à des séquences nucléotidiques I et J. </li><li> Afficher graphiquement la matrice résultant des distances de sous-clone et le nombre de leurs sous-clone correspondantes dans les deux façons suivantes: <ol><li> Utilisez le paquet R &quot;masse&quot;, selon le protocole du fabricant d&#39;appliquer analyse multidimensionnelle à la matrice de distance de sous-clone et de générer un principe à deux dimensions coordonnées de carte, qui est ensuite tracée avec le logarithmesubclonal de chiffres que le rayon du cercle. </li><li> Construire un graphe non orienté sur la base de la distance de Levenshtein, où les sommets correspondent à chaque sous-clone distinct provenant de la majeure réarrangement VJ. Remarque: Si la distance entre deux clones distincts est égal à un, alors il existe une arête entre ces deux sommets. Si la distance est supérieure à un, alors il n&#39;y a pas de bord en les reliant. </li><li> Le graphique du 3.3.3.2 en utilisant la fonction de tkplot dans le package de R &quot;IGRAPH&quot; avec la mise en page Kamada Kawai selon le protocole du fabricant. Le rayon des sommets est proportionnelle à la racine cubique du nombre total de clones mis en correspondance avec elle et l&#39;ombrage utilise une gamme rouge et bleu pour indiquer que la proportion de clones qui soit font partie du diagnostic (bleu) ou de rechute (rouge) échantillons . </li></ol></li></ol> 3.4) Hétérogénéité (entropie) Mesure <ol><li> Examiner les numéros et les chiffres de sous-clone de lamotifs individuels de mutations somatiques se produisent dans la majeure réarrangement VJ pour chaque ensemble d&#39;échantillons appariés. </li><li> Calculer l&#39;entropie empirique et entropie empirique résiduelle ajusté pour le nombre de clones distincts dans chaque échantillon en utilisant l&#39;estimation de l&#39;entropie en fonction histogramme standard. </li></ol>

<ol><li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li>
<li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li>
<li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35(2014).</li>
<li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+immunology%22%5BJournal%5D)">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li>
<li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li>
<li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li>
<li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma%3A+clinical+characteristics+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li>
<li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li>
<li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li>
<li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+%3A+methods+for+querying+IMGT+databases%2C+tools%2C+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432(2014).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

En raison du nombre pratiquement illimité d&#39;itérations de l&#39;information de séquence codée par réarrangement VDJ et SHM au locus IGH des cellules B humaines, l&#39;examen de l&#39;ensemble IGH répertoire en haut débit profond séquençage avéré être un moyen efficace et complet pour délimiter clonale et les populations de cellules B sous-clones. De plus, cette stratégie peut être utilisée pour étudier la trajectoire de l&#39;évolution clonale de développement des cellules B de la tumeur, la rémission, rechute et en...

Le cancer est une maladie clonale. Depuis, il ya trente ans, lorsque Peter C. Nowell a proposé le cancer clonale modèle d&#39;évolution 1, de nombreuses études ont tenté de disséquer populations clonales dans les échantillons de tumeurs et de reconstruire les modèles d&#39;expansion et l&#39;évolution clonale qui sous-tendent le processus de tumorigenèse 2. Récemment, le séquençage du génome entier a permis aux enquêteurs de prendre un regard profond sur l&#39;hétérogénéité et l&#39;évolution clonale 3,4. Toutefois, en raison de l&#39;absence de marqueurs traitables dans de nombreux types de cellules, il est difficile d&#39;en déduire l&#39;architecture clonale chemin précis et évolutif. Heureusement, il est un marqueur de clonalité naturelle dans les cellules B matures à partir de laquelle de nombreuses tumeurs malignes lymphoïdes, y compris DLBCL, sont originaires. En réponse à la stimulation antigénique, chaque cellule B peut former une séquence productive seule IgH VDJ en rejoignant un V H (variable), un D (diversité), et un J H (rejoindre) le segment ensemble à partir d&#39;une grande piscine de ces segments. Au cours de cette prPROCESSUS, de petites portions de la séquence d&#39;origine peuvent être supprimés et les nucleotides non basés sur des modèles supplémentaires peuvent être ajoutées pour créer un réarrangement VDJ unique. Ce réarrangement VDJ spécifique peut être hérité dans toute la descendance de cette cellule B, marquage donc lymphocytes B matures individuelle et sa progéniture 5. En outre, SHM se produit sur ​​les séquences VDJ recombinés dans le centre germinatif (GC) réaction ultérieure pour introduire des mutations supplémentaires pour l&#39;expansion de la piscine de l&#39;anticorps et la mise en valeur des anticorps d&#39;affinité 6. Par conséquent, en comparant et contrastant VDJ SHM et des motifs d&#39;échantillons de lymphome qui ont subi ces procédés, l&#39;hétérogénéité intra-tumorale pourrait être délimitée et voie d&#39;évolution clonale de la maladie peut être déduite. Auparavant, le réarrangement VDJ et SHM pourraient être identifiés par amplification par PCR les régions recombinés, le clonage des produits de PCR, puis séquençage de Sanger pour obtenir des informations de séquence. Cette approche is à faible débit et faible rendement, récupérer seulement une très petite partie de l&#39;ensemble du répertoire de VDJ recombiné, et d&#39;entraver la caractérisation de la représentation globale de la population clonale dans un échantillon donné. Une approche modifiée a été créée en générant END indexés bibliothèques de séquençage de produits PCR et VDJ effectuer PE séquençage 2x150 pb pour obtenir plus d&#39;un demi-million de séquences VDJ recombinées par échantillon. En outre, un pipeline personnalisé a été développé pour effectuer un contrôle de qualité (QC), aligner, séquençage filtre VDJ lit d&#39;identifier réarrangements et SHM de chaque lecture, et effectuer une analyse phylogénétique sur l&#39;architecture clonale de chaque échantillon. En outre, une nouvelle approche a été établi afin de mieux caractériser les modèles de l&#39;évolution clonale pour les échantillons prélevés à divers stades de la maladie. Nous avons appliqué cette technique à des échantillons de patients DLBCL. LMNH-B est une forme agressive de lymphome non hodgkinien à la rechute fréquente dans près d&#39;un eIRD des patients 7. Rechutes surviennent normalement DLBCL début, dans les 2 à 3 ans suivant le diagnostic initial, bien que certains ne se produisent après 5 ans 8. Pronostic pour les patients en rechute est faible, avec seulement 10% la réalisation de trois années de survie sans progression due à des options de traitement limitées. Ceci est la base de la nécessité urgente de nouvelles approches pour traiter DLBCL rechute 9,10. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la rechute LMNH-B sont encore largement inconnu. En particulier, le rôle de l&#39;hétérogénéité clonale au moment du diagnostic et l&#39;évolution clonale au cours du développement de rechute LMNH-B sont actuellement non caractérisé, ce qui rend difficile de définir un biomarqueur précis et plus utile pour prédire une rechute. Pour répondre à ces questions, nous avons appliqué notre approche VDJ-séquençage sur plusieurs paires de paires d&#39;échantillons de diagnostic LMNH-rechute primaire appariés. Deux scénarios évolutifs clonales distinctes de rechute ont émergé de la comparaison des architectures clonales entre le diagnostic et le samp rechuteles mécanismes moléculaires qui suggère multiples peut être impliqué dans DLBCL rechute.

<table><tbody><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot ; Cl, pH 8,0 ; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Xylènes</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Protéinase K&nbsp ;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Mélange de solution de désoxynucléotide triphosphate (dNTP)</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM chaque nucléotide</td></tr><tr><td>10x Tampon PCR&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>sans MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA polymérase avec tampon d’or et Technonogies MgCl2</td><td>Life</td><td>4311806</td><td>50 &micro ; l à 5 U/&micro ; l</td></tr><tr><td>Échelle de contrôle de la taille de l’échantillon</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp ;</td><td>2-096-0020</td><td>33 réactions</td></tr><tr><td>IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Détection de gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp ;</td><td>5-101-0030</td><td>33 réactions, Mélange 2 pour la détection IGVHFR1</td></tr><tr><td>Essai de clonalité génique IGH - Détection de gel</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp ;</td><td>1-101-0020</td><td>33 réactions, Tube B pour la détection IGVHFR2</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA polymérase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro ; l à 5 U/&micro ; l</td></tr><tr><td>10X tampon Tris-Borate-EDTA (TBE)</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE BUFFER&nbsp ; &nbsp ;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Solution de bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 pb Échelle d’ADN Life Technologies</td><td></td><td>10597011</td><td>1 & micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>100 pb Échelle d’ADN Life Technologies</td><td></td><td>15628-019</td><td>1 & micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40 % Acrylamide/Bis</td><td>Solution Bio-Rad</td><td>Laboratories 1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 colonnes</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de dosage haute sensibilité</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Kit ADN haute sensibilité</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluoromètre</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de remise en suspension (Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Mélange</td> de réparation d’extrémité Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Mélange</td> de résidus A Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Mélange</td> de ligature Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Indice d’adaptateur d’ADN (Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Tampon</td> d’arrêt de ligature Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td>Cocktail d’amorces PCR <td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Mélange</td> maître PCR Illumina <td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>(Kit de préparation d’échantillons d’ADN Illumina TruSeq v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: analyse en profondeur de séquençage de rearranged immunoglobuline chaîne lourde gene à révéler des modèles clonale évolution de b lymphome

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Clonalité tumeur compréhension est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués dans la tumorigenèse et progression de la maladie. En outre, la compréhension des changements de composition de clones qui se produisent dans une tumeur en réponse à certains micro-environnement ou traitements peut conduire à la conception d&#39;approches plus sophistiquées et efficaces pour éradiquer les cellules tumorales. Cependant, le suivi des tumeurs sous-populations clonales a été difficile en raison du manque de marqueurs distinguables. Pour résoudre ce problème, un protocole VDJ-seq a été créé pour suivre les tendances de l&#39;évolution clonale de lymphome à grandes cellules B (LMNH-B) rechute diffuse en exploitant recombinaison VDJ et hypermutation somatique (SHM), deux caractéristiques uniques de lymphomes à cellules B. Dans ce protocole, le séquençage de prochaine génération (NGS) bibliothèques ayant un potentiel d&#39;indexation ont été construits à partir amplifié immunoglobuline réarrangé chaîne lourde (IgH) région VDJ de paires de diagnostic primaire et de rechute samp DLBCLles. En moyenne, plus de la moitié millions séquences VDJ par échantillon ont été obtenus après le séquençage, qui contiennent à la fois réarrangement VDJ et informations SHM. En outre, les pipelines bioinformatiques personnalisés ont été développés pour utiliser pleinement l&#39;information de séquence pour la caractérisation des IgH-VDJ répertoire au sein de ces échantillons. En outre, le pipeline permet la reconstruction et la comparaison de l&#39;architecture clonale de tumeurs individuelles, ce qui permet l&#39;examen de l&#39;hétérogénéité clonale dans les tumeurs de diagnostic et de déduction de motifs de l&#39;évolution clonale entre le diagnostic de tumeurs et des paires de rechute. Lors de l&#39;application de cette analyse à plusieurs paires diagnostic-rechute, nous avons découvert des preuves essentielles que de multiples tumeurs distinctif des modèles évolutifs pourraient conduire à DLBCL rechute. En outre, cette approche peut être étendu à d&#39;autres aspects cliniques, tels que l&#39;identification de la maladie résiduelle minimale, le suivi des progrès de la rechute et la réponse au traitement, et l&#39;enquête de repertoire immunitairees dans des contextes non-lymphome.

La procédure globale de séquençage VDJ (VDJ-seq), y compris l&#39;extraction d&#39;ADN, recombiné VDJ région d&#39;amplification et de purification, la construction de la bibliothèque de séquençage, lit le traitement et l&#39;analyse phylogénétique, est représenté sur la figure 1. Régulièrement 5-200 pg d&#39;ADN peut être extrait à partir de coupes de tissus congelés ou solide 0,5-20 ug d&#39;ADN à partir de coupes de tissus inclus en paraffine fixés au formol. En fonction de la qualit...

Ce protocole décrit une approche permettant d’interroger les régions VDJ recombinées de la chaîne lourde d’immunoglobulines des lymphomes par séquençage profond et de récupérer le réarrangement VDJ et l’état d’hypermutation somatique pour délimiter l’architecture clonale de la tumeur individuelle. La comparaison de l’architecture clonale entre le diagnostic apparié et les échantillons de rechute révèle les modes d’évolution clonale du lymphome.

VDJ-Seq: Analyse en profondeur de séquençage de Rearranged immunoglobuline chaîne lourde Gene à révéler des modèles clonale évolution de B Lymphome

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser la composition clonale d'échantillons de lymphome afin d'identifier les schémas d'évolution clonale lors d'une rechute de lymphome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du lymphome, telles que la manière dont les tumeurs en rechute proviennent des tumeurs initiales. Le principal avantage de ce protocole réside dans son adaptation des dernières technologies de séquençage à haut débit, permettant ainsi une cartographie plus complète des caractéristiques communes aux lymphomes.Dans ce protocole, l'ADN sera extrait de sections minces de tissus normaux ou malins inclus dans du OCT congelé ainsi que dans du paraffine fixé et formé. Pour extraire l'ADN à partir de tissus inclus dans du OCT congelé, digérer d'abord 10 à 30 sections minces dans quatre millilitres de tampon de lyse nucléique contenant de la protéase K et du SDS à 0,625 %, dans un bain-marie à 37 °C pendant toute la nuit. Le jour suivant, ajouter un millilitre de chlorure de sodium saturé à cinq molar au mélange de digestion et agiter vigoureusement pendant 15 secondes, puis centrifuger à 1 100 ×g pendant 15 minutes.À température amb

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