VDJ-Seq: Analyse en profondeur de séquençage de Rearranged immunoglobuline chaîne lourde Gene à révéler des modèles clonale évolution de B Lymphome

L'objectif général de cette procédure est de caractériser la composition clonale d'échantillons de lymphome afin d'identifier les schémas d'évolution clonale lors d'une rechute de lymphome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du lymphome, telles que la manière dont les tumeurs en rechute proviennent des tumeurs initiales. Le principal avantage de ce protocole réside dans son adaptation des dernières technologies de séquençage à haut débit, permettant ainsi une cartographie plus complète des caractéristiques communes aux lymphomes.

Dans ce protocole, l'ADN sera extrait de sections minces de tissus normaux ou malins inclus dans du OCT congelé ainsi que dans du paraffine fixé et formé. Pour extraire l'ADN à partir de tissus inclus dans du OCT congelé, digérer d'abord 10 à 30 sections minces dans quatre millilitres de tampon de lyse nucléique contenant de la protéase K et du SDS à 0,625 %, dans un bain-marie à 37 °C pendant toute la nuit. Le jour suivant, ajouter un millilitre de chlorure de sodium saturé à cinq molar au mélange de digestion et agiter vigoureusement pendant 15 secondes, puis centrifuger à 1 100 ×g pendant 15 minutes.

À température ambiante, transférez le surnageant dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Ajoutez deux volumes d'éthanol à 100 %, puis mélangez en renversant le tube de six à huit fois. Centrifugez à 5 000 ×g pendant 60 minutes à 4 °C. Pour récupérer l'ADN précipité, lavez le culot d'ADN deux fois avec de l'éthanol à 70 %, en centrifugeant à 5 000 ×g pendant 15 minutes à chaque fois.

Pour recueillir le culot, dissoudre le culot d'ADN dans 100 à 400 microlitres de tampon TE à température ambiante, en agitant pendant la nuit, afin d'extraire l'ADN à partir de minces sections de tissu fixé au formol et inclus en paraffine. Éliminer d'abord la paraffine en incubant les sections de paraffine dans un millilitre de xylène deux fois, à température ambiante, pendant 10 minutes à chaque fois. Recueillir les sections de tissu par centrifugation à 13 000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, éliminer les résidus d'éthène en incubant les sections dans un millilitre d'éthanol à 100 % deux fois à température ambiante pendant 10 minutes à chaque fois. Récupérer les sections de tissu par centrifugation à 13 000 ×g pendant cinq minutes. À température ambiante, sécher les sections à l'air pendant 10 à 15 minutes.

Ajouter une solution fraîchement préparée de protéase K aux échantillons dans un volume final de 50 à 100 microlitres et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius le jour suivant. Chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour inactiver la protéinase K. Le rendement en ADN des extractions présentées dans le segment précédent est de cinq à 200 microgrammes selon la taille du tissu.

L'étape suivante consiste à évaluer la qualité de chaque échantillon d'ADN dans un mélange en tube PCR. Ajoutez 25 microlitres de polymérase TDNA à 45 microlitres de mélange maître provenant d'un kit commercial de marqueur moléculaire. Ajoutez cinq microlitres d'ADN dans le tube PCR et mélangez soigneusement en aspirant et expulsant au moins cinq fois à l'aide d'une pipette.

Amplifiez l'ADN en suivant les conditions détaillées dans le texte du protocole. Ensuite, mélangez 20 microlitres de la réaction PCR avec quatre microlitres de colorant de charge six x et chargez sur un gel d'agarose à 2 %. Une fois l'électrophorèse terminée, colorez le gel d'agarose avec du bromure d'éthidium et détectez les produits PCR.

Les échantillons produisant cinq produits de PCR de tailles égales à 100, 200, 300, 400 et 600 paires de bases seront utilisés uniquement pour générer des amplicons VDJ, à l’aide d’un système d’imagerie de gel. L’amplification du segment réarrangé I-G-H-V-D-J à partir de la région cadre un ou IGV HFR un sera démontrée dans cette vidéo. L’amplification du segment réarrangé I-G-H-B-D-J à partir de la région cadre deux suit une procédure similaire et est décrite dans le texte du protocole dans un mélange en tube PCR.

45 microlitres de mélange maître provenant du tube intitulé mix deux d'un kit commercial de détection de l'HYPERMUTATION somatique IGH pour dosage par électrophorèse, 25 microlitres de polymérase TAC ADN et 5 microlitres d'ADN d'échantillon permettent d'amplifier l'ADN selon les conditions décrites dans le texte du protocole. Pour amplifier dans des conditions ADN-PCR sous optimales, les paramètres peuvent être ajustés en prolongeant le temps d'hybridation ou en augmentant le nombre de cycles d'amplification. Séparer l'ensemble des produits de PCR par électrophorèse sur un gel d'AGAROSE à 2 %, colorer le gel d'AGAROSE avec une solution de bromure d'ETHIDIUM à 0,5 microgramme par millilitre et détecter les produits de PCR.

À l'aide d'un système d'imagerie de gel, on s'attend à un amplicon monoclonal dont la taille se situe entre 310 et 380 paires de bases. Excisez la portion du gel contenant l'amplicon monoclonal. Ensuite, purifiez l'ADN du gel excisé en utilisant un kit standard de purification sur gel, conformément au protocole du fabricant.

Pour commencer cette procédure, transférez le produit purifié V-D-J-P-C-R dans un tube PCR et ajoutez le tampon de resuspension du kit de préparation d'échantillons d'ADN afin d'ajuster le volume à 60 microlitres. Ajoutez 40 microlitres du mélange de réparation des extrémités provenant du kit de préparation d'échantillons d'ADN, mélangez soigneusement, puis incubez la réaction à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé avec un couvercle préchauffé à 100 degrés Celsius. Ensuite, mélangez 136 microlitres de billes magnétiques et 24 microlitres d'eau de qualité PCR dans un tube de 1,5 millilitre, puis transférez l'intégralité de la réaction de réparation des extrémités dans ce tube et mélangez bien avec la solution de billes.

Placer les tubes sur un support magnétique pendant deux minutes afin de permettre la séparation des billes de la solution. Aspirer le surnageant et laver les billes deux fois avec de l'éthanol à 80 % fraîchement préparé. Éliminer complètement la solution d'éthanol et laisser les billes sécher à l'air pendant 15 minutes à température ambiante.

Après 15 minutes, retirez les tubes du support magnétique et remettez en suspension les billes dans 17,5 µL de tampon de resuspension (Resus Suspension Buffer). Replacez les tubes sur le support magnétique pendant deux minutes afin de séparer les billes du tampon de resuspension. Transférez le tampon de resuspension, qui contient maintenant le produit de réparation des extrémités, dans un tube PCR propre.

L'étape suivante consiste à ajouter une queue a au produit de réparation des extrémités. Ajoutez 12,5 microlitres du mélange d'ajout de queue a dans le tube PCR contenant le produit de réparation des extrémités et mélangez soigneusement. Incubez les tubes PCR à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé avec un couvercle préchauffé à 100 degrés Celsius.

Pour la ligation de l'adaptateur, ajouter 2,5 µL de tampon de resuspension Resus, 2,5 µL de mélange de ligation et 2,5 µL d'index d'adaptateur d'ADN dans la réaction de taillage. Incuber la réaction à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé muni d'un couvercle préchauffé à 100 degrés Celsius. Après 30 minutes, ajouter 5 µL de tampon d'arrêt de la ligation dans chaque réaction et mélanger soigneusement.

Ajouter 42,5 µL de billes magnétiques bien mélangées à chaque réaction et laver avec de l'éthanol à 80 %, comme indiqué précédemment. Ajouter 50 µL de tampon de resuspension Resus pour éluer le produit ligaturé à l'adaptateur. Nettoyer le produit ligaturé à l'adaptateur une deuxième fois en utilisant 50 µL de billes Ampu XP bien mélangées et éluer le produit dans 25 µL de tampon de resuspension Resus dans un tube PCR propre.

Pour amplifier l'amplicon VDJ, ajouter cinq microlitres de cocktail d'amorces de PCR et 25 microlitres de mélange maître de PCR dans le tube de PCR contenant le produit ligaturé à l'adaptateur, puis mélanger soigneusement. Réaliser l'amplification dans un thermocycleur avec les conditions décrites dans le texte du protocole. Une fois l'amplification terminée, purifier la réaction à l'aide de 50 microlitres de billes magnétiques bien mélangées, puis éluer le produit final dans 30 microlitres de tampon Resus. La bibliothèque d'amplicons VDJ est ensuite validée, regroupée et séquencée comme décrit dans le texte du protocole.

Étant donné que la complexité de la bibliothèque de séquençage VVG est faible, nous recommandons d'ajouter un pourcentage de 20 à 50 % de FI specing dans les échantillons de séquençage approuvés afin de permettre un appel de base précis. Ces images représentatives de gel montrent les produits d'amplicon V-D-J-P-C-R obtenus à partir d'ADN extrait d'échantillons sanguins de patients atteints de lymphome. La qualité de l'amplicon V-D-J-P-C-R avant et après la construction de la bibliothèque a été évaluée à l'aide d'un bioanalyseur.

Le décalage de taille de 334 paires de bases à 459 paires de bases indique l'ajout de l'adaptateur permettant de suivre l'évolution clonale d'un cas de rechute de lymphome diffus à grandes cellules B. Une analyse phylogénétique des profils de mutation somatique hypermutée, ou SHM, des réarrangements majeurs VDJ de la chaîne lourde entre les échantillons de diagnostic et de rechute a été réalisée.

Le mode d'évolution clonale divergente tardive a été observé. De nouvelles méthodes graphiques ont été mises au point pour visualiser l'évolution clonale. Les profils présentés sont des graphiques de l'échelonnement multidimensionnel d'un modèle de rechute divergent tardif et d'un modèle de rechute divergent précoce.

Le rayon de chaque cercle indique le nombre de sous-clones correspondant à un profil spécifique de mutations somatiques hyperfréquentes (SHM). Le bleu correspond à l'échantillon de diagnostic, et le rouge à l'échantillon de rechute. De même, les graphes non orientés montrent que la répartition des effectifs des sous-clones dans le cas d'une divergence tardive diffère de celle du cas d'une divergence précoce.

Les arêtes correspondent à deux profils de MHS présentant une distance de séparation d'une lettre, et l'échelle de couleur indique la proportion de séquences associées à un profil de MHS particulier, correspondant à l'échantillon de diagnostic rouge ou à l'échantillon de rechute jaune. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'éviter les contaminations croisées entre les échantillons. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer l'authenticité des échantillons tumoraux de lymphome.

Cette approche peut également être utilisée pour suivre la maladie résiduelle minérale et analyser la réponse de la surveillance immunitaire aux cancers. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.