Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

L'objectif général de cet article vidéo est d'isoler des mitochondries de haute qualité à partir de faibles quantités de muscle squelettique de souris, destinées à être utilisées dans des tests tric basés sur des microplaques. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés en recherche biomédicale, notamment à décrire comment certains médicaments et protéines modulent la consommation d'oxygène mitochondriale dans le muscle squelettique. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que des mitochondries de haute qualité peuvent être isolées à partir de quantités plus faibles de muscle squelettique de souris que celles rapportées précédemment.

Procéder à l'euthanasie de la souris conformément aux directives de l'établissement. Ensuite, placer la souris sur le côté et utiliser des ciseaux fins pour pratiquer une incision dans la peau recouvrant l'épicondyle latéral du fémur.

Détacher la peau en direction de la souris, puis retirer le bourrelet adipeux situé au-dessus du point d'origine du quadriceps. Ensuite, couper le tendon du quadriceps attaché à la rotule. Couper lentement l'aponévrose entre l'os et le quadriceps en évitant l'artère fémorale.

Ensuite, couper le tendon au point d'insertion sur le fémur afin de libérer le muscle quadriceps et placer le muscle quadriceps dans du PBS refroidi. Retirer tout tissu adipeux visible recouvrant le quadriceps à l’aide d’une paire de ciseaux. Une fois nettoyé, retourner le quadriceps de manière à ce que la partie du muscle qui se trouvait au-dessus du fémur soit orientée vers le haut.

Ouvrir le muscle quadriceps avec une pince en effectuant un mouvement en éventail. Retirer les deux portions musculaires rouges visibles de chaque lobe et les placer dans un bécher contenant cinq millilitres de tampon de purification des mitochondries fraîchement refroidi.

Ensuite, inciser la peau recouvrant le tendon d'Achille à l'aide de ciseaux fins et détacher la peau vers la partie proximale de la souris. Couper le tendon d'Achille exposé et décoller le muscle vers le corps de la souris. Sectionner le tendon aux condyles latéral et médial du fémur afin de libérer le muscle gastrocnémien, puis placer le gastrocnémien encore attaché à ses tendons dans une boîte remplie de PBS glacé.

Retournez le muscle gastrocnémien et retirez le muscle soléaire. Placez le muscle soléaire dans le bécher contenant cinq millilitres de tampon de purification de mitochondries froid.

Un ventilateur a ensuite ouvert le gastrocnémien et retiré les trois portions visibles de muscle rouge. Il y aura deux portions latérales et une bande superficielle rouge médiale. Une fois isolé, transférez le muscle rouge dans le bécher contenant cinq millilitres de mitochondries fraîches.

Tampon d'isolement un. Retirer un autre 75 à 100 milligrammes de muscle rouge de l'autre jambe de la souris. Répéter le processus précédemment montré.

Placer le muscle disséqué du deuxième membre dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant le mélange d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase ainsi que le tampon de lyse cellulaire préparés comme décrit dans le protocole accompagnant. Congeler immédiatement par trempe dans l'azote liquide le deuxième échantillon en vue de son utilisation en immunobuvardage. Placer une surface en plastique plate préalablement refroidie sur de la glace dans un grand seau.

Ensuite, versez une goutte de tampon d'isolement des mitochondries sur la surface en plastique, puis utilisez une pince pour placer tous les fragments de muscle rouge dans une goutte de tampon d'isolement. Hachez le tissu musculaire pendant deux minutes à l’aide de lames de rasoir à tranchant unique, en changeant pour une lame neuve et affûtée toutes les 40 secondes. Transférez le tissu haché dans un nouveau bécher contenant cinq millilitres de tampon frais pour mitochondries.

Tampon d'isolement un. Ensuite, prenez la solution et faites-la passer à travers un tamis cellulaire de 100 microns, placé sur un tube conique de 50 millilitres. Étampez le tissu avec un essuie-tout délicat, puis transférez-le dans cinq millilitres d'une solution de 0,05 % de tryine.

Utilisez une pince pour retirer tout tissu restant du chiffon de travail et ajoutez-le à la trypsine. Incubez le tissu musculaire dans la solution de trypsine sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l'échantillon à 200 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, versez le surnageant de trypsine dans un récipient pour déchets et resuspendez le culot avec trois millilitres de tampon d'isolement des mitochondries numéro un, préalablement refroidi sur glace. Transférez ensuite le tissu dans un tube d'homogénéisateur en verre de 45 millilitres. Rincez le tube conique de 15 millilitres avec 1,5 millilitre supplémentaire de tampon d'isolement des mitochondries numéro un afin de récupérer l'échantillon résiduel et ajoutez ce rinçage au tube d'homogénéisateur en verre.

Ensuite, placez le tube en verre du homogénéisateur dans un bécher ou un récipient en plastique rempli à moitié de glace, de sorte que le tube en verre bouge le moins possible à l'intérieur du bécher. Homogénéisez l'échantillon à l'aide d'un pilon en tétrafluoroéthylène polymérisé fixé à un homogénéisateur tissulaire motorisé.

Homogénéisateur réglé à 10 à 80 tr/min. Maintenir le fond pour chaque passage pendant environ deux secondes. Transférer ensuite l'homogénat de tissu dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Et rincez le tube du homogénéisateur en verre avec 6,5 millilitres de tampon d'isolement des mitochondries un. Versez le tampon dans le tube conique de 15 millilitres contenant le reste du tissu homogénéisé. Faites centrifuger l'échantillon à 700 ×g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, puis versez délicatement le surnageant dans un tube à centrifuger en verre résistant et jetez le culot.

Ensuite, centrifugez le surnageant à 8 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour faire précipiter les mitochondries, retirez le surnageant et resuspendez le culot en ajoutant lentement 500 microlitres de tampon d'isolement des mitochondries deux, coupez l'extrémité d'une pipette et homogénéisez délicatement le culot dans le tampon à l'aide de mouvements de mélange et d'agitation. Ajoutez ensuite 4,5 millilitres supplémentaires de tampon d'isolement des mitochondries.

Ajouter le tampon deux au mélange. Une fois que le culot est complètement resuspendu, centrifuger l'homogénat à 8 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin de recueillir à nouveau les mitochondries par centrifugation. Éliminer le surnageant S et resuspendre délicatement mais complètement le culot en ajoutant 25 microlitres de tampon d'isolement des mitochondries par incréments de 25 microlitres, en utilisant une pipette dont l'embout a été coupé. Mélanger doucement le culot après chaque ajout de 25 microlitres de tampon à l’aide d’un léger mouvement de rotation.

Lorsque c'est terminé, placez ce stock de mitochondries sur de la glace. Préparez deux dilutions séparées, d'un à vingt, du stock de mitochondries dans de l'eau de haute pureté. Ajoutez 0,1 % de Triton 100 x à un échantillon et soniquez pendant 10 secondes à faible puissance.

Laissez l'autre dilution sur de la glace et remettez l'échantillon soniqué sur de la glace. Après la sonication, effectuez un dosage de la citrate synthase avec la dilution mitochondriale non soniquée et soniquée à l’aide d’un dosage photométrique en utilisant des techniques standard, puis déterminez le pourcentage de membranes mitochondriales intactes en utilisant les équations fournies dans le protocole de texte accompagnant. La sonication des mitochondries entraîne une augmentation statistiquement significative de l'activité de la citrate synthase.

L'activité de la citrate synthase dans les échantillons mitochondriaux non soniqués par rapport aux échantillons soniqués montre que 92,5 % des mitochondries étaient intactes après l'isolement. L'expression de GA DH et de COX4 est visible dans le lysat total de tissu ; dans les mitochondries isolées, l'expression de COX4 est observée, tandis que seules des bandes faibles de GA DH sont visibles. Ces résultats indiquent un bon isolement des mitochondries, avec peu de contamination par des composants non mitochondriaux durant la procédure d'isolement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler le stock mitochondrial avec précaution, sans jamais le vortexer ni le mélanger vigoureusement après cette étape. D'autres méthodes, telles que la mesure de la production d'espèces réactives, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, par exemple si une intervention influence la production d'espèces réactives de l'oxygène dans les mitochondries isolées.