Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

L’objectif général de cet article vidéo est d’isoler des mitochondries de haute qualité à partir de petites quantités de muscle squelettique de souris pour les utiliser dans des tests triques basés sur des microplaques. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans la recherche biomédicale, telles que la description de la façon dont certains médicaments et protéines modulent la consommation d’oxygène des muscles squelettiques et mitochondriaux. Le principal avantage de cette technique est que des mitochondries de haute qualité peuvent être isolées à partir de plus petites quantités de muscle squelettique de souris que ce qui a été rapporté précédemment.

Effectuer l’euthanasie de la souris conformément aux directives de l’établissement. Positionnez ensuite la souris sur le côté et utilisez des ciseaux à pointe fine pour faire une incision dans la peau. Recouvrant l’épicondyle latéral du fémur.

Pelez la peau vers la souris, puis retirez le coussinet graisseux positionné sur le point d’origine du quadriceps. Ensuite, coupez le tendon du quadriceps qui est attaché à la rotule. Coupez lentement l’aponévrose entre l’os et le quadriceps tout en évitant l’artère fémorale.

Ensuite, coupez le tendon au point d’origine sur le fémur pour libérer le muscle quadriceps et placez le muscle quadriceps dans du PBS réfrigéré. Retirez tout tissu adipeux visible sur le quadriceps à l’aide d’une paire de ciseaux. Une fois propre, retournez le quadriceps de sorte que la partie du muscle qui retrouvait le fémur soit tournée vers le haut.

Ouvrez le muscle quadriceps avec une pince dans un mouvement d’éventail. Retirez les deux parties musculaires rouges visibles de chaque lobe et placez-les dans un bécher contenant cinq millilitres de mitochondries réfrigérées. Tampon d’isolement.

Ensuite, coupez la peau recouvrant le tendon d’Achille avec des ciseaux à pointe fine et retirez la peau vers la souris. Coupez le tendon d’Achille exposé et pelez le muscle vers le corps de la souris. Coupez le tendon aux condyles latéraux et médiaux du fémur pour libérer le gastrocnémien et placez le gastrocnémien attaché à ses tendons dans un plat rempli de PBS réfrigéré.

Retournez le gastrocnémien et retirez le muscle soléaire. Placez le muscle soléaire dans le bécher contenant cinq millilitres de mitochondries réfrigérées. Tampon d’isolement.

Un fan suivant a ouvert le gastroc et a retiré les trois parties musculaires rouges visuelles. Il y aura deux parties latérales et une bande rouge superficielle médiale. Une fois isolé, transférez le muscle rouge dans le bécher contenant cinq millilitres de mitochondries réfrigérées.

Tampon d’isolement un. Retirez 75 à 100 milligrammes supplémentaires de muscle rouge de l’autre patte de la souris. Répéter le processus qui vient d’être montré.

Placez le muscle disséqué de la deuxième jambe dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre avec le cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase et le tampon de lyse cellulaire préparé comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Congelez immédiatement le deuxième échantillon dans de l’azote liquide pour l’utiliser dans le transfert Western. Placez une surface en plastique plate pré-cicatrisée sur de la glace dans un grand seau.

Versez ensuite une goutte de tampon d’isolement des mitochondries sur la surface en plastique et utilisez une pince à épiler pour placer tout le muscle rouge sectionné dans une gouttelette d’isolement. Tampon. Émincez le tissu musculaire pendant deux minutes à l’aide de lames de rasoir à un seul tranchant, remplacez par un nouveau rasoir tranchant toutes les 40 secondes. Transférez le tissu haché dans un nouveau bécher avec cinq millilitres de mitochondries fraîches.

Tampon d’isolement un. Ensuite, prenez la solution et égouttez-la à travers une passoire à cellules de 100 microns, placée sur un tube conique de 50 millilitres. Épongez le mouchoir avec un chiffon délicat, puis transférez-le dans cinq millilitres d’une solution d’essai à 0,05 %.

À l’aide d’une pince à épiler, retirez tout tissu restant de l’essuie-glace et ajoutez-le à la trypsine. Incuber le tissu musculaire dans la solution de trypsine sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 200 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, versez le supinate de trypsine dans un récipient à déchets et remettez la pastille en suspension avec trois millilitres de tampon d’isolement des mitochondries glacé. Transférez ensuite le tissu dans un tube d’homogénéisation en verre de 45 millilitres. Rincez le tube conique de 15 millilitres avec 1,5 millilitres supplémentaires de tampon d’isolement des mitochondries pour recueillir tout échantillon restant et ajoutez-le dans le tube d’homogénéisation en verre.

Ensuite, placez le tube d’homogénéisation en verre dans un bécher ou un récipient en plastique rempli à moitié de glace. Ainsi, l’homogénéisateur en verre se déplace de manière minimale à l’intérieur du bécher. Homogénéisez l’échantillon à l’aide d’un pilon en polytétrafluoroéthylène fixé à un tissu motorisé.

Homogénéisateur avec 10 à 80 tr/min. Maintenez le bas de chaque passe pendant environ deux secondes. Transférez ensuite l’homogénat de tissu dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Et rincez le tube d’homogénéisation en verre avec 6,5 millilitres de tampon d’isolement des mitochondries. Versez le tampon dans le tube conique de 15 millilitres contenant le reste du tissu. Homogénat. Faites tourner l’échantillon à 700 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis versez doucement le supinate dans un tube à centrifuger en verre à haute résistance et jetez la pastille.

Ensuite, faites tourner la caisse claire à 8 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pour granuler les mitochondries, retirez le piège et remettez la pastille en suspension en ajoutant lentement 500 microlitres de tampon d’isolement des mitochondries deux, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette et homogénéisez doucement la pastille dans le tampon avec des mouvements de mélange et d’agitation. Ajoutez ensuite 4,5 millilitres supplémentaires d’isolement des mitochondries.

Une fois la pastille complètement suspendue, faites tourner l’homogénat à 8 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler à nouveau les mitochondries. Retirez le surnageant S et remettez doucement mais complètement la pastille en suspension en ajoutant 2 incréments de 25 microlitres d’isolement des mitochondries. Tamponnez deux, à l’aide d’une pointe de pipette avec la pointe coupée, remuez doucement et mélangez la pastille après chaque édition de 25 microlitres de tampon.

Lorsque vous avez terminé, placez ce stock mitochondrial sur de la glace. Faites deux dilutions distinctes de une à 20 du stock mitochondrial dans de l’eau de haute pureté. Ajoutez 0,1 % de Triton 100 x à un échantillon et sonisez pendant 10 secondes à basse température.

Laissez l’autre dilution sur de la glace et retournez l’échantillon soniqué dans la glace. Après la sonication, effectuez ensuite un dosage de la citrate synthase avec la dilution mitochondriale non soniquée et sonicée à l’aide d’un dosage photométrique utilisant des techniques standard, déterminez le pourcentage de membranes mitochondriales intactes à l’aide des équations fournies dans le protocole de texte ci-joint. La syndication des mitochondries entraîne une augmentation statistiquement significative de l’activité de la citrate syntase.

L’activité de la citrate syntase dans les échantillons mitochondriaux non soniqués par rapport aux échantillons sonicés montre que 92,5 % des mitochondries étaient intactes après l’expression d’isolement de ga. DH et COX quatre sont évidents dans l’ensemble du lysat tissulaire dans l’expression mitochondriale isolée de Cox quatre est observée. Bien que seules de faibles bandes de GA DH soient évidentes, ces résultats indiquent de bons isolements mitochondriaux avec peu de contamination par des composants non mitochondriaux pendant la procédure d’isolement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler le stock mitochondrial avec soin, de ne jamais le vortex ou le mélanger vigoureusement après cette procédure. D’autres méthodes, comme la mesure de la production d’espèces réactives, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’influence d’une intervention sur la production d’espèces réactives de l’oxygène dans les mitochondries isolées.