Modèle in vitro de physiologiques et pathologiques Blood Flow avec application aux enquêtes de cellules vasculaires Rénovation

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer les effets de différentes pathologies du flux pulsatile sur les cellules endothéliales. In vitro. Ceci est réalisé en traitant d’abord chimiquement les lames de verre et en les enrobant de protéines pour assurer la fixation des cellules pendant l’exposition à l’écoulement.

Dans un deuxième temps, l’indice de pulsatilité de l’écoulement est déterminé, ce qui permet de comparer l’écoulement in vitro aux valeurs décrites dans la littérature. Les lames de cellule suivantes sont connectées au système d’écoulement afin de mesurer la réponse cellulaire aux pathologies d’écoulement. Les résultats montrent des changements dans la morphologie et l’expression des protéines basés sur les profils de flux à l’aide de la microscopie optique et de la coloration immunofluorescente.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la pompe péristaltique ou pulsatile est la possibilité d’ajuster la pulsatilité du débit pour imiter une réponse malade ou saine. Cela peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies artérielles. Pour commencer, placez de nouvelles lames de verre mesurant 75 millimètres sur 50 millimètres sur un millimètre dans un plat de coloration de lame de verre propre.

Ajoutez ensuite suffisamment d’une solution d’acide sulfurique à 20 % pour immerger complètement les lames de verre et incubez-les dans la solution acide pendant la nuit du lendemain. Lavez les lames trois fois en les immergeant dans de l’eau fraîche déminéralisée pendant cinq minutes à chaque fois. Une fois rincés, plongez les lames dans de l’acétone pendant 30 minutes, puis toute la nuit dans une solution de 6 % de trois amino propyl trixi seline dans de l’acétone.

Ensuite, rincez les lames trois fois avec de l’acétone pure pendant cinq minutes en changeant d’acétone après chaque lavage. Ensuite, lavez les lames trois fois dans de l’eau déminéralisée pendant cinq minutes, en changeant l’eau déminéralisée après chaque lavage. Ensuite, plongez les lames dans du glutaraldéhyde à 1,5 % et laissez-les immergées pendant 60 minutes.

Une fois réticulées, lavez les lames deux fois dans de l’eau déminéralisée, en changeant l’eau désionisée Après chaque lavage, puis placez les lames dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes pour les stériliser. Retirez l’éthanol et laissez tout résidu restant s’évaporer des lames. Une fois sèches, réhydratez les lames en les plaçant brièvement dans de l’eau déminéralisée stérile.

Ensuite, retirez le support de diapositive et placez-le dans une boîte de Pétri de 100 millimètres sur 100 millimètres carrés. Dans la hotte à flux laminaire, enduisez la lame fonctionnalisée d’un millilitre d’une solution de fibronectine de 25 microgrammes par millilitre, couvrant la zone approximative qui sera exposée à la chambre de culture cellulaire. Ensuite, couvrez la boîte et incubez les lames à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures Après l’incubation, aspirez la solution restante et ensemencez 600 000 cellules endothéliales dans un millilitre de DMEM avec 10 % FBS sur le côté enduit de la lame.

Couvrez la chambre, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 120 minutes. Couvrez ensuite les cellules avec un milieu supplémentaire et continuez à les incuber jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 70 à 80 %. Connectez le circuit d’écoulement comme décrit dans le protocole textuel ci-joint et, comme indiqué ici, assurez-vous que la chambre d’amortissement et le débitmètre à ultrasons sont disposés dans le bon sens d’écoulement.

Ensuite, remplissez le débit, le circuit et le réservoir avec de l’eau déminéralisée. Assurez-vous que le tube de sortie du réservoir est immergé dans le volume du réservoir. Visualisez ensuite la forme d’onde du flux à l’aide d’un débitmètre.

Ouvrez la soupape de décharge d’air sur la chambre d’amortissement pour modifier le rapport fluide/volume d’air. Fermez la soupape de décharge d’air à différents intervalles de niveau de fluide et calculez l’indice de pulsatilité. Pour calculer l’indice, évaluez la forme d’onde du flux, car le pic représente la VM max.

Le creux représente le v min et la moyenne V est la moyenne de l’enregistrement du signal. Les valeurs de l’indice puls dans un notebook. Marquez le niveau de liquide et l’indice de pulsatilité résultants sur la chambre d’amortissement à l’aide d’un stylo à encre permanente à pointe feutre pour une utilisation future.

Déterminer les niveaux d’indice de pulsatilité souhaités à partir de la littérature pathologique référencée dans le protocole de texte d’accompagnement tout en préparant le réchauffement de la chambre d’écoulement. DMEM complété par 1 % de FBS dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Retirez l’une des lames revêtues d’une cellule du support une fois qu’elles sont confluentes à 70 à 80 % et placez un joint sur le dessus du côté assis de la cellule.

Ensuite, alignez le canal de vide de la chambre d’écoulement avec les trous du joint. Fixez ensuite le tube à vide aux orifices de vide, en veillant à ce qu’aucun fluide ne fuie vers le vide. Placez une feuille de polycarbonate sous la glissière en verre et fixez l’ensemble de la chambre d’écoulement avec une pince à ressort sur chacun des côtés courts et deux pinces à ressort le long des côtés longs de la chambre d’écoulement.

Ensuite, connectez la chambre d’écoulement, l’entrée et la sortie au circuit d’écoulement. Placez le système d’écoulement dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone et remplissez le circuit avec le média de préchauffage en remplissant le réservoir avec le média et en le pompant à faible pulsatilité. Maintenez ce débit pendant quatre heures pour préconditionner les cellules.

Ajustez ensuite le volume de fluide dans la chambre d’amortissement au niveau et à la culture de l’indice de pulsatilité pré-marqués. Les cellules pour la durée souhaitée. Les cellules endothéliales montrées ici ont été cultivées sans flux, à flux constant et à flux pulsatile.

Des changements dans la morphologie peuvent être observés de la morphologie typique des cellules endothéliales à une morphologie plus fusiforme après 24 heures d’exposition à un flux pulsatile élevé. Alors que les écoulements statiques et réguliers montrent peu ou pas de différence de morphologie. Les cellules musculaires lisses sont également affectées par la co-culture avec des cellules endothéliales exposées à un flux pulsatile élevé, comme l’indiquent ici les différents niveaux d’alpha, d’actine musculaire lisse et de chaîne lourde de myosine.

Dans des conditions d’écoulement variables, les cellules exposées au flux pulsatile ont montré les plus grandes quantités des deux protéines, ce qui indique une hypertrophie et une contractilité. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir tous les joints et de s’assurer que les niveaux de liquide restent constants après cette procédure. D’autres méthodes telles que la co-culture de cellules endothéliales et vasculaires peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les interactions entre cellules.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler le circuit d’écoulement, de contrôler l’indice et d’exposer les cellules endothéliales au flux pulsatile.