Name: Mesurer les taux de métabolisme dans lherbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez comment mesurer le métabolisme des herbicides chez les mauvaises herbes dicotylédones avec un test de feuille excisée. Cette méthode réduit la variabilité et permet d'analyser les mécanismes de résistance.

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Nous remercions Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley et Brittany Janney pour leur aide concernant la croissance et l’extraction des plantes, le Dr Anatoli Lygin pour son aide concernant les analyses chromatographiques et Syngenta Crop Protection pour le financement.

1. matériel végétal, conditions de croissance, et végétative Clonage Remarque: Trois populations de tuberculée ont été étudiées dans cette recherche: MCR (du comté de McLean, IL), ACR (du comté de Adams, IL), et le WCS (du comté de Wayne, IL) (Tableau 1). <ol><li> Recueillir et suspendre graines de tuberculée dans agar L -1 0,1 g: une solution d&#39;eau à 4 ° C pendant au moins 30 jours pour améliorer la germination. Remarque: Certaines populations de tuberculée sont en dormance, mais cette étape aide à surmonter la dormance et que les graines germent plus uniformément. </li><li> Germer des graines de chaque population de tuberculée (comme dans le tableau 1) dans 12 x 12 cm de plateaux contenant un milieu de mise en pot dans la serre. <ol><li> Maintenir des conditions de serre à 28/22 ° C des températures jour / de nuit dans une photopériode 16/8 h 12. </li><li> Supplément lumière naturelle dans la serre avec la lumière de lampes aux halogénures de mercure de fournir un minimum de 500 pmol m -2 </sup&gt; sec -1 flux de photons au niveau du couvert végétal. </li></ol></li><li> Transplant plantules quand ils sont 2 cm en 80 cm 3 pots dans la serre. </li><li> Les jeunes plants dans 950 cm 3 pots contenant un mélange 3: 1 de terreau:: 1: 1 de sol: tourbe: sable lorsque les plantules sont 4 cm de hauteur. Ajouter 5 g de granules à libération lente d&#39;engrais à chaque pot et mélanger avec ce mélange de sol. </li><li> Couper et enlever le méristème apical de la contenant les trois plus jeunes feuilles à partir de 7 cm de grandes plantes pour éliminer la dominance apicale. Remarque: Cette étape garantit que chaque plante se développera assez pousses 3 cm axillaires à cloner. </li><li> Accise cinq pousses axillaires (3 cm de longueur) lorsque les plantules sont environ 14 cm de haut à partir de chaque population tuberculée (comme dans le tableau 1). Retirer la majorité des feuilles sur ces pousses axillaires pour diminuer la perte d&#39;eau sur une manipulation, mais de conserver les deux feuilles les plus jeunes à la poursuite de la croissance sur la transplantation. <br/&gt; Remarque: Manipuler avec soin et essayer de ne pas endommager les pousses lorsque vous retirez les feuilles. Étiqueter chaque plante avec un jeu. </li><li> Transplant pousses axillaires en 80 cm 3 pots (un semis par pot) dans du terreau, qui est le même milieu utilisé pour la germination. Terreau doit être saturé initialement jusqu&#39;au racines forme dans la chambre de croissance, puis de maintenir l&#39;humidité et de placer des pots constante dans la chambre de croissance pendant 7 jours pour établir des racines. Remarque: Les plantes sont très sensibles à ce point et ne devraient pas être souligné. <ol><li> Maintenir des conditions de la chambre de croissance à 28/22 ° C des températures jour / de nuit dans une photopériode 16/8 h 12. </li><li> Une combinaison de incandescentes et fluorescentes ampoules peut être utilisé pour fournir de la lumière dans la chambre de croissance et devrait livrer au moins 550 pmol m -2 s -1 flux de photons à l&#39;usine de niveau du couvert 12. </li></ol></li><li> Transplant nouveau dans 950 cm 3 pots (un semis par pot) contenant un mélange 3: 1 de terreau:: 1: 1 de sol: la tourbe: sable (également inclure 5 g granules à libération lente d&#39;engrais) lorsque les plantes sont clonés 4 cm de hauteur, puis transfert à l&#39;effet de serre. </li><li> Cloner les plantes une deuxième fois en utilisant la même méthode décrite ci-dessus (par exemple, des mesures répétées de 1,5 à 1,8, puis passez à l&#39;étape 2.1). Pour une étude typique temps-sûr, générer des clones à partir d&#39;au moins six usines indépendantes de chaque population de tuberculée et les enregistrer sous forme de lignes MCR 1-6, 1-6 et ACR WCS 1-6. <ol><li> Établir au moins six «parent» lignées clonales distinctes afin de répéter l&#39;expérience et adéquatement représenter la variabilité génétique au sein de chaque population tuberculée. </li><li> Selon le nombre de points de temps seront analysés, générer suffisamment de sous-clones de chaque &quot;parent&quot; lignée clonale de mener une étude de temps bien sûr. </li></ol></li></ol> 2. Mener une étude du métabolisme avec excisés Waterhemp Feuilles <ol><li> Exciser les tiers-feuilles les plus jeunes (2 à 3 cm de longueur; inclure 0,5 cm de pétiole attaché) lorsque les plants de tuberculée clonés sont de 10 à 12 cm de hauteur pour le métabolisme de l&#39;herbicide et DT 50 analyse. </li><li> Pétioles des feuilles de couper de chaque usine de tuberculée un second temps (veiller à ce que 0,3 cm de pétiole reste) sous l&#39;eau, et de placer ces extrémités coupées dans 1,5 ml des flacons en plastique (une feuille par flacon) 15. REMARQUE: La coupe une deuxième fois sous l&#39;eau empêche les bulles d&#39;air de se former et de brancher vaisseaux du bois. <ol><li> Tout d&#39;abord, immerger partiellement les feuilles excisées avec pétiole de coupe dans un tampon de pré-incubation (200 pi) de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6) pendant 1 heure. </li><li> Deuxièmement, déplacer chaque feuille d&#39;un nouveau 1,5 ml flacon contenant un tampon d&#39;incubation (200 pi) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 um [URL- 14 C] herbicide, et incuber à 28 ° C pendant 1 heure pour permettre une absorption de l&#39;herbicide dans les feuilles. Remarque: Les 14 et C-mésotrione <sjusqu&#39;à&gt; 14 C-primisulfuron-méthyl ont été utilisés dans nos études à des activités spécifiques d&#39;environ 20 mCi mmol -1. Tant diffusion et l&#39;adoption à travers le flux de transpiration xylème contribuent à la quantité d&#39;herbicide pris par feuille. Remarque: L&#39;effet des inhibiteurs métaboliques sur le métabolisme herbicide peut être déterminée en modifiant étapes 2.2.1 et 2.2.2 ci-dessus. Ajouter 100 uM de l&#39;inhibiteur dans le tampon de pré-incubation et laisser incuber pendant 2 h, puis à transférer le tampon d&#39;incubation avec l&#39;herbicide et inhibiteur de nouveau ajouter 100 uM. Par exemple, le malathion et tetcyclacis inhibent certaines activités du cytochrome P450 dans les usines 15-17. </li><li> Laver la partie immergée de feuilles excisées avec de l&#39;eau déminéralisée et transférer feuilles excisées à un quart de Murashige et Skoog (MS) une solution de sels (500 pi) de 0 h, 5 h, 11 h, 23 h ou 35 h, respectivement, dans la chambre de croissance pour l&#39;étude du métabolisme du temps bien sûr. </li></ol></li><li> Récolte en enlevant congés à partir de la solution d&#39;incubation à l&#39;instant approprié et moudre manuellement chaque tissu de la feuille dans de l&#39;azote liquide en utilisant un tube en polypropylene (15 ml) et d&#39;un pilon en verre. </li><li> Extrait herbicide radiomarqué et ses métabolites à partir de chaque feuille avec 7 ml d&#39;acétone à 90% avec un homogénéisateur de tissu de laboratoire dans le même tube de polypropylene ci-dessus. Rincer homogénéisateur de tissu avec un 7 ml supplémentaires d&#39;acétone à 90%, et de continuer à homogénéiser jusqu&#39;à tissu est complètement pulvérisé (habituellement environ 2 min). Note: 90% d&#39;acétone peut être utilisé pour l&#39;extraction de la plupart des herbicides de tissus végétaux. Cependant, si cette méthode est incapable d&#39;extraire plus de 90% des composés radiomarqués absorbés, puis 90% de methanol 90% d&#39;acétonitrile ou peuvent être substitués en tant que solvant d&#39;extraction. </li><li> Étiquette 90% d&#39;extraits d&#39;acétone (14 ml au total) et conserver à -4 ° C pendant 16 heures pour permettre l&#39;extraction supplémentaire de se produire. Remarque: Après cette extraction de feuilles traitées, la quantité de rad extractibleioactivity est typiquement d&#39;au moins 98% de composés radiomarqués absorbés par le feuille traitée. La radioactivité non extractible (résidus liés) dans les feuilles excisées en moyenne que de 0,3% dans tous les points de temps dans notre étude précédente 12, mais ce montant peut varier en fonction de l&#39;herbicide utilisé et le point de temps examiné. </li><li> Centrifuger les échantillons à 5000 g pendant 10 min et se concentrer surnageants à 40 ° C avec un évaporateur rotatif jusqu&#39;à un volume final de 0,5 ml est obtenue. Transférer ce volume dans un tube en plastique de 2,0 ml. </li><li> Ajouter acétonitrile: eau (1: 1 en volume) pour régler le volume final de l&#39;extraits de plantes pour 1,25 ml et re-centrifuger à 10 000 g pendant 10 min pour éliminer toutes les particules. </li><li> Mesurer la radioactivité totale dans une fraction aliquote de chaque échantillon pris (dpm pi -1) par spectroscopie de scintillation liquide (LSS) 12 et normaliser les quantités de [marqué au 14 C] des composés injectés pour analyse par HPLC (par exemple, 10,000 total DPM / échantillon / run) afin axes y sera uniforme parmi les échantillons pour la représentation graphique des résultats. </li></ol> 3. Analyse par HPLC de l&#39;herbicide Métabolisme dans les feuilles excisées Remarque: Résoudre radioactivité extractible totale dans herbicides mère et herbicides métabolites en utilisant les conditions de RP-HPLC 12 suivants. <ol><li> Effectuer une RP-HPLC avec une colonne C18 (4,6 x 250 mm, 5 um taille de particule pour HPLC analytique) à un débit de 1 ml min -1 pour la plupart des herbicides non polaires. Remarque: les colonnes C 4 ou C 12 de RP-HPLC peuvent également être utilisés pour optimiser la séparation de l&#39;herbicide du type parent à partir de ses métabolites. Un filtre de pré-colonne et / ou une colonne de garde peuvent également être utilisés pour protéger et prolonger la durée de vie de la colonne de RP. <ol><li> Utilisation suivant la phase mobile pour CLHP-PI: Eluant A, 0,1% d&#39;acide formique (v / v) dans l&#39;eau et l&#39;éluant B 100% d&#39;acétonitrile de qualité HPLC. Remarque: methanol de qualité HPLC peut également être utilisé comme Eluent B pour résoudre plusieurs composés polaires et les métabolites, mais être conscient que les temps de rétention peuvent aussi changer. Remarque: Le profil d&#39;élution utilisé pour résoudre mésotrione ou primisulfuron-méthyl de leurs métabolites polaires dans notre recherche 12 est: Étape 1, A: B (4: 1, v / v) à A: B (3: 2, v / v ) dans un gradient linéaire (12 min); Etape 2, A: B (3: 2, v / v) à A: B (3: 7, v / v) dans un gradient linéaire (5 min); Étape 3, A: B (3: 7, v / v) à A: B (1: 9, v / v) dans un gradient linéaire de 2 min (comprenant un total de 19 min). Remarque: Il peut être nécessaire d&#39;ajuster en fonction des propriétés physiques de la matière mère afin d&#39;optimiser la résolution des dégradés et des étapes isocratiques. </li><li> Suivre les étapes de gradient linéaire ci-dessus avec A: B (1: 9, v / v) à A: B (4: 1, v / v) dans un gradient linéaire (3 min) et A: B (4: 1, v / v) l&#39;étape isocratique (pendant au moins 2 min) pour rééquilibrer la colonne de RP avant d&#39;injecter le prochain extrait 12. </li></ol></li><li> Détecter et visualiser des composés marqués avec un débit SCINTIAnalyseur llation. Enregistrer la quantité d&#39;herbicide-mère restant dans chaque échantillon en tant que pourcentage de la radioactivité totale dans chaque échantillon (détectés et quantifiés par la scintillation de l&#39;analyseur de flux selon les instructions du fabricant) pour déterminer les taux du métabolisme herbicide dans chaque population ayant une tuberculée au cours du temps. </li></ol> 4. Procédures statistiques <ol><li> Organiser des soins dans une conception complètement randomisé (ou autre dispositif approprié pour l&#39;analyse statistique). </li><li> Effectuer deux expériences indépendantes avec chaque traitement, composé de trois répétitions biologiques pour chaque expérience. Les deux expériences indépendantes comprennent six réplicats biologiques au total. Si l&#39;effet de l&#39;expérience est non significative (α = 0,05), de combiner et d&#39;analyser les données de l&#39;expérience indépendante. Si l&#39;effet de l&#39;expérience est importante, puis d&#39;analyser séparément chaque expérience. Nota: Inclure les trois premières répétitions biologiques in Expérience 1 et les trois prochaines répétitions biologiques dans l&#39;expérience 2. Chaque réplique biologique représente un «parent» distincte lignée clonale provenant de chaque population (MCR 1-6, 1-6 ACR, et le WCS 1-6) de sorte que chaque Time- analyse de cours utilise des plantes génétiquement identiques. Les deux expériences indépendantes comprennent six réplicats biologiques au total, ce qui permet une représentation adéquate de la variabilité génétique et la détermination d&#39;une médiane de 50 DT pour chaque population tuberculée. </li><li> Analyser les données avec une analyse non linéaire des moindres carrés de régression et de les adapter à une courbe simple de premier ordre afin d&#39;estimer DT 50 s. L&#39;équation ci-dessous décrit le modèle: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> où dans ce modèle Y représente le pourcentage de l&#39;herbicide du parent restant au temps t, μ i est la DT 50 pour chaquepopulation tuberculée i, et le paramètre C 0 est le montant estimé de parent herbicide présent à t = 0 12. </li></ol>

<ol><li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds%3A+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li>
<li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+action%3A+plants+resistant+to+herbicides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li>
<li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li>
<li>Délye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research%3A+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li>
<li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li>
<li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+without+intoxication%3A+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li>
<li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li>
<li>Fonné-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li>
<li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dioecious+Amaranthus+spp.%3A+here+to+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li>
<li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li>
<li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+from+Illinois%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+detoxi%EF%AC%81cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct detoxiﬁcation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li>
<li>Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicide-insecticide+interaction+in+maize%3A+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li>
<li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorreia%2C+MA+%22Cytochrome+P450%3A+Structure%2C+Mechanism%2C+and+Biochemistry%22">Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry</a>. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).</li>
<li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesotrione%3A+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Brighton+Crop+Protection+Conference+%E2%80%93+Weeds%22%5BJournal%5D)">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+%28Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus%29+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li>
<li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+resistance+across+glufosinate%2C+glyphosate%2C+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li>
<li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode excisé feuilles décrit ici a déjà été utilisé dans la recherche métabolisme primisulfuron en feuilles de maïs 15, mais nos résultats démontrent que ce protocole est également efficace, précis et reproductible pour mesurer le métabolisme de l&#39;herbicide dans une espèce de mauvaises herbes dicotylédones 12. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée par rapport aux études plante entière qui est une feuille excisée est indépendante de motifs de translocation plante entière ...

La résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes présente une grave menace pour la production mondiale de nourriture et de fibres 1,2. Actuellement, des milliers de populations résistantes et de biotypes de plus d&#39;une centaine espèces de mauvaises herbes dans le monde entier ont été documentés et étudiés 3. Un mécanisme majeur qui confère une résistance aux herbicides dans des plantes est l&#39;altération herbicide de gènes et de protéines à un site cible, y compris des mutations génétiques qui affectent la cinétique ou l&#39;amplification du gène de site de liaison cible herbicide 2-protéine. Désintoxication métabolique grâce à des activités élevées de la cytochrome P450 monooxygénase (P450) ou le glutathion S -transferase (TPS) enzymes est un autre mécanisme qui confère une résistance aux herbicides chez les mauvaises herbes, qui est distinct de plusieurs façons de mécanismes fondés sur-site cible 2. La résistance en fonction métabolique a des ramifications importantes pour savoir si les coûts de remise en forme de la plante (aka pénalités de remise en forme) peuvent entraîner des mechanis résistance aux herbicidesm, ainsi que sur le potentiel d&#39;un mécanisme unique de désintoxication pour conférer une résistance croisée ou plusieurs herbicides dans les populations de mauvaises herbes 1,2,4. En général, le métabolisme de l&#39;herbicide dans les plantes peut être divisé en trois phases distinctes 5. Phase I implique la conversion d&#39;herbicide ou d&#39;activation tel que P450 hydroxylation de noyaux aromatiques ou des groupes alkyle, ou par N - réactions de désalkylation ou o-, ce qui augmente la polarité et de l&#39;herbicide 5,6 partiel désintoxication. Nouvellement introduit des groupes fonctionnels dans la Phase I peuvent fournir des sites de liaison pour la conjugaison au glutathion réduit par GST ou en glucose par glycosyltransférases dépendants UDP dans la phase II de 5,7. Par exemple, le principal métabolite initial de primisulfuron-méthyle dans le maïs est un groupe hydroxy-primisulfuron-méthyl 8, qui peut être métabolisé en hydroxy-primisulfuron-glucoside (Phase II) et ensuite transporté vers la vacuole pour le stockage à long terme ou encore métabolique pro5,6 transformation (phase III). Tuberculée (Amaranthus tuberculatus) est une tâche difficile à contrôler, les espèces de dicotylédones annuelles de mauvaises herbes qui entrave la production de maïs (Zea mays), le soja (Glycine max) et le coton (Gossypium hirsutum) aux États-Unis. Le degré élevé de diversité génétique des tuberculée est facilitée par sa biologie dioïque et longue distance pollinisation par le vent, et un plant femelle unique tuberculée peut produire jusqu&#39;à un million de graines 9. Ces graines sont petites et se propager facilement, qui lui confèrent naturellement tuberculée avec un mécanisme de dispersion efficace. Tuberculée affiche la germination continue tout au long de la saison de croissance 9, et ses graines sont capables de germer après plusieurs années d&#39;inactivité. Tuberculée est une plante C 4 qui possède un taux de croissance plus élevé que la plupart des mauvaises herbes à feuilles larges dans les systèmes de culture arables 10. En outre, de nombreuses populations de tuberculée sont résistants à la fam multiplesilles d&#39;herbicides 3. Une population de tuberculée (désigné MCR) de l&#39;Illinois est résistant à la 4-hydroxy-phénylpyruvate dioxygénase (HPPD) herbicides inhibant 11, tels que la mésotrione, ainsi que pour l&#39;atrazine et acétolactate synthase (ALS) herbicides inhibant, y compris primisulfuron-méthyl , en raison de la non-cible site mécanismes fondés 12,13. Une population différente de tuberculée désigné ACR 14, qui est résistant primisulfuron-méthyl-(en raison d&#39;une mutation dans le gène ALS) et de l&#39;atrazine résistantes mais sensibles à la mésotrione, et une population de tuberculée désigné WCS 14 qui est sensible au primisulfuron-méthyle, mésotrione, et l&#39;atrazine ont été utilisés en comparaison avec MCR dans notre recherche avant 12 et les expériences en cours (résumés dans le tableau 1). Des études initiales ne pas détecter des altérations dans les niveaux de la séquence de gène de l&#39;HPPD ou d&#39;expression, ou l&#39;absorption de la mésotrione réduit, dans le MCRpopulation par rapport aux populations de mésotrione sensible 12. Cependant, les études de métabolisme avec des plantes entières ont démontré des niveaux significativement plus faibles de l&#39;herbicide parent de mésotrione dans MCR par rapport à l&#39;ACR et le WCS, qui en corrélation avec les réponses phénotypiques précédentes pour mésotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tuberculée population </td><td> Abréviation </td><td> Phénotype à Mésotrione </td><td> Mécanisme Résistance Mésotrione </td><td> Phénotype de Primisulfuron </td><td> Mécanisme Résistance Primisulfuron </td></tr><tr><td> Comté de McLean-résistant </td><td> MCR </td><td> Résistant </td><td> Métabolisme * </td><td> Résistant </td><td> Métabolisme </td></tr><tr><td> Adams County résistant </td><td> ACR </td><td> Sensitive </td><td> - </td><td> Résistant </td><td> Mutation cible place dans la SLA 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Sensible </td><td> - </td><td> Sensible </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Mécanismes de résistance non-target-site, autres que métabolisme accru, peuvent également conférer à la population MCR 12 résistance à la mésotrione. Tableau 1: description des populations de tuberculée de Illinois utilisés dans cette étude. En plus de déterminer les taux de métabolisme de l&#39;herbicide dans les semis de tuberculée intactes, une approche expérimentale différente a été développée et utilisée dans notre étude précédente pour étudier le métabolisme en utilisant un tuberculée test sur ​​feuilles excisées 12 ainsi que divers inhibiteurs du cytochrome P450 (par exemple, tetcyclacis et malathion). Cette méthode a été adaptée spécifiquement pour tuberculée d&#39;un PREVIous enquête du métabolisme du primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15, depuis le test de la feuille excisée n&#39;a pas encore été signalé pour mener des recherches sur le métabolisme de l&#39;herbicide dans une usine de dicotylédones. L&#39;insecticide malathion organophophosate a été fréquemment utilisé pour in vivo et dans la recherche herbicides métabolisme in vitro pour indiquer la participation de 16 P450. Par exemple, la tolérance et le métabolisme rapide de la mésotrione dans le maïs sont dues à P450 catalysée par hydroxylation de l&#39;anneau, qui a été vérifiée lorsque le malathion sensibilité accrue du maïs pour la mésotrione 17. De même, le malathion a inhibé le métabolisme de l&#39;Inhibiteur de l&#39;ALS primisulfuron-méthyl dans le maïs excisé laisse 15. Un avantage majeur de la technique de la feuille excisée est que les données générées sont indépendantes de motifs de translocation de plantes entières, un facteur important à considérer lors de l&#39;évaluation du métabolisme systémique, herbicides de postlevée dans les plantes. En conséquence, cette méthode permet quantitative etanalyse métabolique qualitative de se concentrer sur une seule feuille traitée 12. Une stratégie de clonage végétative, en combinaison avec le protocole de la feuille excisée, a déjà été utilisé dans tuberculée de mener des études sur le métabolisme 12. En raison de la nature de la pollinisation croisée tuberculée (séparés pour les hommes et les plantes femelles), et un grand degré de diversité génétique au sein des espèces d&#39;Amaranthus dioïque 9, ce protocole a assuré que les semis de tuberculée génétiquement identiques ont été analysés dans les expériences de temps bien sûr. Cet article démontre l&#39;utilité de la méthode de la feuille excisée pour mesurer les taux de métabolisme de l&#39;herbicide dans une mauvaise herbe dicotylédone (de tuberculée). La quantité d&#39;herbicide parent restant a été déterminée à chaque point (figure 1) de temps en moins l&#39;analyse des carrés de régression non linéaire, et a été en forme avec une courbe simple de premier ordre afin d&#39;estimer le temps pour 50% d&#39;herbicide absorbé à se dégrader ( DT 50). Représentantchromatogrammes de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) sont affichés pour la SLA-résistants et les populations de tuberculée -sensibles, qui indiquent la disparition de l&#39;herbicide mère et la formation concomitante de métabolite (s) polaire à une étude des temps bien sûr (Figure 2). L&#39;objectif de notre article est de décrire et de démontrer l&#39;utilité de l&#39;analyse de la feuille excisée en combinaison avec une méthode de clonage végétal pour déterminer les taux précis et reproductibles du métabolisme des herbicides dans les plantes dicotylédones, en utilisant uniformément anneau marqué (URL- 14 C) herbicides trois populations de tuberculée qui diffèrent dans leurs réponses de plantes entières à HPPD- et herbicides inhibant l&#39;ALS (tableau 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>pour la pré-germination</td></tr><tr><td>des graines Milieu de rempotage</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>pour la croissance des plantes</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp ;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>engrais à libération lente</td></tr><tr><td>Chambre de croissance E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>culture de plantes</td></tr><tr><td>Base Tris</td> Fisher <td>Scientific</td><td>BP152-500</td><td>tampon pour feuilles excisées</td></tr><tr><td>HCl (concentré)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td> ajuster <td>le pH des sels tampons</td></tr><tr><td>Murashige et Skoog (MS)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubation de feuilles excisées</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>lavages de feuilles après incubation</td></tr><tr><td>Acétone Extractions</td><td>de</td><td>plantes</td>179124 <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Acétonitrile (grade HPLC)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC phase mobile</td></tr><tr><td>Acide formique&nbsp ;</td><td>Mallinckrodt Analytical</td><td>MK259205</td><td>acidifier phase mobile pH</td></tr><tr><td>Micro-centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Tubes de 1,5 ou 2,0 ml</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (à température contrôlée)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Tubes de 15 ou 50 ml</td></tr><tr><td>Tube de centrifugation en polypropylène</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, stérile</td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>B&Uuml ; Échantillons</td><td>de plantes concentrés</td>CHI <td>R200</td></tr><tr><td>Spectrométrie à scintillation liquide (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>quantify 14C</td></tr><tr><td>Chromatographie liquide à haute performance</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>resolve herbicide Metabolites</td></tr><tr><td>Analyseur de scintillation en flux&nbsp ;</td><td>1103303 système LabLogic</td><td></td><td>pour l’analyse HPLC de la colonne 14C</td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18.</td><td>Thermo-Scientific</td><td>03-050-522&nbsp ;</td><td>phase inversée</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M cocktail</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>pour Analyseur de scintillation à scintillation</td></tr><tr><td>(ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>pour LSS ;</td></tr><tr><td>homogénéisateur de laboratoire</td> biodégradable <td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp ;</td><td>homogénéiser les échantillons de feuilles</td></tr></tbody></table>

mesurer les taux de métabolisme dans l&#39;herbicide mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés feuille

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Afin d’isoler et de déterminer avec précision les taux de métabolisme des herbicides chez une dicotylédones à hybridation obligatoire, l’amarante tuberculée (Amaranthus tuberculatus), nous avons mis au point un test de feuilles excisées combiné à une stratégie de clonage végétatif pour normaliser l’absorption d’herbicides et éliminer la translocation en tant que facteurs contributifs dans les populations d’amarante tuberculée résistante aux herbicides (R) et sensible (S). Les analyses biocinétiques des pesticides organiques dans les plantes comprennent généralement la détermination de l’absorption, de la translocation (livraison au site cible), du devenir métabolique et des interactions avec le site cible. Le métabolisme des herbicides est un paramètre important à mesurer chez les mauvaises herbes résistantes aux herbicides et les cultures tolérantes aux herbicides, et est généralement réalisé avec des tests sur la plante entière à l’aide d’herbicides radiomarqués. Cependant, l’une des difficultés liées à l’interprétation des paramètres biocinétiques dérivés des méthodes pour la plante entière est que la translocation est souvent affectée par les taux de métabolisme des herbicides, car les métabolites polaires ne sont généralement pas mobiles à l’intérieur de la plante après les réactions de détoxification des herbicides. Les avantages du protocole décrit dans ce manuscrit comprennent la détermination reproductible, précise et rapide des taux de dégradation des herbicides dans les populations R et S, une diminution substantielle de la quantité d’herbicide radiomarqué consommée, une réduction importante des matières végétales radiomarquées nécessitant une manipulation et une élimination supplémentaires, et la possibilité d’effectuer des expériences d’herbicides radiomarqués en laboratoire ou dans une chambre de croissance au lieu d’une serre. Alors que la résistance aux herbicides continue de se développer et de se propager dans les populations de dicotylédones du monde entier, la méthode d’essai des feuilles excisées développée et décrite dans le présent document constituera une technique inestimable pour étudier la résistance non ciblée basée sur les sites en raison des taux accrus de métabolisme des herbicides et de détoxification.

Les grandes différences dans les taux de métabolisme de la mésotrione ont été détectés entre soit WCS ou ACR et MCR (Figure 1). A chaque point de temps, MCR a métabolisé mésotrione plus rapidement que les deux populations de mésotrione sensible, WCS et ACR, qui est en corrélation avec plante entière phénotypiques réponses précédentes 11. En clonant suffisamment de plantes d&#39;une plante parentale unique à partir de chaque population, analyses temps de cours métabolisme des herbicides sont u...

Ce manuscrit décrit comment les taux de métabolisme des herbicides peuvent être quantifiés efficacement à l’aide de feuilles excisées d’une mauvaise herbe dicotylédones, réduisant ainsi la variabilité et éliminant tout effet confondant possible de l’absorption ou de la translocation de l’herbicide généralement observé dans les essais sur la plante entière.

Mesurer les taux de métabolisme dans l&#39;herbicide Mauvaises herbes dicotylédones avec un dosage excisés Feuille

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer le métabolisme d'un herbicide chez une mauvaise herbe du genre Dichot en utilisant un test sur feuille excisée. Cela est réalisé en premier lieu en plantant et en multipliant des populations de séneçon d'eau dans une serre et une chambre de croissance. La deuxième étape consiste à incuber des feuilles excisées de séneçon d'eau avec un herbicide marqué radioactivement et à réaliser une étude cinétique.Ensuite, l'herbicide et ses métabolites sont extraits des feuilles incubées. La dernière étape consiste à analyser l'herbicide et ses métabolites par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. En définitive, ce test sur feuille excisée permet de déterminer des taux précis de métabolisme de l'herbicide dans différentes populations ou espèces de mauvaises herbes.L'avantage principal de cette technique ou de méthodes existantes telles que la radio-marquage, l'application d'herbicide marqué sur les feuilles ou sur la plante entière, réside dans le fait que des semis génétiquement identiques ou non altérés sont analysés en ce qui concerne la translocation indépendante ou à l'échelle de la plante entière. Cette méthode p

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