Génération d'agrégats de souris de cellules souches embryonnaires qui montrent la brisure de symétrie, la polarisation et le comportement collectif émergent

L'objectif général de ce protocole est de produire des agrégats uniformes de cellules souches embryonnaires de souris capables d'auto-organisation et d'allongement axial en culture en suspension. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que le rôle des interactions tissulaires dans la spécification des axes et l'auto-organisation lors de processus comme la gastrulation. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'étudier les événements du développement selon une nouvelle perspective déconstructive, en dehors de l'embryon, avant l'agrégation.

Entretenir les cellules embryonnaires de souris ou M MECs dans le milieu ES.Lift sur des flacons de culture tissulaire de 25 centimètres carrés traités avec de la gélatine pour la génération d'agrégats. Commencer avec le flacon de culture tissulaire contenant les cellules à une confluence de 40 à 60 %, aspirer le milieu et rincer le flacon deux fois. Avec du PBS, ajouter un millilitre de trypsine EDTA à 0,25 % et incuber à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes pour détacher les cellules du flacon.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu Es.Lift à la suspension cellulaire détachée et mélangez soigneusement. Transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres et prélèvez un aliquot de un millilitre pour compter les cellules. Ajoutez cinq fois dix puissance quatre cellules à cinq millilitres de PBS chaud et centrifugez les cellules à 170 ×g pendant cinq minutes.

Aspirez la solution sans perturber le culot. Ensuite, ajoutez délicatement cinq millilitres de PBS et répétez la centrifugation. Aspirez le volume maximal sans perturber le culot cellulaire.

Pour éviter le report de PBS. Resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de milieu N deux B 27 chaud. Bien mélanger avec une pipette P 1000 afin d'obtenir une suspension cellulaire homogène.

Ensuite, diluez-le avec quatre millilitres supplémentaires de milieu N2B27. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir stérile à l’aide d’une pipette multipuits. Mélangez soigneusement les cellules et transférez 40 microlitres de la suspension cellulaire du réservoir dans chaque puits d’une plaque ubo non traitée pour culture cellulaire.

Plaque 96 puits. Une plaque non destinée à la culture tissulaire est spécifiquement utilisée afin de minimiser l'adhérence des cellules à la plaque. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures pour permettre l'agrégation cellulaire après 48 heures.

Retirer la plaque de l’incubateur et observer les cellules au microscope inversé afin de confirmer la présence d’agrégats. Ajouter un volume de solution mère de CHI 9 9 0 2 1 à 10 millimolaire au N deux B 27 préalablement réchauffé pour obtenir une concentration finale de trois micromoles. Il s’agit d’un milieu secondaire destiné à la stimulation cellulaire.

À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 150 microlitres du milieu secondaire dans chaque puits. Appliquez une force suffisante pour détacher les agrégats adhérents. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures après l’incubation.

Retirer soigneusement le milieu sans aspirer l'agrégat cellulaire. Ajouter 150 microlitres de N deux B 27 frais dans chaque puits avec une force suffisante pour détacher les agrégats adhérents. Répéter cette opération toutes les 24 heures pendant une incubation totale d'environ cinq jours.

Pour préparer les agrégats avant la fixation, aspirez d'abord délicatement la solution d'incubation de chaque puits en tenant la pipette à un angle de 30 degrés. Pour éviter d'aspirer l'agrégat cellulaire, ajoutez 150 microlitres de PBS dans chaque puits. Attendez quelques minutes que l'agrégat sédimente au fond, puis aspirez le PBS.

Répétez cette étape de lavage deux fois supplémentaires à l’aide de ciseaux stériles. Coupez la pointe d’une pipette P1000 à environ trois millimètres au-dessus de son embout de distribution. À l’aide de cette pointe, aspirez puis relâchez un petit volume de liquide dans un puits.

Pour agiter l'agrégat et le détacher du fond du puits. Ensuite, aspirer l'agrégat dans l'embout et transférer l'agrégat dans une préparation de dissection de drosophile en verre. En utilisant la même procédure, recueillir tous les agrégats devant subir des protocoles d'immunomarquage identiques dans une même préparation de dissection.

Placer la cavité de dissection sous le microscope et la faire tourner doucement pour déplacer les agrégats vers le centre. Ensuite, aspirer soigneusement le PPS depuis le bord de la cavité, en prenant soin de ne pas retirer les agrégats.

Pour fixer les agrégats, ajouter un millilitre de solution de formaldéhyde fraîchement préparée à 4 % et incuber les boîtes dans un agitateur orbital pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Régler sur une vitesse faible. Aspirer la solution de formaldéhyde avec précaution afin d'éviter d'aspirer les agrégats, puis ajouter un millilitre de PBS dans la cavité.

Replacer la plaque dans l'agitateurbain pour 10 minutes. Retirer le PBS du puits et répéter cette étape de lavage deux fois supplémentaires. Ensuite, ajouter un millilitre de solution P-B-S-F-T et placer la plaque sur l'agitateurbain pendant 10 minutes.

Aspirez la solution et répétez le lavage deux fois supplémentaires. Ajoutez un millilitre de P-B-S-F-T par puits pour bloquer les agrégats contre l'immunoréactivité non spécifique. Incubez la plaque sur un agitateur orbital à faible vitesse pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après l'incubation, aspirez soigneusement la solution de blocage des puits et ajoutez 500 microlitres d'anticorps primaire dilué dans du P-B-S-F-T. Scellez la plaque avec du paraform pour éviter l'évaporation et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un agitateur orbital à faible vitesse. Ensuite, remplacez la solution d'anticorps primaire par du P-B-S-F-T prérefroidi.

Lavez les agrégats en plaçant la plaque sur l'agitateurboule. Réglez la vitesse basse à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Répétez le lavage une fois supplémentaire.

Effectuez deux cycles de lavage supplémentaires avec du P-B-S-F-T à quatre degrés Celsius à faible vitesse sur un agitateur orbital. Comme indiqué dans le protocole écrit, retirez la solution de lavage et incubez avec 500 microlitres d'anticorps secondaire dilué dans du P-B-S-F-T. Ajoutez un microgramme par millilitre d'herst afin de visualiser les noyaux, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un rotor rotatif, à l'abri de la lumière.

Effectuez un autre cycle de lavage avec du PBS FT à quatre degrés Celsius, protégé de la lumière dans une boîte recouverte de papier d’aluminium. Réalisez des lavages supplémentaires avec du PBS contenant 0,2 % de FBS et 0,2 % de Triton X-100 ou du tampon PBT à température ambiante. Après avoir soigneusement aspiré la solution, incubez les agrégats avec un millilitre de mélange glycérol-PBT (1:1) pendant 30 minutes à l’abri de la lumière à température ambiante.

Incubez-les ensuite avec un millilitre de solution de glycérol à PBT (7:3) pendant 30 minutes. Pour préparer les échantillons en vue de l'imagerie confocale, aspirez la solution de glycérol à PBT et remplacez-la par un millilitre de milieu de montage. Montez ensuite les agrégats en gouttes de 17 microlitres sur une lame de verre.

À l’aide d’un embout de pipette, préparez un espaceur en pliant une bande de ruban adhésif double face quatre fois sur elle-même. Placez ensuite un espaceur de chaque côté des agrégats sur la lame, retournez la lamelle, faites-la glisser sur les espaceurs, puis observez les agrégats par microscopie confocale. Quarante-huit heures après le semis, des agrégats d’environ 150 micromètres de diamètre se forment, présentant des limites régulières.

D'autre part, une qualité médiocre du milieu, un nombre de cellules ensemencées non optimal ou une adhérence cellulaire insuffisante peuvent entraîner un échec de l'agrégation. Un traitement continu de 120 heures avec CHI 9 9 0 2 1, un inhibiteur de la glycogène synthase kinase trois, provoque l'allongement de l'agrégat sphérique. De plus, on observe une localisation distincte des cellules positives pour SOX GFP à une extrémité de l'agrégat après traitement ; différents traitements entraînent des modifications variées de la morphologie d'un agrégat unique ainsi que des changements dans le marqueur fluorescent.

La localisation au sein de l'agrégat peut être suivie au fil du temps. Une fois maîtrisée, la technique permettra au chercheur de générer des agrégats en environ 45 minutes si elle est correctement réalisée. Une fois les agrégats formés, d'autres méthodes comme la Q-R-T-P-C-R peuvent être utilisées à la place de la coloration immunohistochimique afin d'étudier les modifications de l'expression génique au sein des agrégats.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de former des agrégats à partir de MEC, d'appliquer des stimuli spécifiques et de préparer les agrégats pour l'analyse par immunomarquage et microscopie confocale.