Name: Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par Sporosarcina pasteurii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la précipitation de calcite induite microbiologiquement par Sporosarcina pasteurii. Cette méthode standardisée permet d'étudier la biominéralisation et d'améliorer la résistance des matériaux.

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Nous tenons à remercier les partenaires de l’Initiative Helmholtz-Alberta, l’Association Helmholtz et l’Université de l’Alberta pour le soutien découlant de leur participation à cette collaboration. Le financement de la recherche provient de l’Initiative and Networking Fund de l’Association Helmholtz, des centres Helmholtz participants et du gouvernement de l’Alberta par l’entremise du programme ecoTrust du ministère de l’Environnement de l’Alberta.
Dr. Tanushree Ghosh est vivement remerciée pour ses contributions critiques à un certain nombre d’étapes cruciales.

REMARQUE: Effectuez les protocoles expérimentaux dans l&#39;ordre décrit ci-dessous. Le protocole de culture bactérienne est examinée à la section 1 (voir également la figure 1). La section 2 décrit le protocole d&#39;enrichissement du milieu de culture en utilisant des additifs externes. La section 3 décrit les protocoles pour la microscopie multi-mode. Poids de tous les composants individuels peuvent être mesurées en utilisant une balance analytique. Le volume de chaque solution peut être mesurée au moyen d&#39;un cylindre volumétrique. NOTE: Les protocoles de biosécurité appropriées doivent être suivies pour les sections 1 - 2. Consulter le bureau de la sécurité des établissements pour les détails. 1. Culture bactérienne <ol><li> Les bactéries de la culture - Agar Plate Medium Préparation <ol><li> Assembler l&#39;équipement et des ingrédients tels que des boîtes de Pétri, flacon, Tris-base, HCl, de l&#39;agar, l&#39;eau Millipore, pH-mètre etc.Sterilize tous les conteneurs par autoclavage à 121 ° C avant utilisation. </li><li> Préparer 1 L de 0,13 solution aqueuse M de Tris-tampon en mélangeant 15,75 g de Tris-base avec 1 L d&#39;eau Millipore. Pour abaisser le niveau de la solution initiale (pH 10,4) pH ajouter 2,800 ul de HCl (50%). Vérifiez en permanence à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre pour régler pH = 9. </li><li> Diviser la solution tampon 1 L en deux parties, comme suit: <ol><li> Prendre 800 ml de cette solution. Divisez également en deux parties de 400 ml chacun. Dissoudre 8 g de (NH 4) 2 SO 4 à une solution, 16 g d&#39; extrait de levure à l&#39;autre solution. </li><li> Prenez le reste (200 ml de) solution et de le diviser à nouveau en deux parties de 100 ml chacun. Mélanger 2 g de (NH 4) 2 SO 4 à un. Ajouter 4 g d&#39;extrait de levure et 4 g d&#39;agar à l&#39;autre. </li></ol></li><li> Autoclave les 4 solutions séparément après envelopper les flacons respectifs Al feuille et coller des bandes autoclave. NOTE: Si une unité de paillasse en autoclave est utilisé, le volume doit être réglé à 500 ml (température et pression automattiquement spécifié en fonction du volume). </li><li> Après les avoir sortis de l&#39;autoclave, définissez les deux 400 solutions ml de côté pour l&#39;étape 1.3.1 (ci-dessous). Mélanger les deux solutions de 100 ml d&#39;avoir une solution 200 ml. Verser le mélange dans 10 - 12 boîtes de Pétri. </li></ol></li><li> Les bactéries de la culture - Plate Agar Préparation de l&#39; échantillon <ol><li> Retirer le stock bactérien du congélateur (-80 ° C) et laisser décongeler. Après décongélation correctement, placez le stock bactérienne et la plaque de gélose dans une hotte de biosécurité. </li><li> Sélectionnez la micropipette de plus petite dimension disponible (0,5 à 10 pi est un bon choix) pour infester la pointe avec le stock pasteurii Sporosarcina. Streak une plaque de gélose à la pointe de la micropipette. Placer la plaque de gélose striée l&#39;intérieur d&#39;un incubateur non-agitation à 31 ° C pendant 48 heures. </li><li> Après 48 heures, retirer la plaque de l&#39;incubateur et un examen visuel de l&#39;existence de colonies isolées. S&#39;il n&#39;y a pas de colonies uniques, puis le placer dans til incubateur pendant 24 h. </li><li> Répétez le processus jusqu&#39;à ce que des colonies isolées sont détectées. Ne pas dépasser 7 jours de procès. NOTE: Si des colonies isolées ne semblent pas même après une semaine, puis il est conclu que les étapes ne sont pas suivies correctement et l&#39;ensemble du processus doit être répété à l&#39;étape 1. </li></ol></li><li> Les bactéries de la culture - Préparation de l&#39; échantillon final <ol><li> Mélanger les deux solutions (400 ml de tampon Tris + (NH 4) 2 SO 4 et du tampon Tris + extrait de levure (1.5.1) ensemble pour obtenir une solution à 800 ml. Transférer 125 ml de cette solution dans un flacon. </li><li> Procéder à un examen visuel de la surface de la plaque de gélose pour identifier des régions à forte concentration en colonies uniques. pousser doucement et de briser l&#39;une des colonies avec une pointe de micropipette. </li><li> Trempez la même pointe de micropipette dans le flacon de 125 mL et mélanger soigneusement pour veiller à ce que nombre suffisant de cellules pour la multiplication robuste se transférer. Placer la fiole dans un incubateur à agitation par secousses à 150 tpm, 30 ° C pendant 2 - 3 jours. Après 2 - 3 jours, enlever le ballon de l&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Les bactéries de la culture - Cell Count final <ol><li> Effectuer une dilution en série de la solution de culture non dilué à l&#39; aide de PBS pour obtenir une dilution d&#39;au moins dix millions (10 -7) afin d&#39; assurer des colonies isolées dénombrables apparaissent. Dessinez sept lignes parallèles équidistantes sur l&#39;une des plaques d&#39;agar-. <ol><li> Pour ce faire, en traçant des lignes audacieuses sur la surface inférieure de la boîte de Pétri, assez important pour être visible du haut. Déposez 3 petites gouttes de solution non diluée dans un seul segment. Ajouter 1 ml de solution non diluée à 9 ml de tampon phosphate salin (PBS) pour obtenir une dilution de 1:10. </li></ol></li><li> Prenez une petite aliquote (~ 0,1 ml) de cette nouvelle solution diluée avec une pipette et déposer 3 plus petites gouttes sur le segment suivant. Transférer la solution fraîchement diluée dans un nouveau flacon puis dilué dix fois (10x) paren ajoutant du PBS. Cela réduit la dilution à 10 ~ 2 ou 1: 100. <ol><li> Utilisez cette solution 1: 100 dans le segment suivant. Répéter ce qu&#39;il traite avec de petits volumes des solutions fraîchement diluées en les transférant successivement les nouveaux flacons en continu et en diluant dix fois (10x) en tandem avec du PBS pour obtenir des échantillons de plus en plus dilués de 10 -3 ou 1: 1000 sur toute la jusqu&#39;à 10 -7 ou 01h10 millions dans le dernier segment. </li></ol></li><li> Effectuer Colony-Forming Unit count (CFU) de la plaque pour compter le nombre de cellules présentes dans la plaque de gélose après incubation de la plaque pendant 1 - 2 jours à 31 ° C. Ceci donne une mesure quantitative du nombre de bactéries dans l&#39;échantillon non dilué. NOTE: La valeur CFU est mesurée en fonction de la capacité du système pour donner naissance à des colonies dans les conditions spécifiques de milieu nutritif, la température et le temps en supposant que chaque colonie est séparée et fondée par une seule cellule microbienne viable. </li><li> Jointles boîtes de Pétri avec auto-obturant le film et stocker les autres items dans un réfrigérateur pour une utilisation future. </li></ol></li></ol> 2. Protocole pour l&#39;enrichissement des éléments nutritifs pour accélérer des précipitations <ol><li> Transfert 9 ml de liquide de culture préparé (cellules + milieu) dans plusieurs tubes de centrifugeuse stériles, chacun de 10 ml de volume. </li><li> Préparer une solution mère de 100 ml de l&#39;enrichissement externe constitué de quatre composants dans les concentrations suivantes dans un milieu frais: Urée: 2 g / L, du chlorure d&#39;ammonium: 1 g / L, du bicarbonate de sodium: 212 mg / L, du chlorure de calcium: 280 mg / L. Mesurer soigneusement tous les ingrédients en utilisant une balance analytique et mélanger tous, mais l&#39;urée avec du milieu frais dans un bécher et placer dans l&#39;autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min). <ol><li> Après autoclave, mélanger la quantité requise d&#39;urée (2 mg) avec 1 ml de milieu frais et passer à travers une seringue munie d&#39;un filtre à seringue de 0,22 um pour terminer le processus d&#39;enrichissement. </li><li> Ajouter 1ml de ce milieu d&#39;enrichissement avec des additifs pour les tubes de centrifugeuse stérilisées contenant 9 ml de liquide de culture préparé (cellules + milieu) (voir étape 2.1). REMARQUE: Parmi tous ces composants, l&#39;urée étant dégradable à température élevée, ne peut pas être stérilisé dans un autoclave. Par conséquent, après que les autres composants ont été passés à l&#39;autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), l&#39;urée est ajoutée en dernier à travers un filtre à seringue de 0,22 um. </li></ol></li><li> Vortex chaque tube à fond en utilisant un vortex mécanique. Placez les liquides enrichis (cellules + moyennes Additifs +) dans un incubateur non-agitation à 30 ° C. Surveiller toutes les unités régulièrement pour l&#39;initiation de précipitations. L&#39;utilisation d&#39;un microscope optique, commencez observations microscopiques fois l&#39;apparition de précipitations est détectée à l&#39;oeil nu. Ceci est habituellement entre 30 - 36 h après le début des expériences. </li></ol> 3. Protocole pour multimode Microscopie <ol><li> Transférer un petit volume (~ 1 ml) de liquide à un haut-magnification microscopie-chambré système coverglass pour effectuer les premières observations avec le mode de champ lumineux. Pour commencer, commencer à toutes les observations avec le plus faible grossissement (4X). qui fournit une large zone de couverture et de l&#39;information donc mondiale sur la distribution des précipités. </li><li> Sélectionnez des domaines particuliers avec des volumes importants de précipitations et de zoomer (20X, 40X, 60X) en augmentant progressivement le grossissement. NOTE: Comme il est impossible de résoudre correctement les cellules de la substance extracellulaires polymériques (EPS) sous champ lumineux (en raison d&#39;indices de réfraction très proche), passer en mode contraste de phase chaque fois que nécessaire. Dans ce mode, uniquement les contours des membranes cellulaires (soit une phase différente de celle de la cellule en vrac) sont visibles, ce qui permet une différenciation visuelle. </li><li> Enfin, tacher certaines chambres avec Live tache / Dead qui teint sélectivement les composants vivants en vert tandis que la coloration des composants morts en rouge. Reportez - vous à des protocoles standard 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Commutateur en mode fluorescent pour bien distinguer les zones rouges et vertes. Rouge (cube de filtre rouge avec Excitation longueur d&#39;onde de 540-580 nm, un miroir dichroïque de 595 nm et Barrière filtre de 600-660 nm) et verte (GFP longue filtre passe-vert cube avec Excitation longueur d&#39;onde de 440-480 nm, miroir dichroïque de 505 nm et filtre barrière de 510 cubes nm) de filtre sont utilisés pour faciliter des micrographies fluorescentes. </li><li> Une fois que toutes les données multi-mode ont été recueillies, sélectionner les meilleures images et superposition manuellement (fond clair individuel, à contraste de phase et des images fluorescentes) pour obtenir le meilleur contraste et une clarté possible. </li><li> Effectuer SEM sur les échantillons solides secs pour comprendre les structures cristallines. Ceci est une procédure bien établie et standard. 22 Effectuer XPS pour identifier les signatures chimiques des groupes fonctionnels (carbonates). Ceci est une procédure bien établie et standard ainsi. 23 </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Étapes critiques: Ce manuscrit décrit en détail les protocoles pour la culture d&#39; un échantillon viable de S. pasteurii. Une fois que la culture a été prépara, il doit être convenablement enrichi. Ceci est une étape clé essentielle à la réussite de l&#39;expérience , car un défaut de l&#39;environnement chimique approprié conduit soit à des échelles de temps très longues de précipitations ou d&#39; une absence totale de celui - ci. S. pasteurii est très sensible à plusieurs organis...

Sporosarcina pasteurii est une bactérie capable de survivre dans des environnements fortement alcalins (pH ~ 10) 1 gram-positif et est l&#39; une des espèces bactériennes qui peuvent devenir un agent causal d&#39;un phénomène appelé microbiologiquement Induced Précipitation de calcite (MICP) 2-4. MICP est un procédé dans lequel la précipitation du carbonate de calcium est induite par certains microbes dans des conditions environnementales appropriées. S. pasteurii a pris une importance au cours des dernières années en raison de son identification comme un agent possible pour induire des volumes importants de MICP sous certaines conditions. Cette possibilité résulte du fait que S. pasteurii a la capacité unique de sécréter de grandes quantités de l&#39;enzyme uréase. Cette enzyme agit comme un catalyseur, favorisant une lyse accélérée de l&#39;urée (composé biochimique d&#39;origine naturelle avec une alimentation répandue et abondante) en présence de molécules d&#39;eau. À travers une cascade de réactions, ce procédé ultimely conduit à la génération d&#39;ions carbonate chargés négativement. Ces ions, à leur tour, réagissent avec les ions métalliques positifs tels que le calcium pour former finalement des précipités de carbonate de calcium (calcite); d&#39; où l&#39;étiquette MICP 5-9. Le processus de MICP a été connu et étudié depuis plusieurs décennies 10,11. Au cours des dernières années, MICP a été étudié pour une large gamme d&#39;applications environnementales , y compris bottom-up construction verte 12, d&#39;amélioration des structures à grande échelle 13,14 et la séquestration du carbone et le stockage 15,16 ingénierie et. Par exemple, Cunnigham 17 et. al conçu un réacteur à écoulement à température modérée à haute pression contenant un noyau de grès Berea. Le réacteur a été inoculé avec la bactérie S. fridgidimarina et dans des conditions d&#39;injection de dioxyde de carbone supercritique à haute pression, une accumulation massive de la biomasse à l&#39; intérieur du volume de poresumes a été observée, ce qui conduit à une réduction de plus de 95% de la perméabilité. Jonkers et Schlangen 18 ont étudié l&#39;effet de certaines souches particulières de bactéries sur le processus d&#39;auto-guérison dans le béton. eau externe transporté dans le réseau de pores pénétrant par les pores de surface est prévu pour activer les bactéries dormantes qui à son tour aider la résistance structurelle via MICP. Tobler 19 et al. ont comparé l&#39;activité uréolytique de S. pasteurii avec une eau souterraine uréolytique microcosme indigène dans des conditions favorisant MCIP à grande échelle et a constaté que S. pasteurii a une capacité cohérente pour améliorer la précipitation de calcite même lorsque les communautés autochtones manquaient activité uréase préalable. Mortensen 20 et.al ont étudié les effets de facteurs externes tels que le type de sol, la concentration de chlorure d&#39;ammonium, la salinité, la concentration en oxygène et la lyse des cellules sur MICP. Leur démonstration que le processus de traitement biologique est très robuste avec respect à une grande variation dans l&#39;espace des paramètres corrobore l&#39;aptitude de ce processus pour diverses applications d&#39;assainissement à grande échelle fournis un processus d&#39;enrichissement propre à renforcer les bactéries est entrepris. Phillips 21 et. al conçu des expériences pour étudier les changements dans la perméabilité et la résistance d&#39;une colonne de sable et d&#39; un noyau de grès après l&#39;injection de S. cultures pasteurii. Ils ont constaté que, bien que la perméabilité a diminué de 2 - 4 fois tandis que la résistance à la rupture a augmenté trois fois. S. pasteurii et son rôle dans MICP sont des sujets de recherche active et plusieurs questions relatives au mécanisme de précipitation chimique ne sont pas encore pleinement compris. À la lumière de cela, il est très important d&#39;avoir un ensemble de protocoles normalisés cohérents de culture avec précision un stock convenablement enrichi de S. pasteurii pour réaliser MICP. Ici, nous présentons un protocole rigoureux qui assurera la répétabilité et la reproductibilité. Cette manuscript décrit les protocoles détaillés pour la culture de S. pasteurii et d&#39; enrichir de manière appropriée le milieu de culture pour induire la précipitation. Le processus est étudié grâce à diverses techniques microscopiques comme optique et microscopie électronique à balayage (MEB) et X-Ray Photo-électronique Spectroscopy (XPS). L&#39;accent du manuscrit est sur le processus de MICP. Procédures comme SEM et SIMS, étant des protocoles standards bien établis, ne sont pas décrits séparément.

<table><tbody><tr><td>Pétridish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Boîtes de conserve utilisées comme plaque de gélose</td></tr><tr><td>Fioles en pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>utilisées pour fabriquer de l’acide chlorhydrique Tris-Buffer</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1,0 N, bioréactif, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Poudre de gélose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>testé en microbiologie, testé en culture cellulaire végétale, testé en poudre</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Poudre</td><td>d’extrait de levure Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre doseur</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Cylindre gradué de classe A avec Cal Cert,TC ; 1 000 ml,1/pqt</td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>utilisée pour mesurer le poids des réactifs</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Ruban autoclave</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>utilisée pour sceller le flacon avant de le placer dans l’autoclave</td></tr><tr><td>Stock bactérien</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 &deg ; C de S. pasteurii, n° ATCC est mentionné contre Cat. Non.</td></tr><tr><td>Mline Pipettors mécaniques monocanaux, volume variable</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Commercialisé par VWR sous le numéro de catalogue 14005976</td></tr><tr><td>Pointe de micropipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Utilisé pour le grattage des plaques de gélose</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Classeur 80079098</td><td></td><td>Incubateur de microbiologie, Série BF</td></tr><tr><td>Incubateur à secousses</td><td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Benchtop Shaking Incubateurs</td></tr><tr><td>Tampon Phosphate Saline (PBS)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express Pipet-Aid Dispositif de pipetage</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Commercialisé par VWR sous le numéro de catalogue 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Utilisé pour sceller les plaques de gélose</td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Enrichissement pour milieu nutritif</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Enrichissement pour milieu nutritif</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Enrichissement pour milieu nutritif</td></tr></tbody></table>

microbiologiquement induced précipitation de calcite mediated par<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

La bactérie particulière sous enquête ici (S. pasteurii) est unique dans sa capacité, dans les bonnes conditions, pour induire l&#39;hydrolyse de l&#39; urée (uréolyse) dans des environnements naturels grâce à la sécrétion d&#39;une enzyme uréase. Ce processus de uréolyse, à travers une série de réactions chimiques conduit à la formation de précipités de carbonate de calcium. Ceci est connu comme microbiologiquement Induced Précipitation de calcite (MICP). Les protocoles de culture appropriées pour MICP sont détaillées ici. Enfin, des expériences de visualisation sous différents modes de microscopie ont été réalisés pour comprendre les divers aspects du processus de précipitation. Des techniques comme la microscopie optique, microscopie électronique à balayage (MEB) et X-Ray Photo-électronique Spectroscopy (XPS) ont été utilisées pour caractériser chimiquement le produit final. En outre, la capacité de ces précipités à obstruer les pores à l&#39;intérieur d&#39;un milieu poreux naturel a été démontrée par une expérience qualitative où l&#39;épongebarres ont été utilisés pour simuler un pore-réseau avec une gamme d&#39;échelles de longueur. Une barre d&#39;éponge trempée dans le milieu de culture contenant les cellules bactériennes durcit en raison de l&#39;obstruction des pores résultant du procédé continu de précipitation chimique. Cette barre d&#39;éponge durcie présente une résistance supérieure par rapport à une barre d&#39;éponge de commande qui devient comprimé et pressé sous l&#39;action d&#39;une charge externe appliquée, tandis que la barre durcie est capable de supporter le même poids avec peu de déformation.

S. pasteurii étant un alcalophile 24 peuvent survivre à des conditions relativement sévères. Lorsque le protocole de culture mentionné ci - dessus est suivie, et S. pasteurii est cultivé à l&#39; intérieur d&#39; une chambre, les bactéries conduit à la précipitation du carbonate de calcium au cours du temps (figure 2A). La figure 2 (b) montre une image au microscope optique à contraste de phase de la population bactérienne da...

Protocoles pour la précipitation de calcite induite microbiologiquement (MICP) à l’aide de la bactérie Sporosarcina pasteurii sont présentés ici. Le carbonate de calcium précipité a été caractérisé par microscopie optique et microscopie électronique à balayage (MEB). Il est également démontré que l’exposition à la MICP augmente la résistance à la compression de l’éponge.

Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

L'objectif général de ce protocole est d'induire la précipitation de calcite dans une culture stagnante de Sporosarcina pasteurii. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions biophysiques essentielles concernant la précipitation de calcite induite par Sporosarcina pasteurii, telles que les échelles spatiales et temporelles pertinentes. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle standardise les étapes complexes nécessaires à la culture et à l'enrichissement adéquats de Sporosarcina pasteurii, garantissant ainsi une précipitation fiable de calcite.Pour commencer, préparez des boîtes de Pétri, des flacons, de la base de Tris, du HCl, de l'agar, de l'eau Millipore et un pH-mètre. Stérilisez tous les récipients par autoclavage à 121 degrés Celsius avant utilisation. Préparez un litre d'une solution aqueuse de tampon Tris à 0,13 molaire en mélangeant 15,75 grammes de base de Tris avec un litre d'eau Millipore.Ajoutez environ 2,8 millilitres de HCl à 50 % pour ajuster le tampon à un pH de neuf. Une fois que la culture est prête, elle doit être enrichie de manière appropriée avec le tampon adéquat. Cette étape est cruciale pour la réussite de l'expérience, car l'absence d'un environnement chimique correct peut entraîner des échelles de temps très longues de précipitation ou même une absence totale de précipitation.Ensuite, diviser le litre de tampon en deux parties comme suit. Dans une aliquote de 400 millilitres, dissoudre huit grammes de sulfate d'ammonium. Dans une seconde aliquote de 400 millilitres, dissoudre 16 grammes d'extrait de levure.Dans 100 millilitres du tampon, mélanger deux grammes de sulfate d'ammonium, et dans les derniers 100 millilitres de tampon, ajouter quatre grammes d'extrait de levure et quatre grammes d'agar. Après avoir enveloppé les flacons dans du papier d'aluminium, stériliser les quatre solutions en autoclave. Immédiatement après la stérilisation en autoclave, mettre de côté les deux solutions de 400 millilitres.Combiner les deux solutions de 100 millilitres, bien mélanger, puis répartir dans 10 à 12 boîtes de Petri. Pour cultiver les échantillons bactériens, sortir la souche bactérienne du congélateur à moins 80 degrés Celsius et la laisser dégeler complètement. Ensuite, la placer ainsi qu'une boîte de gélose dans la hotte de sécurité biologique.Sélectionnez une micropipette du volume le plus faible possible et plongez une pointe de micropipette dans la souche de Sporosarcina pasteurii avant d'utiliser la pointe pour tracer une plaque d'agar. Incubez la plaque à 31 degrés Celsius pendant 48 heures, puis examinez visuellement la présence de colonies isolées. Si aucune n'est présente, prolongez l'incubation de 24 heures supplémentaires.Répétez le contrôle et les incubations jusqu'à ce que des colonies isolées soient détectées. Pour préparer les échantillons finaux de culture bactérienne, mélangez dans un bécher stérilisé les deux solutions de 400 millilitres stérilisées auparavant par autoclavage, puis transférez 125 millilitres dans un flacon. Effectuez un examen visuel de la boîte de gélose afin d'identifier les régions présentant une forte concentration de colonies isolées.À l’aide de la pointe d’une micropipette, pousser doucement et briser l’une des colonies. Plonger ensuite la même pointe dans le flacon de 125 millilitres et mélanger soigneusement afin de s’assurer qu’un nombre suffisant de cellules est transféré. Placer le flacon dans un incubateur agité à 30 degrés Celsius et 150 tr/min pendant deux à trois jours.Pour déterminer un nombre final de cellules, tracez sept lignes parallèles équidistantes et épaisses sur le fond d'une des boîtes de gélose afin qu'elles soient visibles depuis le dessus. Placez trois petites gouttes d'environ dix microlitres de culture non diluée dans un segment. Ajoutez un millilitre de culture non diluée à neuf millilitres de PBS stérilisé pour obtenir une dilution au dixième.Ensuite, déposez trois petites gouttes de la dilution sur un deuxième segment de la plaque. Transférez la culture diluée dans un nouveau flacon, et utilisez du PBS pour effectuer une dilution supplémentaire d'un facteur dix, soit dix à la puissance moins deux. Répétez les opérations d'ensemencement et de dilution jusqu'à obtenir une dilution d'au moins dix à la puissance moins sept, afin de garantir l'obtention de colonies isolées.Incuber la plaque à 31 degrés Celsius pendant un à deux jours avant de compter les colonies dans chaque section de la plaque. Transférer neuf millilitres de la culture liquide préparée dans plusieurs tubes de centrifugation stérilisés de dix millilitres. Préparer 100 millilitres de solution mère de enrichissement externe en utilisant une balance analytique pour peser avec précision deux grammes par litre d'urée, un gramme par litre de chlorure d'ammonium, 212 milligrammes par litre de bicarbonate de sodium et 280 milligrammes par litre de chlorure de calcium.Dans un bécher contenant du milieu frais, mélanger tous les ingrédients sauf l'urée, puis stériliser à l'autoclave. Après la stérilisation, mélanger l'urée avec un millilitre de milieu frais et faire passer la solution à travers une seringue équipée d'un filtre de 0,2 micromètre avant de l'ajouter au milieu d'enrichissement. Ajouter un millilitre du milieu d'enrichissement contenant les additifs dans des tubes à centrifuger stérilisés contenant neuf millilitres du milieu de culture préparé.Vortexez chaque tube et incubez-les dans un incubateur sans agitation à 30 degrés Celsius. Surveillez régulièrement toutes les unités pour détecter le début de la précipitation. Dès que la précipitation est observée à l'œil nu, transférez un petit volume de liquide vers une chambre pour couvre-objet destinée à la microscopie à fort grossissement.Observer initialement à un grossissement de 4X afin d'examiner une vaste zone avant d'augmenter progressivement le grossissement. Réaliser les expériences de coloration et de MEB conformément au protocole décrit. Lorsque S.pasteurii est cultivé selon le protocole illustré dans cette vidéo, les bactéries induisent la précipitation de carbonate de calcium qui s'accumule au fond du tube au fil du temps.Cette figure montre des images en contraste de phase d'une population bactérienne clairement distincte, de forme allongée, présente dans le milieu. On observe ici les lignes de clivage bien définies, caractéristiques de la cristallinité. Ce graphique de spectroscopie de photoélectrons induite par rayons X, obtenu pour le même échantillon, présente des pics correspondant à des groupes carbonates, indiquant la présence de carbonate de calcium.Présenté dans ce panneau, un éponge non traitée qui se comprime facilement sous l'effet d'un poids d'un kilogramme. Lorsqu'une éponge a été immergée pendant sept jours dans une solution précipitante de calcite contenant S. pasteurii, puis séchée, elle s'est rigidifiée et a montré une résistance en compression accrue en raison de l'obstruction des pores par la précipitation de calcite. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si toutes les étapes sont correctement exécutées.Cependant, bien que les étapes individuelles prennent seulement quelques minutes chacune, il existe des périodes d'attente plus longues entre celles-ci, durant lesquelles l'échantillon doit être incubé pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours. Après avoir suivi cette procédure, plusieurs autres techniques, telles que des caractérisations supplémentaires, peuvent être réalisées afin de répondre à d'autres questions, par exemple sur la distribution statistique des formes polymorphes dans le carbonate de calcium. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire et appropriée de la manière de cultiver correctement Sporosarcina pasteurii afin de l'enrichir de façon adéquate pour garantir la précipitation de calcite, ainsi que de la manière d'observer ce processus par microscopie multimodale.N'oubliez pas que le travail avec des autoclaves sous haute pression peut être extrêmement dangereux et que toutes les précautions, telles que la dépressurisation complète de la chambre et le port d'équipements de protection individuelle (EPI), doivent être prises avant de réaliser cette procédure.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Source : Bhaduri, S., et al., Précipitation de calcite induite par des facteurs microbiologiques médiée par Sporosarcina pasteurii. J . Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la méthode d’enrichissement de Sporosarcina pasteurii avec de l’urée et du chlorure de calcium pour déclencher l’activité de l’uréase, conduisant à la formation de cristaux de calcite visibles par précipitation de calcite induite par voie microbiologique, ou MICP.

Précipitation de calcite induite par Sporosarcina pasteurii

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Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par

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